에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화

Biology
 

Summary

심사 양적, 높은 처리량의 표현과 소규모 대장균 문화의 융합 단백질의 분석 정화하기위한 프로토콜을 설명하고 이황화 풍부한 동물 독의 표적 단백질의 발현에 적용됩니다.

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Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli. J. Vis. Exp. (89), e51464, doi:10.3791/51464 (2014).

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Abstract

대장균 (E. 콜라이)는 구조적 및 기능적 연구에 대한 재조합 단백질의 생산에 널리 이용되는 발현 시스템이다. 많은 단백질이 불용성 형태로 표현하기 때문에, 단백질을 정제하는 것은 때때로 도전이다. 어렵거나 여러 대상으로 작업 할 때 그것은 따라서 신속하게 용해 식의 조건을 식별하기 위해 높은 처리량 (HTP) 작은 규모의 단백질 발현 검사 (1-4 ml의 문화)를 사용하는 것이 좋습니다. 실험실의 다양한 구조 유전체학 프로그램 (재조합 단백질의 0.1 ~ 100 ㎎ / L 문화의 범위 내) 양적 HTP 단백질 발현 검사 프로토콜이 단백질의 수천에 구현하고 검증 된 대처하기. 프로토콜은 액체 핸들링 로봇을 이용하여 자동화 된뿐만 아니라 특수 장비없이 수동으로 수행 될 수있다.

이황화 풍부한 독 단백질 얻고있다치료 약물 리드로 자신의 잠재력에 대한 인식을 증가시킨다. 그들은 매우 유력한 선택이 될 수 있지만, 자신의 복잡한 이황화 결합 네트워크는 생산에 도전합니다. FP7 유럽 Venomics 프로젝트 (의 일원으로서 www.venomics.eu ), 우리의 도전은 기능적인 특성에 대한 새로운 독 단백질의 수천을 생산을 목표로 생산 성공 전략을 개발하는 것입니다. 이황화 결합의 이성화 DsbC의 산화 환원 특성에 힘 입어 우리는 E.의 산화, 기능 독 펩타이드의 발현을위한 우리의 HTP의 제작 파이프 라인을 적용 대장균 세포질. 프로토콜은 또한 다양한 디술 풍부한 단백질의 생산에 적용될 수있다. 여기에서 우리는 우리의 파이프 라인은 동물의 독 단백질의 생산에 적용 보여줍니다. 프로토콜이 여기에 설명으로는 수용성 이황화 풍부한 단백질이 일주일에 한 작은 얻을 수 가능성이 높습니다. 비록 작은 스케일에서 회를 사용할 가능성이있다전자 파일럿 연구에서, 또는 민감한 마이크로 분석을위한 특성화, 질량 분석에 의해 산화 상태의 유효성을 검사하는 단백질을 정제.

Introduction

유전체학의 발전과 새로운 단백질의 발견의 빠른 속도에 의해 동기 부여, 높은 처리량의 파이프 라인 검사 및 최적의 단백질 생산 전략의 식별을위한 전통적인 접근 방식을 병렬 처리하기 위해 개발되었습니다. 최적화 될 가능성이 변수는 다른 표정이 대상이 샤페론 14,15 함께 5, 융합 파트너 6-13 공동 발현을 변형, 1,2, 3,4 온도, 미디어 2,3 균주 세포질, 포함 하나 이에 한정되지 않는다 또는 세포질 표현 16-18, 정제 버퍼 구성 요소 3. 배치 별 편차를 제한하면서, 높은 처리 방법, 다양한 변수 또는 여러 표적 높은 수준의 효율성과 병렬로 테스트 할 수있는 구현을 따라. 우리의 경험, 전략은 동일한 문화 (온도, 미디어, 통풍 등), 정제 조건 (같은 집용을 사용하여 규모 확대에 따라 재현성을 제공합니다N, 완충제 등). 여러 높은 처리량 플랫폼, 즉 같은 융합 파트너, 표현의 변종 또는 온도 19 ~ 23 등 다양한 매개 변수를 통해, 수용성 단백질 발현을위한 조건을 식별하기 위해 지난 10 년간 사용되어왔다.

우리는 최근에 용해 이황화 풍부한 단백질 11의 발현에 대한 우리의 높은 처리량 검사 방법을 사용했다. 선택된 단백질은 악의에 찬 소스에서뿐만 아니라이었다, 또한 식물, 돼지, 소와 인간을 포함한 종의 넓은 범위에서 이황화 풍부한 효소 억제제가 포함되어 있습니다. 실험은 12 다른 융합 파트너 및 28 이황화 망상 단백질의 용해도 및 폴딩에 3 개의 다른 발현 균주의 효과를 비교했다. 우리는 스트레인 BL21의 생산을위한 융합 파트너 (DE3)로 DsbC를 사용 pLysS를 크게 outproduced (얻은 수용성 단백질의 수율과 수 모두에서) 긴장과 융합의 다른 조합이 11 테스트 것을 보여 주었다.이 실험의 결과는 이황화 풍부한 표적 발현 더 적합 하나에 (단백질의 넓은 범위의 발현 스크리닝에 사용되었다) 오리지널 일반 높은 처리 파이프 라인 (22, 24)를 적응시키기위한 기초를 형성했다. 동물의 독에서 이황화 풍부한 단백질은 특별한 관심입니다. 독은 약리 및 치료 적으로 잠재적 인 가치로, 생리 활성 펩타이드와 단백질의 복잡한 혼합물이다. 그러나, 이황화 결합을 포함하는 단백질의 발현은 간단하지 않습니다. 이 단백질은 일반적으로 일곱 이황화 결합을 하나 사이에 포함하고 활성화하기 위해 올바른 이황화 결합 패턴과 산화해야합니다. 현재 플랫폼은 FP7 유럽 VENOMICS 프로젝트 (www.venomics.eu)의 일부로 이황화 풍부한 동물 독 많은 단백질의 발현을 심사 및 대상의 수천의 높은 처리량의 표현에 대한 새로운 프로토콜을 벤치마킹하는 데 사용되는 . 여기서, 자동화 된 방법높은 처리량 소규모 발현 검사 및 정화 (그림 1 참조)에 제공된다 이황화 풍부한하는 동물 독 단백질을 적용했다. 이황화 풍부한 펩타이드 및 단백질에 대한 전략은 표적 단백질을 분해 될 HIS-DsbC 융합을 만드는 정화 및 산화 환원 활성 융합 파트너, DsbC위한 HIS 태그를, (그림 2 참조)를 사용합니다.

프로토콜의 초점은 본원 액체 핸들링 로봇과 HTP 전기 영동을 사용하여 자동화 있지만, 이들 방법은 기본 설정과 심지어 연구소 고가의 장비에 대한 전제 조건없이 프로토콜을 활용할 수 있다는 것을 의미 또한 높은 처리량 수동 방식에 적합 . 정제 및 분석 (이황화 풍부한 단백질에 특정하지 않음)로 변환을위한 수동 프로토콜은 다른 곳에서 24 게시 된 여기 반복하지 않는다. 재조합에 의해 생성 된 표현 클론의 수동 절차의 처리량 (,수용성 단백질 수준의 분석에 국가 복제 25) SDS-PAGE 감지) 또는 384 (4 X 96을 사용하여 (96이다 (그림 1 참조)) 주 문화를 점 오점 및 SDS-PAGE (26)를 사용하여. (예 캘리퍼스 GXII LabChip 시스템 (22)과 같이, 액체 핸들링 로봇 (26) 및 도트 블롯 또는 HTP 전기 영동을 사용하여 반자동 방식으로 수행 경우에 증가 될 수있다 여기에 설명 된대로 일주에 병렬로 최대 1,152 (12 × 96) 문화에 대한 결과)의 분석. 일정한 진탕 인큐베이터 충분한 통기 짧은 궤도 고속 진탕 배양기의 사용을 필요로 96 (DW96) 포맷 (진탕 디프 웰에서 성장 배양 달리 사용될 수 있도록 배양은 디프 웰 24 (DW24) 형식으로 수행 800 rpm에서). 자동 유도 매체 (27)의 사용은 또한 수동 유도 단계를 제거 식을 단순화한다. 연구소는 이미 사전 정의 된 표현과 푸리를 사용하는 경우에도문법을 없애는 조건, 이들은 단순히 효율을 향상시키기 위해 본 HTP 시스템으로 직접 전달 될 수있다. 이황화 풍부한 단백질에 대한 높은 처리량 스크리닝 파이프 라인의 상세한 회로도는도 3에 제공된다. 파이프 라인의 파라미터주세요 단백질 생산을위한 가장 유용한 조건을 선택하도록 허용 광범위한 스크리닝 실험 11, 22에 기초하여 선택 하였다.

특성은 샘플의 마이크로 그램 수십 충분한, 또는 민감한 기능 분석 및 결합 분석 (예를 들어, 낮은 볼륨 HTP 패치 클램프 시스템 28)을위한 것입니다 파일럿 연구에서 작은 규모의 표현에서 직접 정제 태그 단백질에서 수행 할 수 있습니다. 동일도 태그와 프로테아제 (역상 HPLC에 의해, 예를 들어) 제거 제공, 벽개 후에 태그가 대상에 수행 될 수있다. 품질 관리도 (예상 크기 및 산화 성을 확인하기 위하여 질량 분석계에 의해 수행 될 수있다ATE) 또는 크로마토 그래피 방법은 () 29 순도 이질성을 확인합니다. 때로는 분열 (특히 난 용성 단백질 30, 31에 대한) 불필요한 또는 바람직하지 않은 태그를, 그래서이 프로토콜의 분열에 선택 사항입니다. 에 관계없이, 모든 구조에 직접 (그림 2 및 토론 참조) 절단 후 기본 단백질을 생산하는 표적 유전자를 이전 TEV 단백질 분해 효소 절단 부위 (ENLYFQ / [G] 32)이있다. 융합 태그의 절단을 원하는 경우, 절단 효율을 분석하기 위해 작은 규모 (용출 분획 또는 '열') 시험 할 수 있으며, 이후의 스케일 업 실험 수율 신뢰성 추정치를 요구하고 구하는 경우의 조건을 최적화한다.

친 화성 정제시 사용하는 구슬의 볼륨에 대한 두 가지 옵션이 실험의 목적과 기대에 따라이 있습니다. (파일럿 또는 MS 분석을 위해 정제 또는 extrapol 극력 단백질을 포착 할 수있는) 스케일 업 수율 먹은 수지의 200 μL의 최종 볼륨이 시스템의 포화 전에 ~ 100 ㎎ / L 문화의 범위에서 가용성 단백질의 검출을 허용, 사용되어야한다) 제 8.1 (프로토콜 (A 참조) . 실험의 목적은 수용성 단백질의 낮은 양의 검출 된 경우에는, 그 후에 수지의 50 μL의 최종 부피는 (B (프로토콜 참조 0.1-25 ㎎ / L 배양의 범위에서 가용성 단백질의 검출을 가능하게 적합 ) 8.2 절에).

필요한 경우 생산 수용성 발현을 확인 조건을 사용하여 더 구조 및 기능 연구에 정제 대상 밀리그램 수량을 얻기 위해, 확장 할 수 있습니다. AFMB에서 사용 스케일 업 프로토콜의 세부 사항은 다른 곳에서 (22, 24) 논의되었다.

실험 설정, 프로토콜 내에서 중요한 단계에 관련된 더 자세한 사항은, 수정 및 문제 해결 및 기술의 한계는 디스크에 제공된다ussion. 실험을 시작하기 전에 설명을 읽어 보시기 바랍니다.

우리는 각 단계에서 90 %의 성공률을 기대할 프로토콜 걸쳐 (예를 들어, 문화의 적어도 90 %는 임의의 소정 단계에 성장한다). 실험의 모든 단계의 성공율이 90 % 아래로 떨어지면 샘플은 폐기되고, 실험은 구조물의 전체 컬렉션에 대해 반복된다. 이것은 시험 단백질에 매우 의존적 일 것이다 그러나이 성공률 등 수용성 단백질 또는 100 %의 효율로 절단 구조의 비율을 표현하는 구문의 수에 적용 할 수 없다.

로봇의 작업 테이블의 셋업에 대한 특정 세부 사항은 다른 작업대 셋업에 필요한 그러나 그들이 적용 할 수있다, (또한 그림 4 참조) 각 프로토콜에 제공됩니다. 로봇 하드웨어 (테칸)는 96 채널 팔 (MCA96), 로봇 매니퓰레이터 (로마) 및 8 채널 액체 처리 헤드 (구성LIHA). MCA96를 사용하는 모든 단계는 LIHA이 단계 사이에 세척 할 필요가 있기 때문에 그들이 오래 걸릴 것이다 MCA96를 사용할 수없는 경우 LIHA를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 로봇이 기술적으로 무균 환경은 아니지만, 항생제를 포함하는 것이 일반적으로 오염이나 불임에 문제가되지 않도록합니다.

Protocol

파트 A : 변환 및 테스트 식

복제 (22)와 정화에 변환을위한 수동 절차는 다른 (24)에 대해 설명합니다. 변환 프로토콜은 완전히 로봇 (26)에서 수행 할 수 있지만, 일반적으로 더 효율적인 수동으로 할 수 있습니다. 따라서 프로토콜이 여기에 믹스가 수동으로 열 충격 변형에서 표현 precultures와 변환의 도금의 접종부터 시작합니다. 수동 복제 및 변환 절차에 대한 자세한 내용은 해당 참조 (22, 24)을 참조하십시오.

1. Precultures 및 도금

  1. : 로봇의 작업 테이블 (위치에 대한 그림 4 참조)를 준비
    1. 150 ㎖의 멸균 LB 브로스 함유 된 300 ㎖ 넣어 트로프 (암피실린 (100 ㎍ / ml)로 보충을 / 클로람페니콜 (34 ㎍ / ㎖), 또는 다른 적절한 항생제) 위치에서 8.
    2. 멸균 DW에게 넣어위치 11에서 96. 위치 14-17에서 그들의 뚜껑 배 사전 준비 24 웰 LB 한천 (앰프 / CAM) 조직 배양 접시 (각 웰에 2 ㎖ 한천을 포함)을 넣습니다.
    3. 위치 (13)에서 (96 변환 heatshock 후 혼합 포함) 변환 플레이트를 넣습니다.이 액체 precultures와 LB 한천 플레이트를 접종하는 데 사용됩니다. 위치 (18)에서 멸균 200 μL 피펫 팁 상자를 넣습니다.
  2. 각 1 ㎖ LB의 국물의 최종 부피가 잘있을 때까지 96 - 멀티 암 (MCA96) 200 μL 팁, 대기음 LB의 국물 (위치 ​​8) 200 μl를 사용하여, 위치 (11)에 DW96로 분배. 반복 DW96. 이 액체 예비 배양 될 것이다.
  3. 로봇 매니퓰레이터 (로마)를 사용하여, 제 24 웰 LB 한천 플레이트의 뚜껑을 제거하고 도금이 그 판에 완료 될 때까지 (호텔 캐리어의 예를 들어) 다른 곳에 배치합니다.
  4. (LIHA) 머리를 처리하는 8 채널의 액체를 사용하여 T의 다음 대기음 50 μl를 혼합위치 13에서 변환 믹스의 그 첫 번째 열은. 변환 믹스의 볼륨이 잘 LB 한천을 커버하기에 충분하다.
  5. (도 5에 도시 된 바와 같이) 제 4 채널이, 위치 (14)에서 제 24 웰 LB 한천 플레이트의 첫번째 칼럼에 분배.
  6. 마지막으로 채널 4, 제 24 웰 LB 한천 플레이트의 제 칼럼에 분배.
  7. 철저하게 분배 한 후 모든 팁을 씻으십시오.
  8. 24 웰 그림 5에서 제공하는 방식을 사용하여 - 모든 변환이 96에서 전송, 위치 (14)에서 첫 번째 접시에 도금 할 때까지이 과정을 계속합니다.
  9. 제 1 판이 완료되면, 뚜껑을 교체하고 위치 15에서 다음 판에서 뚜껑을 제거하기 위해 로마를 사용합니다. 다음 3 판의 도금 방식을 사용하여 계속합니다.
  10. 도금이 완료되면, 1,200 rpm으로 테 동요를 설정하고 변환 혼합의 균일 한 분포를 가지고 1 분에 대한 모든 판을 흔들어. MCA96 원래 피펫 팁을 사용, 나머지 변환 혼합 (위치 ​​13)의 다음 대기음 60 μl를 혼합 및 위치 (11)에 LB 배양액을 포함하는 DW96로 분배.
  11. 문화 폭기 할 수 있도록 통기성 접착제 필름 DW96의 precultures를 밀봉.
  12. 최대 속도 O / N (800분의 200 rpm으로 진탕에 따라 다름)에서 ​​37 ° C에서 떨고 인큐베이터에있는 장소.
  13. LB 아가 플레이트가 건조 될 때까지 (10 분) 떨어져 그들의 뚜껑 후드에 배치되어야한다. 그리고 그들은 다음 아침까지 37 ° C 플레이트 배양기에서 반전 배치됩니다.
  14. 다음날, 예비 배양은 자동 유도 매체와 글리세롤 주식의 준비를위한 시험 식을 접종하는 데 사용됩니다. 백 업으로, 냉장고에 한천 플레이트를 넣습니다. 필요하면, 한천 플레이트 또는 글리세롤 재고품부터, 테스트 식 직접 신선한 LB의 전 배양액을 접종하여 다시 수행 될 수있다.

DW24 ZYP 2. 준비-5052 판

참고 :이 절차는 4 배 DW24 플레이트의 각 세트에 대해 완료하는 데 약 5 분 소요됩니다.

  1. 각 구성 요소에 대한 조리법이있다 - 96 문화 (464 ㎖의 ZY 매체, 250 μL 2 M 망초, 10 ㎖를 50 배 (5052), 25 ㎖의 20 배의 NPS는 순서대로 각각의 복제에 대 한 500 ㎖의 ZYP-5052 자동 유도 매체를 구성하는 ) 표 1에 적합한 항생제로 보충.
  2. 로봇의 작업 테이블을 준비한다 :
    1. 위치 5와 6시에 두 개의 300 ㎖의 골 ~ 250 ㎖의 매체를 포함하는 각을 넣어. 위치 14-17 4 개의 멸균 DW24 플레이트를 넣습니다. 위치 18에서 200 μL 팁을 넣습니다.
  3. MCA96를 사용하여 200 μL 팁, 대기음 200 위치 5에서 ZYP-5052의 μL 및 위치 (14)에서 첫 번째 DW24 판에 분배가.이 작업을 수행하면 5 배 (4 팁의 총 총 한 번에 하나의 우물에 분배합니다 4 ML의). 위치에 남아있는 3 개의 x DW24 판을 반복 15-17, SWIT지난 DW24 플레이트 위치 6에서 ZYP-5052에 칭.

테스트 식 문화의 3. 접종 및 성장

참고 : 예방 접종은 4 배 DW24 플레이트의 각 세트에 대해 완료하는 데 약 10 분 소요되며, 성장은 O / N. 계속

  1. 로봇의 작업 테이블을 준비한다 :
    1. 위치 (11)에서 (단계 1.15부터) precultures를 포함하는 DW96 플레이트를 넣습니다. 위치 14-17에서 (단계 2.3) ZYP-5052 매체를 포함하는 네 개의 DW24 플레이트를 넣습니다.
  2. 그림 5에서 제공하는 방식을 사용하여 테스트 식 문화 (40분의 1 희석)을 접종 LIHA 대기음 위치 (11)로부터 예비 배양 100 μl를 사용. 96 - 웰 precultures의 각 열 사이의 세척 역에 철저하게 LIHA 머리를 씻으십시오.
  3. 통기성 필름과 DW24 판을 밀봉하고 4 시간 동안 (400분의 200 분당 회전 수)을 흔들어으로 37 ° C에서 알을 품다. 이 중에 성장기의 시간이다 glucos매체에서 전자는 우선적으로 27 고갈 될 것입니다.
  4. 17 ° C로 온도를 감소 4 시간과 포도당의 고갈 후, 유당이 작품 22, BL21 (DE3) pLysS를 또는 로제 2 (DE3) pLysS를위한 최적의 성장 조건을 제공하는 식의 유도 선도 물질 대사로 변화되기 시작합니다. O / N.을 표현하는 세포 남기기 글리세롤 주식을 만들기 위해 나머지 예비 배양을 사용합니다.

글리세롤 주식의 4. 준비

참고 : 글리세롤 주식은 냉동실 실패의 경우에 서로 다른 위치에 저장하는 삼중으로해야한다.

  1. 로봇의 작업 테이블을 준비한다 :
    1. 글리세롤 주식을 집에 7 위치 5에서 마이크로 플레이트를 넣습니다. 위치 8에서 100 % 글리세롤 50 ㎖로 채워 300 ㎖의 골을 넣습니다. 위치 (11)에서 각 웰에 (단계 3.2 이후) 예비 배양 800 μl를 포함하는 DW96를 넣습니다. 위치 18에서 200 μL 팁을 넣습니다.
  2. SLO를 사용하여W 흡입 및 토출 속도, precultures를 포함하는 DW96에 글리세롤을 추가 MCA96 200 ㎕의 팁을 사용합니다.
    1. 글리세롤의 대기음 200 μL (위치에서 8).
    2. (위치 (11)에서) 150 μl를 분배 제, 다음 나머지 글리세롤은 팁의 바닥에 도달 할 수 있도록 20 초 동안 정지. 나머지 50 μl를 분배.
  3. 그들은 완전히 혼합 될 때까지 같은 팁을 사용하여, 위치 (11)에 DW96의 문화와 글리세린을 섞는다. 글리세롤의 최종 농도는 20 %이다. 대기음 140 DW96에서 μL 및 위치 5에서 첫 번째 마이크로 플레이트에 분배.
  4. 나머지 각 마이크로 플레이트에 4.3 단계를 반복합니다 (위치 ​​6 및 7).
  5. -80 ° C에서 플라스틱 접착 테이프 및 저장소와 각 마이크로 플레이트를 밀봉 처분 전에 항균제로 오염을 제거, DW96에 남아있는 문화를 폐기하십시오.

5. 문화의 성장을 평가

600로 최종 성장률을 평가하는 것이 필요하지 않습니다, 그러나 성장하지 않는 문화가 주목해야한다 (이러한 조건에서 12 정도) 대부분의 문화권에 대해 일반적으로 동일합니다.

  1. (단계 3.4) 각 문화의 50 μl를 가지고 매체 150 μl를 포함하는 평면 바닥, 명확한 마이크로 플레이트에 분배.
  2. 계정에 4 배 희석을 고려하여 OD 600을 측정합니다. 잘 성장하지 않았다라도있을 경우, 최종 분석이주지.

6. 세포를 수확

참고 :이 절차는 완료하는 데 약 45 분 소요됩니다.

  1. 10 분 3,000 XG에서 (단계 3.4) 배 DW24 판을 원심 분리 한 후 항균제가 포함 된 폐기물 용기에 상층 액을 버린다. 초과 매체를 제거하는 플레이트, 거꾸로, 흡수를 용지에를 누릅니다.
  2. 한편, 용해를 100 ㎖를 준비완충액 (50 mM 트리스, 300 mM의 염화나트륨, 10 mM의 이미 다졸의 pH 8, 또는 다른 바람직한 완충액) 라이소자임 (최종 농도는 0.25 ㎎ / ㎖)을 함유.
  3. 로봇의 작업 테이블을 준비한다 :
    1. 위치 5에서 300 ㎖의 저점에 용해 버퍼를 넣습니다. 위치 11에서 깨끗한 DW96를 넣습니다. 위치 14 ~ 17 년 (단계 6.1에서) 세포 펠렛을 포함하는 4 개의 x DW24 플레이트를 넣습니다. 위치 18에서 200 μL 팁을 넣습니다.
  4. MCA96 200 μL 팁, 대기음 위치 5에서 용해 버퍼 125 μl를 사용하고 (위치 ​​14-17) 각 DW24 판에 분배. 반복합니다. 참고 : 4 팁 DW24 플레이트의 각 웰에 1 ㎖의 최종 부피에 대해 한 번에 하나의 우물에 분배됩니다.
  5. 펠렛을 재현 탁하는 15 분 동안 테 흔들 (1,000 RPM)를 사용하여 위치 14-17에서 판을 흔들어.
  6. 펠릿을 재현 탁되면, 1 (위치 ​​(14)에서 제 DW24의 첫 번째 열 내지 4) 후, L을 사용하여 샘​​플에서 550 μl를 흡인하는 LIHA의 제 4 채널을 사용LIHA 대기음의 AST 4 채널 샘플 550 ㎕의 5 (첫 번째 DW24의 두 번째 열) 8. 위치 11에서 DW96의 첫 번째 행에 분배합니다.
  7. 세포 현탁액 전부는 DW96로 전송되도록, 단계 6.6를 반복한다.
  8. 각각의 샘플 세트는 세정제에 LIHA 팁을 세척 한 후.
  9. 반복 그림 5에서 제공하는 방식을 사용하여 각 DW24 플레이트의 각 열 (위치 15 ~ 17) 6.8 6.6 단계를 반복합니다. 플라스틱 필름으로 밀봉.
  10. 같은 날 또는 단기 동결, 1 시간의 최소 -80 ° C에서 저장소에 정제 달리 -20 ℃에서 보관

파트 B : 정제 및 분석

7. 세포 용해

참고 :이 절차를 완료하는 데 약 60 분 소요됩니다.

  1. 대한 떨고 인큐베이터에서 약 15 분,에 resuspend의 물 (RT에서 37 ° C) 목욕 (단계 6.10부터) 냉동 세포 현탁액을 해동10 분 dditional. 문화는 점성이 될 것이다.
  2. DNA 분해 효소 주식 500 μl를 타고 망초 주식 1 ㎖와 혼합. 수동으로 13 - 채널 피펫 또는 로봇 LIHA와 DNase를 10 μg / ㎖, 20 mM의 MgSO4로의 최종 농도를 제공하기 위해, DW96의 각 웰에 15 μl를 분배.
  3. 플라스틱 테이프로 판을 다시는 - 밀봉 추가 15 분 동안 흔들어. 이 시점에서 문화는 비 점성해야한다. 모든 문화가 더 이상 점성 것을 (육안 검사에 의해) 잘 확인하지 않습니다. 주 : 일부 문화가 샘플 및 오버 플로우 또는 총 막힘 고르지 압력을 생성, 여전히 (DNA 분해 효소가 실수로 일부 우물에 적절하게 분배 잊어되지 않은 경우, 예를 들면), 필터가 막히게됩니다 점성 경우에 중요하다 필터 판을 정화하는 동안 발생할 수 있습니다.
  4. 전체 세포 용 해물, 대기음 10 ㎕의 용 해물을 함유하고 96 - 웰 PCR 플레이트에 분주의 SDS-PAGE 샘플의4X SDS-PAGE 샘플 완충액 10 μL, 물 20 μL. 95 ° C에서 3 분간 변성 및 분석 (전체 부분)까지 동결. HTP 전기 영동 시스템을 사용할 수있는 경우, 샘플이 대신 샘플 준비에 대한 제조자의 권장 프로토콜에 따라 분석 될 수있다. 샘플의 분석에 대한 자세한 내용은 10 장을 참조하십시오.

8. 니켈 친화력 정화

참고 : 느린 흡입 속도가 모두 수지 현탁액을 피펫 팅을 위해 사용되어야한다, 현탁액은 아주 두꺼운으로. 이상 건조 수지는 바인딩 용량의 감소가 발생합니다. 정제를 위해, 특정 이미 다졸 농도는 니켈 친 화성 수지에 적용 가능하다. 대안 이온 (예를 들면, 코발트)가 사용되는 경우, 농도는 적절하게 조정되어야한다.

  1. - 1 ~ 100 ㎎ / L의 범위에서 검출 니켈 선호도 정화 (최종 수지의 부피 = 200 μL)
    참고 : T자신의 정화 절차는 최대 4가 하루 만에 수행 할 수 있다는 것을 의미 완료하는 데 약 1.5 시간이 걸립니다.
    1. 로봇의 작업 테이블을 준비한다 :
      1. 결합 완충액 (50 mM 트리스, 300 mM의 염화나트륨, 10 mM의 이미 다졸의 pH 8), 세척 완충액 (50 mM 트리스, 300 mM의 염화나트륨, 50 mM의 이미 다졸의 pH 8) 및 용출 완충액 (50 mM 트리스, 300 mM의를 함유하는 300 ml의 골을 넣고 위치에서의 NaCl, 250 mM의 이미 다졸의 pH 8) 6 ~ 8, 각각.
      2. 수지 슬러리 위치 5에서 빈 300 ml의 구유를 남겨주세요. 위치 9, 10 넣어 판 소지자. 위치 10에서 상단의 SPE 블록 및 필터 / 수신기 판 (20 μm의)와 DW96을 넣어.
      3. 위치 (14)에서 (단계 7.3) 해물을 포함하는 DW96를 넣습니다. 위치 (18, 19)에 각각 200 ㎕의 넓은 구멍 팁 및 200 ㎕의 팁을 넣어. 호텔의 세척 및 용출 두 예비 DW96 플레이트를 넣습니다. 주 : 호텔 사용할 수없는 경우 그들은 또한 작업 테이블에 다른 사이트에 넣을 수 있습니다.
    2. 준비 105평형화 33 % 수지 슬러리 ㎖ (35 ㎖의 수지 + 결합 완충액 70 ㎖). 즉시 절차를 시작하기 전에 위치 5에서 저점에 수지 서스펜션을 추가합니다.
    3. MCA96 200 ㎕의 넓은 구멍 팁 (위치 ​​18)를 사용하여, 철저하게 위치 14에 해물을 포함하는 DW96에 수지 슬러리 200 μl를 흡입 및 분배하기 전에 위치 5에서 수지 슬러리를 혼합. 두 번 반복되도록 수지 슬러리의 600 μL 각 흡인하기 전에 수지 현탁액을 혼합, 용해 액에 추가되었습니다.
    4. 결합을 허용하고 펠렛에서 수지를 방지하는 위치 (14)에서 MCA96을 이용한 10 분 혼합 단계를 수행한다.
    5. 대기음은 위치 (14)와 각각의 열망 전에 혼합, 위치 9시 필터 판에 (200 μL 많이있는) 800 μl를 분배에서 그렇지 않으면 수지는 DW96의 맨 아래에 유지됩니다.
    6. 으로 판을 통해 해물을 필터링하는 약 90 초 동안 위치 (10)에서의 진공을 켭니다DW96 수지를 건조하지 않도록주의하면서 흐름을 통해 수집합니다. 진공을 해제합니다.
    7. 수지의 모든 필터 플레이트에 다음 있도록 반복 8.1.5와 8.1.6 단계를 반복합니다.
    8. 로마 팔이 다음 세척 단계는 폐기물에 직접 들어가도록 9 위치를 위치 (10) 필터 접시를 들고 SPE 블록을 이동하고 호텔로, 다른 사이트 (예 :에 위치 (10)에 흐름을 통해이 포함 된 DW96를 전송하여 절차의 종료까지 캐리어).
    9. (위치 19에서) 200 μL 팁의 새로운 세트로, (위치 ​​6에서) 바인딩 버퍼 800 μL의 총 (9 번 위치) 수지를 씻어 버퍼가 통과 할 때까지 위치 9에서 진공을 적용 . 한 번 더 반복합니다.
    10. 50 mM의 이미 다졸 세척을 수집하고 (위치 ​​10) 위로의 SPE 블록 및 필터 플레이트를 이동 위치 (10)에 신선한 DW96을 배치 로마 팔을 사용합니다.
    11. 위치 (10)에 위치 7에서 세척 버퍼 800 μl를 추가, 설정버퍼가 통과 할 때까지의 진공. 진공 해제를 전환합니다.
    12. ROMA으로, SPE 블록 및 필터 플레이트 (9)를 배치하고 호텔로 세​​척 샘플을 포함하는 DW96를 제거하고 절차가 끝날 때까지 따로 보관.
    13. 버퍼가 통과 될 때까지 (위치 ​​(9)에 위치 7) 세척 버퍼의 또 다른 800 μL와 수지를 세척, 진공을 적용합니다. 한 번 더 반복합니다.
    14. 위치 10에 신선한 DW96을 배치하고 용출를 수집하는 위로의 SPE 블록 및 필터 플레이트를 배치 로마를 사용합니다.
    15. (위치 (9)에 위치 8) 용출 버퍼 500 μL의 총을 첨가하고 3 분 동안 현장에서 품어. 모든 버퍼가 통과 될 때까지 진공을 켭니다.
    16. 옵션은 : 높은 단백질을 표현하는, 제 용출 단계 8.1.14 및 8.1.15 같이 신선한 DW96로 수행 될 수있다.
    17. 의 샘플을 채취 흐름을 통해, SDS-PAGE 또는 HTP 전기에 대한 세척 및 용출 / s의.
      1. HTP 전기의 샘플은 제조 업체의 지침을 따르십시오. 샘플의 분석에 대한 자세한 내용은 10 장을 참조하십시오.
  2. B - 0.1 ~ 25 ㎎ / L의 범위에서 검출 니켈 선호도 정화 (최종 수지 양 = 50 μL)
    참고 :이 정화 절차는 최대 12 하루에 수행 할 수 있다는 것을 의미 완료하는 데 약 30 분 소요됩니다.
    1. 로봇의 작업 테이블을 준비한다 :
      1. (50 mM 트리스, 300 mM의 염화나트륨, 10 mM의 이미 다졸의 pH 8), (50 mM의 이미 다졸의 pH가 8을 300 mM의 염화나트륨을 50 mM 트리스)를 버퍼 흘려 결합 완충액을 함유하는 300 ㎖의 골을 넣고각각의 용출 완충액 (50 mM 트리스, 300 mM의 NaCl을 250 mM의 이미 다졸의 pH 8) 위치에 6-8.
      2. 수지 슬러리 위치 5에서 빈 300 ml의 구유를 남겨주세요. 위치 9, 10 넣어 판 소지자. 위치 10에서 상단의 SPE 블록 및 필터 / 수신기 판 (20 μm의)와 DW96을 넣어.
      3. 위치 18에서. 위치 (14)에서 (단계 7.3) 해물을 포함하는 DW96를 넣고 19은 각각 200 ㎕의 넓은 구멍 팁 및 200 ㎕의 팁을 넣어. 호텔의 용출에 대한 예비 96 - 웰 마이크로 플레이트를 넣습니다. 참고 :이 또한 호텔 사용할 수없는 경우는 작업 테이블에 다른 사이트에 넣을 수 있습니다.
    2. 평형을 25 % 수지 슬러리 (12.5 ㎖의 수지 + 37.5 ㎖를 결합 완충액) 50 ㎖를 준비합니다. 즉시 절차를 시작하기 전에 위치 5에서 저점에 수지 서스펜션을 추가합니다.
    3. MCA96 200 ㎕의 넓은 구멍 팁 (위치 ​​18)를 사용하여, 철저하게 흡입 및 dispe 전에 위치 5에서 수지 슬러리를 혼합위치 (14)에 용 해물을 함유 DW96로 수지 슬러리의 200 μl를 nsing.
    4. 바인딩 할 수 있도록 10 분 동안 1,400 rpm에서 테 동요를 사용하여 진탕, 실온에서 품어.
    5. 대기음은 위치 (14)과 위치 (10)의 필터 플레이트에 넓은 구멍 팁 (위치 ​​18)를 사용하여 전체 1,200 μL (200 μL 많이있는)을 분배. 각 흡인하기 전에 혼합에서 그렇지 않으면 수지는 DW96의 맨 아래에 유지됩니다.
    6. 수집 DW96로 판을 통해 해물을 필터링하는 약 30 초 동안 위치 (10)에서의 진공을 돌려 흐름을 통해, 수지를 건조되지 않도록주의. 진공을 해제합니다.
    7. 로마 아암을 사용으로, 다음 세척 단계가 폐기물로 직접 이동되도록 구 위치 및 흐름을 통해 위치 (10)에서 다른 위치 (예 : 행을 포함 DW96를 전송하는 위치 (10)로부터 필터 플레이트를 들고 SPE 블록을 이동 호텔 캐리어) 절차의 종료까지.
    8. 200 μ와(위치 19에서) L 팁 (위치 ​​6) 바인딩 버퍼 800 μL의 총 (9 번 위치) 수지를 씻어 버퍼가 통과 할 때까지 위치 9에서 진공을 적용합니다. 반복합니다.
    9. 50 mM의 이미 다졸 세척을 수집하고 (위치 ​​10) 위로의 SPE 블록 및 필터 플레이트를 이동하는 위치 10에 신선한 DW96을 배치 로마 팔을 사용합니다.
    10. 위치 (10)에 위치 7에서 세척 버퍼 150 μl를 추가 버퍼가 통과 할 때까지의 진공을 켜십시오. 진공 해제를 전환합니다.
    11. ROMA 9의 위치를​​ SPE 블록 및 필터 플레이트를 제거하고 호텔로 세​​척 샘플을 포함하는 DW96, 그리고 절차가 끝날 때까지 따로 보관.
    12. 버퍼가 통과 될 때까지 (위치 ​​(9)에 위치 7) 세척 버퍼의 또 다른 800 μL와 수지를 세척, 진공을 적용합니다. 반복합니다.
    13. 위치 9에서 마이크로 플레이트를 배치 로마를 사용하여 일을 수집하는 위로의 SPE 블록 및 필터 플레이트를 배치전자 용출.
    14. (위치 (9)에 위치 8) 용출 버퍼 190 μl를 추가하고 3 분 동안 현장에서 품어. 모든 버퍼가 통과 될 때까지 진공을 적용합니다.
    15. SDS-PAGE 또는 HTP 전기의 흐름을 통해, 세척 및 용출의 샘플을 채취.
      1. 관류의 SDS-PAGE 샘플 들어 4X SDS-PAGE 샘플 완충액 10 μL, 물 20 ㎕를 함유하는 96 - 웰 PCR 플레이트에 10 μL 분주. 세척 및 용출의 SDS-PAGE 샘플의 / s의 4 배 SDS-PAGE 샘플 버퍼의 10 μl를 포함하는 PCR 플레이트에 30 μl를 분배. 95 ° C에서 3 분간 변성 및 분석 할 때까지 동결.
      2. HTP 전기의 샘플은 제조 업체의 지침을 따르십시오. 샘플의 분석에 대한 자세한 내용은 10 장을 참조하십시오.

9. 태그 분열 (선택 사항)

  1. 단계 8.1.15 (8에서 용출 된 단백질 (에 TEV 단백질 분해 효소 (2 ㎎ / ㎖)를 추가합니다.1 / 10의 비율 1.16) 또는 단계 8.2.14) (v / v).
  2. RT (또는 온도에 민감한 단백질 4 ° C) 부드러운 흔들림와 O / N을 품다.
  3. 분열의 끝에서 10 배 SDS-PAGE 샘플 버퍼의 μL 또는 HTP 전기 샘플에 대한 제조업체의 지침에 따라 포함 된 PCR 플레이트에 30 μl를 분배.
  4. 96 - 웰 0.22 μm의 필터 플레이트를 통해 (단계 9.2에서) 나머지 절단 혼합물을 여과하고, 수집 가용 흐름을 통해 DW96에서 진공을 적용하여. 이 섹션 8.1 및 8.2에서 용출 단계 같이 액체 핸들링 로봇 진공 사이트 중 하나 (예를 들어, 위치 (10))에서 수행 될 수있다. 이 분열하는 동안 침전하는 단백질을 제거합니다.
  5. 여과 후, 4 배 SDS-PAGE 샘플 버퍼의 10 μl를 포함하는 PCR 플레이트에 30 μl를 분배 또는 HTP 전기 샘플로 준비하고 있습니다. 이를 통해 절단 전의 단백질의 비교, 절단 및 졸 후, 혼합물uble 단백질은 절단 후 남은 이후의 스케일 업 실험에서 예상되는 결과의 좋은 표시를 제공합니다. 샘플의 분석에 대한 자세한 내용은 10 장을 참조하십시오.

결과의 10. 분석

  1. SDS-PAGE 등 캘리퍼스 LabChip 같은 점 오점 또는 HTP 전기 시스템의 정화 샘플을 분석하여 수용성 단백질을 발현하는 구조를 확인합니다.
    1. 수용성 단백질을 생산하는 구조를 식별하기 위해 먼저 용출 샘플을 분석합니다. 수용성 구문이 확인되면 대부분의 경우에만 용출 샘플은 분석에 소요되는 시간을 최소화하기 위해 분석된다.
    2. 단백질 용출에없는 경우, 표현하고 수지에 제대로 결합되지 않은 경우에 세척 및 흐름을 통해 샘플을 볼 수 실행.
    3. 더 수용성 단백질은 단백질이 발현 있는지 확인하기 위해 실행 전체의 세포 용 해물을 감지 할 수 없습니다 구축합니다.
      참고 : 여기에 한 가지 제한은 그 경우 P또한 rotein 위에서 배경 발현 수준을 제시되지 않고, 그 단백질을 보는 것이 가능하지 않을 수도 있으며 위음성으로 이어질 수있다. 그것은 단백질 스틱과 친 화성 수지에 침전이 거짓 부정 또는 과소 추정 권장 프로토콜 (이 작품의 드문 경우)를 사용하여 수율 이어질 수하는 것이 항상 가능하다는 것을 주목해야합니다. 단백질 (백색 펠릿 몇 분 / 시간 용출 후에 표시) 용출시 침전 경우 그것은 버퍼 조성물 (예를 들면, 식염 농도)를 변경 및 / 또는 최적화하기 위해 시차 주사 fluorimetry 분석을 수행하도록 권장 버퍼. 수지의 작은 샘플은 SDS-PAGE 샘플 완충액과 단백질이 수지 상에 유지되고 있는지 감지하는 비등 될 수있다.
    4. 단백질은 발현되지되었지만 OD 600 자라지과 문화를 다시 분석 충분되지 않은 경우 세포 성장의 새로운 표현 전략을 추구, 또는 않은 경우. >
    5. 절단 샘플을 분석 할 경우에 각각의 구문이 분석을 단순화하기 위해, 절단하기 전에 인접 차선에서 벽개 후에 도시 될 수 있도록, 그들은, 사이드 바이 사이드 방식으로 분석해야한다.
  2. 용출 농도의 직접적인 정량을주는 방법을 사용하지 않는 한, 정량화 280 NM (A280)에서의 흡광도를 측정하여 양성 샘플에 대해 수행되어야한다.
    1. 높은 발현 가용성 구조를 식별하기 위해 단백질 수율의 추정치를 제공하기 위해, 고려 단백질의 공동 효율적인 소멸 복용 안함로 용출 완충액을 사용하여, A280를 측정한다.
    2. 용해 수율의 가장 신뢰할 수있는 비교를 위해, 그것은 5 절에서 찍은 (OD 600 측정을 사용하여) 문화의 밀도에 의해 금리를 정상화하는 것이 좋습니다. 모든 문화는 거의 같은 밀도가 증가하는 경우, 정규화는 아니다 이 필요합니다.
전자 "> 11. 품질 관리

  1. 시료는 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석기 (LC / MS)에 의한 용출이나 절단 샘플로부터 직접 분석 할 수있다.
  2. 또한, ZipTip 피펫 팁 또는 액체 크로마토 그래피 방법을 사용하여 (이미 다졸과 혹시있을 수있는 버퍼 염을 제거하는) 최초의 탈염, 다음 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 (MALDI-TOF) 또는 전기 분무 이온화 (사용 분석 ESI) 질량 분석법.
  3. 소량 기능적 연구는 예상대로 단백질의 기능이 있는지 확인하기 위해 수행 될 수있다. 큰 금액이 기능을 위해 필요한 경우, 스케일 업 문화가 만들어 질 수 있고, 더 큰 문화 크기와 산화 상태에서 한 번 테스트 기능은 작은 규모에서 확인되었다.

Representative Results

대표 결과 VENOMICS 파이프 라인 96 이황화 풍부한 단백질의 발현 검사는 그림 6에 나타나있다. 단백질은 다음 잔류 수를 증가 이황화 결합의 증가로 배치되어있다. 펩티드는 HIS 태그와 DsbC 융합 파트너와 세포질에서 발현되었다. 추천하는 배양 조건을 사용하는 경우, (12)의 OD (600)은 일반적으로 달성된다. 펩티드 니켈 친 화성 수지의 50 μL의 최종 부피로 8.2-프로토콜 B를 사용하여 정제하고, 이렇게 ~ 25 ㎎ / L 융합 단백질의 최대는이 실험에서 검출 될 수있다.

도 6a는 캘리퍼스 LabChip 시스템 (절단 전에 융해를 나타내는) 및 융합 단백질 ㎎ / L 배양에서 수득 외삽에 근거 채점 시스템 (0.1-2 ㎎ / L 문화 수준에서, 2 행에서 전기 영동 결과를 나타낸다 10 ㎎ / L 문화, 10 25 ㎎ / L의 문화와 더 T가 검출.) 예상대로 절단 DsbC 태그는 일반적으로 오히려 27 kDa의 것보다 약 32 kDa의에서 실행합니다. 마찬가지로, DsbC 융합은 예상보다 높은 약 5 kDa의를 실행합니다. 대상의 많은 우리는 그대로 융합 (상위 대역)을 참조하십시오뿐만 아니라, 융합 파트너는 혼자 (낮은 대역). 이러한 대상의 일부에 대한 배양 조건을 최적화하는 것은 단독 DsbC 최종 수율 증가를 허용 비교 그대로 융합 (상측 대역)의 비율을 향상시킬 수있다. 스코어링은 그대로 융합 수준에 기초한다. 16 96 중 단백질의 융합 수준에서 감지 할 수 없습니다. 이 83 %의 전반적인 성공의 수준에 해당합니다. 감지 할 수있는 80 단백질이 45 2 ㎎ / L의 문화 (56 %)보다 높은 수준에서 검출되었다. (이 예에서 프로토콜 8.2 B ~ 25 ㎎ / L 융합 단백질의 최대 검출 할 수를 사용하더라도) 타겟과의 융합에 따라, 단백질 수율은 2-100 ㎎ / L 배양의 범위에서 일반적이다.

t "> 현재 이황화 결합의 수 (그림 (b) 참조)에 의해 성공의 분석은 가장 낮은 성공 수준이 6 이황을 포함하는 대상에 대해 66 %되는, (1과 7 사이) 테스트 이황화 결합의 모든 숫자에 대한 합리적인 성공을 보여줍니다 채권. 등전점 및 잔기의 수 (도 6c에 도시 됨)에 기초하여 식 성공의 분포의 분석은 모두 성공적으로 표현 대상 및 플롯에 걸쳐 흩어져 검출되지 않았다 대상으로, 그 기술에 대한 특정한 바이어스를 보여주지 않는다.

도 6d는 DTT와 함께 샘플의 환원 전후, 단일 목표에 대한 전기 분무 이온화 질량 분석 (ESI-MS)로부터 얻어지는 질량 분석 결과의 예를 나타낸다. 일반적으로, 이러한 소모적 질량 분광법 분석 그러나 철저한 demonstratio의 목적으로, (a 감소 시료를 분석 할 필요가없는 것)을 수행 할 필요가 없을 것N 우리는 결과를 모두 보여 주었다. 표시 대상은 4 이황화 결합과 5.7 kDa의 이황화 풍부한 독 단백질이다. 왼쪽의 스펙트럼은 추가 개입없이 분열과 탈염 후되면서, 이전의 DTT로 감소 단백질에 대한 결과를 보여줍니다. 우측의 스펙트럼은 어떤 과잉 DTT를 제거하는 탈염 하였다 DTT와 함께 환원 후에 단백질을 나타낸다. 실험 대중에 해당하는 이온이 각 이온의 스펙트럼 지정에 화살표로 표시됩니다은 녹색으로 표시됩니다. 이러한 이온에 대해 계산 된 실험 부모의 대중 (단백질에 대한 이전의 감소 (- DTT)와 감소 (+ DTT) 후) 표에 표시됩니다. 대중 8 다의 질량 차이를 나타낸다 (이전의 감소 및 감소 된 샘플 5717.6 다에 샘플 5709.6 다). 둘 다의 질량의 차이는, 1 산화 이황화 결합의 존재에 대응한다 (예상대로) 따라서 8 다의 질량의 차이는 4 이황화 결합의 존재를 나타내는 소재비 - 환원 샘플.

그림 1
설명 반자동 장비 높은 처리량 식 검사 프로토콜의 그림 1. 도식 표현.이 프로토콜을 사용하여, 96-384 조건 수동 방법을 사용하여 한 주에 한 사람에 의해 테스트 할 수 있으며, 최대 1,152 조건. 발현 플라스미드는 수많은 표적 한번에 서브 클로닝 될 수 있도록 재조합 클로닝 기술을 사용하여 구성된다. 일단 수용성 발현 조건이 식별되었으며 수행 단리는, 원하는 경우, 단백질은 산화 및 순도, microassays 및 / 또는 대규모 생산을 확인하는 품질 관리를 진행할 수있다.

그림 2 그림 2. 보편적 인 재조합 복제에 대한 회로도 및 디자인을 구성합니다. 대상 항목 클론에서 여러 발현 벡터는 높은 처리량 패션 (주에서 최대 6 × 96 항목 클론)에서 하나의 실험에서 하위 복제 할 수 있습니다. 발현 된 단백질은 니켈 친화 정제 HIS 태그를 인코딩합니다. DsbC (세포질 표현의 세포질 신호 순서가 결여) 융합 파트너는 용해도 및 / 또는 원조 폴딩 및 표적 단백질의 정확한 산화를 증가하는 데 사용됩니다. 태그 분해가 필요한 경우 대상 코딩 시퀀스는 N-말단 TEV 단백질 분해 효소 사이트 (ENLYFQ)를 포함해야합니다. 왼쪽 상단 삽입 된 PCR 또는 유전자 합성에 의해 얻을 수있다 도너 벡터와 표적 서열을 사용하여 엔트리 클론의 생성을 보여준다. 항목 클론은 상업 항목 클론 컬렉션에서 얻을 수 있습니다. 여러 재조합 복제 시스템을 사용할 수 있습니다,하지만 우리는 게이트웨이 Syste의에게 사용m, 회로도와 같이.

그림 3
여러 이황화 풍부한 대상에 대해 그림 3. 높은 처리량 검사 파이프 라인. 대상은 처음 BL21 (DE3) pLysS를 E.의 세포질에있는 HIS-DsbC 융합으로 표현된다 자동 유도 매체 (ZYP-5052)를 사용하여 17분의 37 ° C에서 대장균. 정화는 HTP 전기 (또는 점 오점 / SDS-PAGE로)에 의해 용해 구조의 검출 다음 니켈 수지에서 수행됩니다. 식 검사의 첫 번째 라운드가 실패하면 다른 배양 조건이 시도됩니다. 구문이 충분히 높은 수율, microassays 및 품질 관리에 가용성 단백질을 생산하는 경우 수행 될 수 있고 필요한 경우, 대규모 생산은 추구 될 수있다. 수용성 수익률이 충분히 높지 않다 대상의 표현 검사는 다른 스트라를 계속할 수 있습니다인 다음 온도 다른 융합 파트너 및 주변 세포질 식입니다. 선택 단계가 점선 상자로 표시됩니다.

그림 4
HTP 플랫폼에 대한 그림 4. 로봇 작업대 설치. 다른 작업 테이블도 사용할 수 있지만 우리의 액체 처리 로봇 작업대의 배치가 표시됩니다 가능한 동등한 사이트가 제공했다. 설정은 (8 - 채널 액체 처리 헤드 (LIHA)), 4 개의 위치를​​ 가진 두 개의 마이크로 캐리어 각 (MP4, 1-4과 5-8를 배치), 2 위치와 진공 스테이션 세척 스테이션 (WS)로 구성 캐리어에게 (테 - 셰이커 14-15과 16-17을 배치) 2 위치를 가진 두 개의 플레이트 뜨는 각각 3 위치와 마이크로 캐리어 (MP3가, 11 ~ 13를 배치), (테 - 진공 청소기, 9, 10 배치) 및 3 위치를 가진 처분 할 수있는 팁 (DITI, 18 ~ 20를 배치). 또다시 두 호텔 깊은 웰 플레이트에 대한 사업자와 (도시하지 않음) 마이크로 플레이트에 대한 하나입니다. 액체 처리 로봇에 설치되어있는 하드웨어는 처분 할 수있는 끝, 주변에 접시 / 장비를 이동 고정 팁 8 채널 액체 처리 헤드 (LIHA)와 로봇 매니퓰레이터 (로마)와 함께 사용하기위한 96 채널 팔 (MCA96)입니다 작업대. 위치의 번호는 프로토콜에 걸쳐이라고합니다.

그림 5
그림 5. 4 개의 24 웰 플레이트에 하나 96 - 웰 플레이트에서 전송하기위한 개략도.

그림 6
그림 6. 대표 결과는 96 이황화 풍부한 독 프로의 발현 화면에 표시됩니다teins. 단백질이 세포질에있는 HIS-DsbC 융합으로 표현하고 니켈 수지의 50 μL (프로토콜 8.2-B)를 사용하여 정제 하였다. A) 식 심사 결과, 가상 젤을 보여주는 식 수율 득점. 가상 젤의 대비가 매우 희미하거나 강렬한 밴드를 보상하기 위해 차선에 차선 조정되었습니다. 어떤 대상에 대해 두 밴드가 상위 대역에서 이황화 결합의 수와 비교). B 형 융합 태그에 대응하는 본래 융합 단백질 및 하부 대역으로 각각의 발현 수준에서 발현 된 단백질의 비율을 대응하는 볼 수 있습니다 단백질. 각 그룹에있는 단백질의 실제 개수는 그래프. C)에 오버레이되는 등전점 (PI) 및 잔기의 수에 기초하여 발현 량의 분포. D) 5.7 kDa의 이황화 풍부한 독이 질량 분석 결과의 예 4 이황화 결합과 단백질. 의 스펙트럼좌측은 종래 DTT와 함께 감소하고 우측의 스펙트럼 단백질 DTT로 환원 한 후 탈염 단백질 정보을 나타낸다. 실험 대중에 해당하는 이온은 화살표로 표시되어 자신의 할당은 녹색으로 표시됩니다. 이전의 감소 및 감소 후 표와 환원제를 첨가하기 전에 산화 단백질의 존재에 해당하는 8 다의 질량 차이를 전시하는 단백질에 대한 실험 대중. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

구성 요소 조리법 논평
ZY ~ 928 ㎖의
10g 트립 톤
5g 효모 추출물
925 ㎖의 물
혼합 후 소독 압력솥. 2 M 망초 100 ML
49.3 g 망초 · 7H 2 O
~ 60 ml의 물
용해 될 때까지 교반 한 후 소독 압력솥.
50X 5052 1 L
250g의 글리세롤
730 ㎖의 물
25g의 포도당
100g α-유당
순서대로 추가 모두 용해 될 때까지 불로 저어 후 소독 압력솥.
20 배 NPS 1 L
900 ㎖의 물
66g (NH 4) 2 SO 4
136g의 KH 2 PO 4
142g 나 2 HPO 4
순서대로 추가하고 모든 용해 후 소독 압력솥 때까지 저어.

ZYP-5052 배지의 성분 표 1. 레시피.

Discussion

가용성, 접힘, 기능성 단백질의 발현에 대한 하나의 보편적 인 프로토콜이 없습니다. 비용 및 시간 효율적일 여러 대상 작업 대부분의 실험실 또는 단백질 코어 설비 따라서 표적 대부분 수용성 활성 단백질을 얻기 변수 유용한 '일반적인'조합을 찾기 위해 선별 높은 처리량 단백질 발현을 사용하세요. 우리는 이황화 풍부한 펩타이드 및 단백질 11의 수용성 발현에 일반적으로 적용 융합 파트너 것으로 DsbC을 발견했습니다. DsbC 융합 및 높은 처리량 방법을 사용하여, 주 내에서 여러 대상의 가용성 식 (11)을 관찰 할 수있는 다음과 같은 소개에서 논의 된 것과 같은 추가적인 변수는 더 최적화가 필요한 대상에 대한 후속 라운드에서 상영 할 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 이황화 풍부한 단백질과 펩타이드의 발현을 목표로하고 있습니다. 그러나, 사용자의 특급하고자하는높은 처리량 방식으로 RESS 비 그물 단백질은 해당 프로토콜은 이전에 발표 된 다른 곳에서 (22, 24)을 발견 할 수있다.

높은 처리량 설정이 용해 식 또는 동시에 여러 표적 유전자에 대한 (다양한 융합 태그 포함) 식 구조의 많은 수의 검사에 대한 다른 많은 단백질의 심사를 포함하여 응용 프로그램의 수, (이상적입니다 또는 여러 식은 성공률을 향상시키기 위해 단일 ​​대상)에 대한 구성한다. 이 플랫폼은 또한 대상의 많은 수의 새로운 프로토콜의 벤치마킹 및 유효성 검사에 사용할 수 있습니다. 다른 응용 프로그램은 하나의 어려운 대상에 대한 변형 검사, 예를 들어, 모든 orthologs 또는 같은 가족의 구성원, 또는 실험에서 단일 대상의 돌연변이의 패널 생산의 성공을 테스트 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 공동 발현 벡터 (위트와 조합하여 사용되어왔다H의 하나는 아래로 당겨 올바른 복합체 형성과 화학 양론 (33)를 확인하기 위해보다 철저한 생물 물리학 적 분석에 의해 다음에 단백질 - 단백질 복합체의 예비 특성을 허용하는) 유일한 단백질을 태그. 정제 된 단백질의 양은 마이크로 분석법 (기능 시험, 단백질-DNA (34) 또는 단백질 - 단백질 상호 작용 분석) 때로는 적합하다. 높은 처리량 발현 스크리닝 전략 몇 가지 장점이있다 : (ⅰ) 대상의 다수를 테스트 할 수있는 능력 또는 번의 ​​실험에서 많은 변수, (ⅱ) 제한된 배치 별 편차, (ⅲ)는 단순하고 (V) 자동화를위한 잠재력 및 추적 (VI) 단순, 더 큰 규모로 깊은 우물, (IV) 확장 성 및 재현성을 사용하여 작은 규모에서 일하는 개별 튜브 (레테르를 붙이기, 이하 취급하지의 용이성 ) 혼합 개별 튜브의 취급보다 플레이트 형식을 사용하거나 클론의 교환 할 때 도입 실수.

(24)를 참조하십시오. 최대 효율성을 위해, 그것은 대상의 다수의 하위 복제를 단순화하기 위해, 높은 처리량 복제에 적합한 시스템을 가지고 도움이됩니다. VENOMICS 프로젝트의 초기 단계를 위해, 우리는 일주일에 클론의 수백의 속도로 모든 대상 벡터에 서브 클로닝을 허용하는 다양한 게이트웨이 재조합 시스템 (25)을 사용한다. 게이트웨이 재조합 복제에 대한 프로토콜은 인비 트 로젠의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다. 높은 처리량 복제에 대한 다른 대안은 37 복제 내고 독립적 인 복제 (LIC) (35, 36)과 제한없는 (RF) 등이 있습니다. 항목 클론 컬렉션에서, 주형 DNA에서 PCR에 의해 포함, 표현의 대상 유전자를 얻기 위해 여러 가지 방법이 있습니다 또는VENOMICS 프로젝트를 위해 선택한 전략 합성 유전자,. 합성 유전자는 유전자 및 유전자 합성의 각 끝에 재결합 사이트로 주문할 수 있습니다 표적 유전자 서열의 쉬운 코돈 최적화 (희귀 대장균 코돈을 제외 할) 수 있습니다. 이 권장되지만 필수되지 않습니다. 희귀 코돈의 높은 숫자, 로제 2 (매우 대장균에서 발현되지 않는 희귀 코돈에 tRNA에 탑재) (DE3) pLysS를을 포함 코돈 최적화하지 않고 대상의 BL21 (DE3) pLysS를보다 더 적합 할 수있다. 세포질의 일반적으로 감소 환경에서 이황화 결합의 감소를 제한하는 것이 가능한 변종이 있지만, 우리 손에 그들은 일반 E.만큼 성공하지 않은 콜라이 11 균주.

분석 규모의 친화력 정화는 수용성 융합 단백질을 복구하고 수율을 정량화하기 위해 테스트 식의 문화에서 수행됩니다. 정량적 데이터는 일에 얻을 수있다문화가 100 ㎎ / L - 0.1의 범위로 표현되는 융합 단백질의 전자 수용성 수율. 대상이 용해되지 않으면 다른 융합 파트너를 추구하기 전에, 다른 표현과 유도 온도, 변형 또는 매체를 테스트 할 수 있습니다. 이황화 풍부한 단백질의 수용성 발현을 위해, 우리는 이전에 세포질 식 11 DsbC> DSBA> GST> MBP> TRX는> HIS 태그로 융합 파트너의 효과를 평가했다. 세포질 표현은 이황화 풍부한 대상의 성공 접는 도움을 수있는 또 다른 가능성이다. 주변 세포질 세포질보다 덜 감소 환경 및 이황화 결합을 지원하기 위해 유용한 산화 환원 보호자를 포함한다. DsbC, DSBA 및 MBP 단백질은 일반적으로 자신의 주변 세포질 신호 서열에 의해 세포질로 지역화됩니다. 이 폴딩을 지원하기 위해 주변 세포질 공간 이황화 풍부한 대상을 지시하는 이러한 태그를 악용 할 수있는 기회를 제공합니다. 난치성 목표 들어, 다음 단계는 P로 될(이것은이 프로토콜의 범위를 벗어난 것으로 여기에 3 구를 논의하지 않을 것이다) 용해 및 접힘, 봉입체에서 불용성 HIS-태그 목표를 urify. 이것은 단지 하나 또는 두 개의 디설파이드 결합을 갖는 대상에 대해 매우 간단하지만, 이황화 결합의 수가 증가함에 따라 점점 더 어려워지고있다. 다른 방법으로, 특히 네 개 이상의 이황화 결합과 단백질 및 펩티드, 그것은 효모, 곤충이나 포유류의 표현으로 복잡한 생산 시스템을 시도 도움이 될 수 있습니다.

소형화 및 자동화의 발전과 함께, HTP의 전기 생리학 실험실 - 온 - 칩 기술 (28)는 의심 할 여지없이 기능 분석을위한 미래의 방법이 될 것입니다. 우리는 (아마도 구조적 연구 제외)이 대규모 배양의 필요성을 부정한다 대부분의 목적을 위해 그것을 직시. 작은 규모의 문화 표현의 조건을 심사하는 데 유용 할뿐만 아니라, SUF를 제공 할 수있을 것뿐만 아니라ficient이 소형화 기능 분석을위한 시료의 양은. 기능적 특성화를 위해 충분한 양으로 평행하게 복수의 타겟을 생산하는 능력이 배양 및 플랫폼의 이러한 종류를 사용하여 비용을 절감하고, 재조합 단백질의 발현 및 특성화 추가 비용 및 시간 효율적인해질 것이다.

프로토콜은 여기에 FP7 유럽 VENOMICS 프로젝트의 초기 단계에서 이황화 풍부한 펩타이드와 단백질의 발현에 적용되었습니다. 독은 종종 흥미로운 약물 가능성이 생리 활성 펩타이드의 훌륭한 소스입니다. 그러나, 그들의 생산 인해 복잡한 이황화 결합 패턴과 작은 크기에 도전합니다. 본원에 기술 된 것과 같은 고 처리량의 플랫폼을 사용하여, 프로젝트 VENOMICS 자연에서 볼 다양성을 재현하기 만 신규 독 펩티드 라이브러리를 생성하는 것을 목표로하고있다. 이 라이브러리는 이황화-R의 특성을 위해 이용 될 것입니다신약 개발을 목표로 잠재적 인 약물이나 치료 응용 프로그램과 무형 문화 유산 펩티드. 이 플랫폼은 현재 VENOMICS의 프로젝트에서 사용하기 위해 새로운 프로토콜을 벤치마킹하고 유효성을 검사하는 데 사용하고있다.

Acknowledgements

이 작품은 VENOMICS 프로젝트, 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 건강 2,011에서 2,015 사이)을 통해 278,346 ° 유럽 프로젝트 보​​조금 N에 의해​​ 지원되었다. VENOMICS 프로젝트는 유럽의 여러 연구 기관과 기업 간의 협력입니다 :

AFMB, 엑상 프로방스, 마르세유 대학교 (프랑스), CEA 클레 (프랑스), NZYTech (포르투갈), SistemasGenomicos (스페인), 대학 드 리에 주 (벨기에), VenomeTech (프랑스), Vitamib (프랑스), 뉴질랜드 제약 (덴마크)

이 작품은 통합 구조 생물학 (FRISBI) ANR-10-된 InSb-05-01 프랑스의 인프라에 의해 지원되었다.

저자는 또한 비디오의 촬영을위한 준비를 지원 씨 제레미 Turchetto에게 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot Tecan Group Ltd. Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates.
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8
96-well PCR (PCR96) plates Greiner Bio-One 652270 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/
LB medium Autoclaved for sterility.
Antibiotic stocks Kanamycin (50 mg/ml), ampicillin (100 mg/ml), chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at −20 °C. Use a 1:1,000 dilution.
Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity Greiner Bio-One 780270 Autoclaved for sterility.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/
Expression vectors For the expression of target constructs. Store at −20 °C.
BL21 (DE3) pLysS competent cells Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C.
Breathseal breathable adhesive film Greiner Bio-One 676050
PCR machine with 96-well plate block For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.
24-well sterile tissue culture plates Greiner Bio-One 662165 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/
LB-agar Autoclaved for sterility.
200 μl sterile disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 617 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Multitron shaking incubator, with 3 mm throw Infors AJ103 Not essential, a regular shaking incubator can also be used.
http://www.infors-ht.com/index.php/en/
Plate incubator
Microtiter plate For glycerol stocks and elution using purification protocol B.
Glycerol For the preparation of glycerol stocks.
200 μl disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 616 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Adhesive tape pads  Qiagen 19570 http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads
Bactinyl Orapi Group Or equivalent microbial disinfectant.
ZYP-5052 medium See Table 1 for recipes of components.
Deep well 24 (DW24) plates, 10 ml capacity Whatman 7701-5102 Autoclaved for sterility.
http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102
Flat-bottomed, clear microtiter plate Greiner Bio-One 655101 For absorbance readings.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/
Plate reading spectrophotometer Optional. For measuring OD600 of cultures.
Centrifuge with rotor for deep well plates  Suitable for 3,800 x g.
Lysozyme 50 mg/ml in water. Store at −20 °C.
Imidazole ACS grade Merck IX0005-1 A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.
Lysis buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.
Water bath
Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) Misonix Inc. Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.
DNase  2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C.
Magnesium sulphate (MgSO4) 2 M stock in water, autoclaved.
SDS-PAGE or Caliper sample buffer 
Binding buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Wash buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Elution buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity Macherey-Nagel 740686.4 http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx
200 μl disposable wide bore tips Tecan Group Ltd. 30 050 348 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Ni Sepharose 6 Fast Flow resin GE Healthcare 17-5318-02 For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use.
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802
Tobacco Etch Virus (TEV) protease Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C.
96-well 0.22 µm filter plate Millipore MSGV N22 10 Optional. To filter the soluble fraction after cleavage.
http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210
SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion.
Spectrophotometer and cuvettes For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.
ZipTip pipette tips Millipore Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control.
http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0
Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.

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References

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