Hög genomströmning Kvantitativ Expression Screening och rening Tillämpat på rekombinant Disulfide rika Venom proteiner som produceras i
1Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB), Aix-Marseille Université, 2iBiTec-S, Service d'Ingénierie Moléculaire des Protéines (SIMOPRO), Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives (CEA) Saclay, France

Biology
 

Summary

Ett protokoll för kvantitativ, hög genomströmning uttryck screening och analytisk rening av fusionsproteiner från småskaliga Escherichia coli kulturer beskrivs och tillämpas på uttrycket av disulfid rika djur gift proteinmål.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli. J. Vis. Exp. (89), e51464, doi:10.3791/51464 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Escherichia coli (E. coli) är den mest allmänt använda expressionssystem för produktion av rekombinanta proteiner för strukturella och funktionella studier. Emellertid är ibland krävande rening av proteiner, eftersom många proteiner uttrycks i en olöslig form. När du arbetar med svåra eller flera mål är det därför rekommenderat att använda hög kapacitet (HTP) proteinuttryck screening i liten skala (1-4 ml kulturer) för att snabbt identifiera förutsättningar för lösligt uttryck. För att klara av de olika strukturella genomik program labbet, en kvantitativ (i intervallet 0,1-100 mg / L kultur av rekombinant protein) och HTP proteinuttryck screening protokoll genomfördes på och godkänts för tusentals proteiner. Protokollen var automatiserade med användning av en flytande robothantering men kan även utföras manuellt utan specialutrustning.

Disulfid rika giftproteiner vinnerökande erkännande för sin potential som terapeutiska läkemedels leder. De kan vara mycket potent och selektiv, men deras komplexa disulfidbindning nätverk gör dem utmanande att producera. Som medlem i FP7 Europeiska Venomics projekt ( www.venomics.eu ), är vår utmaning att utveckla framgångsrika produktionsstrategier i syfte att ta fram tusentals nya gift proteiner för funktionell karakterisering. Med hjälp av redox egenskaper disulfidbindning isomeras DsbC anpassade vi vår HTP produktion rörledning för expressionen av oxiderade, funktionella gift peptider i E. coli-cytoplasman. De protokoll som även kan tillämpas på produktion av olika disulfid-rika proteiner. Här kan vi visa vår pipeline tillämpas på produktionen av djurgiftproteiner. Med de protokoll som beskrivs häri är det troligt att lösliga disulfid-rika proteiner kommer att erhållas i så lite som en vecka. Även från en liten skala, det finns potential att använda ee renade proteiner för att validera oxidationstal med masspektrometri, för karakterisering i pilotstudier, eller för känsliga mikroanalyser.

Introduction

Motiverade av en positiv utveckling av genomik och accelererad av upptäckten av nya proteiner, har hög genomströmning rörledningar utvecklats för att parallellisera traditionella metoder för screening och identifiering av optimala proteinproduktionsstrategier. Potentiella variabler som ska optimeras innefattar, men är inte begränsade till, att variera expressionsstammar 1,2, temperatur 3,4, media 2,3, Mål varianter 5, fusionspartners 6-13, samexpression med chaperones 14,15, cytoplasmisk eller periplasmiska uttryck 16-18, och rening buffertkomponenter 3. Genom att implementera hög genomströmning metoder, många variabler eller flera mål kan testas parallellt med en hög verkningsgrad, samtidigt begränsa batch-till-batch variation. I vår erfarenhet, strategin ger också god reproducerbarhet vid uppskalning använder samma kultur (temperatur, media, luftning, etc.) och reningsförhållanden (samma restn, buffertar, etc.). Flera hög genomströmning plattformar har använts under det senaste decenniet för att identifiera förutsättningar för lösligt protein uttryck, nämligen genom olika parametrar som fusionspartner, uttryck stammar eller temperatur 19-23.

Vi använde nyligen vår high throughput screening för uttryck av lösliga disulfid-rika proteiner 11. Proteinerna som väljs inte bara från giftiga källor, men även disulfid rika hämmare från en rad olika arter, inklusive växter, grisar, kor och människor. Experimentet jämfördes effekten av 12 olika fusionspartner och tre olika uttrycks påfrestningar på lösligheten och vikning av 28 disulfid-nätformade proteiner. Vi visade att använda DsbC som en fusionspartner för produktion i stammen BL21 (DE3) pLysS kraftigt outproduced (i både avkastning och antal lösliga proteiner som erhållits) någon annan kombination av stam-och fusions testade 11. DenResultaten av detta experiment utgjorde grunden för anpassning vår ursprungliga allmänna hög genomströmning rörledning (som har använts för expression screening av ett brett spektrum av proteiner) 22,24 till en mer lämpad för uttryck av disulfid-rika mål. Disulfid rika proteiner från djur-gifter är av särskilt intresse. Gifter är en komplex blandning av bioaktiva peptider och proteiner, med potentiellt värde farmakologiskt och terapeutiskt. Emellertid är inte trivialt uttryck av disulfidbindning-innehållande proteiner. Dessa proteiner innehåller i allmänhet mellan 1-7 disulfidbindningar, och måste oxideras med de korrekta disulfid-bindningsmönster, för att vara aktiv. För närvarande är den plattform som används för screening av uttrycket av ett stort antal disulfidbind-rika djur-giftproteiner som en del av FP7 Europeiska VENOMICS Project (www.venomics.eu) och jämföra nya protokoll för hög genomströmning uttryck av tusentals av mål . Här, en automatisk metodär anordnad för hög genomströmning småskaligt uttryck screening och rening (se figur 1) som appliceras till disulfid rika djurgiftproteiner. Strategin för disulfid-rika peptider och proteiner utnyttjar en His-tag för rening och redox-aktiv fusionspartner, DsbC, vilket skapar klyvbara HIS-DsbC fusioner till målproteinerna (se figur 2).

Medan fokus i protokollen här är automatisering med hjälp av en vätskehanteringsrobot och HTP elektrofores, dessa metoder är också lämpliga för en hög genomströmning manuell inställning, vilket innebär att även laboratorier med en grundläggande inställning kan dra nytta av de protokoll utan någon förutsättning för dyr utrustning . Manuella protokoll för omvandling till rening och analys (ej specifik för disulfid-rika proteiner) har publicerats på annat håll 24 och kommer inte att upprepas här. Genomströmningen av den manuella proceduren (från expressionsklon, som produceras av rekombinantanationell kloning 25, till analys av lösliga proteinnivåer) är 96 (med användning av SDS-PAGE-detektion) eller 384 (4 x 96, med hjälp av dot blöt och SDS-PAGE 26) kulturer per vecka (se figur 1). Detta kan ökas om det utförs i ett halvautomatiskt sätt (med användning av en vätskehanteringsrobot och dot blot-26 eller HTP-elektrofores, såsom med en Caliper GXII LabChip systemet 22 för analys av resultat) och upp till 1152 (12 x 96) kulturer parallellt över en vecka, såsom beskrivs häri. Odling utförs i djup brunn 24 (DW24) format så att regelbundna skakar inkubatorer kan användas i motsats till kulturer odlade i djup brunn 96 (DW96)-format, vilket nödvändiggör användningen av korta omloppshöghastighets skakande inkubatorer för tillräcklig luftning (skakning vid 800 rpm). Användning av autoinduktion media 27 förenklar också uttryck, vilket eliminerar den manuella induktionssteget. Även där laboratorierna använder redan fördefinierade uttryck och purificering förhållanden, kan dessa överföras direkt till denna HTP system bara för att förbättra effektiviteten. Ett detaljerat schema av high throughput screening rörledning för disulfid-rika proteiner ges i figur 3. Parametrarna i rörledningen valdes ut baserat på omfattande screeningsexperiment 11, 22, som tillät oss att välja de mest användbara förhållanden för proteinproduktion.

Karaktärisering kan utföras på taggade proteiner som renats direkt från småskaliga uttrycken i pilotstudier där tiotals mikrogram av provet är tillräcklig eller för känsliga funktionella analyser och bindningsanalyser (t.ex. låg volym HTP patch clamp-system 28). Detsamma kan även utföras på de omärkta mål efter klyvning, förutsatt taggen och proteas avlägsnas (t ex genom omvänd fas-HPLC). Kvalitetskontrollen kan också genomföras med hjälp av masspektrometri (för att bekräfta den förväntade storleken och oxidation ståt) eller kromatografiska metoder (för att bekräfta renhet eller heterogenitet) 29. Ibland tagga klyvning är onödiga eller till och med önskvärt (speciellt för svårlösliga proteiner 30,31), så i detta protokoll klyvning är valfritt. Oavsett, i alla konstruktioner finns det en TEV-proteas-klyvningsställe (ENLYFQ / [G] 32) direkt föregår den målgen för att producera nativa proteinet efter klyvning (se figur 2 och diskussion). Om klyvning av fusions taggen önskas, kan klyvning testas (på elueringsfraktionen eller "på kolumnen") på liten skala för att analysera effektiviteten, optimera förhållanden om det behövs och få tillförlitliga uppskattningar av avkastningen för efterföljande skala upp experiment.

Det finns två alternativ för volymen av kulor används under affinitetsrening, beroende på vilka mål och förväntningar försöket. För att kunna fånga så mycket protein som möjligt (för att rena för pilot analyser eller MS, eller att extrapolåt att skala upp avkastningen) en slutlig volym på 200 l av plast bör användas, så att detektion av lösligt protein i intervallet 1-100 mg / L kultur före mättning av systemet (se protokoll (A) i avsnitt 8.1) . Men om syftet med experimentet är detektion av låga mängder av lösliga proteiner sedan en slutlig volym av 50 | il av harts är lämpligt, så att detekteringen av lösligt protein i intervallet från 0,1 till 25 mg / l kultur (se protokoll (B ) i avsnitt 8.2).

Produktionen kan skalas upp, om så erfordras, för erhållande av milligrammängder av renat mål för ytterligare strukturella och funktionella studier med användning av de villkor som fastställts för löslig uttryckning. Detaljerna i skal-up protokoll som används vid AFMB har diskuterats på andra ställen 22,24.

Ytterligare detaljer som är relevanta för den experimentuppställning, kritiska steg i protokollet, är ändringar och felsökning och begränsningar i den teknik som tillhandahålls på skivanussion. Läs diskussionen innan du börjar experimenten.

Under hela protokollen vi förväntar en framgång på 90% vid varje steg (till exempel, måste minst 90% av odlingarna växer vid varje steg). Om andelen framgångsrika varje steg i experimentet sjunker under 90% proverna kasseras och försöket upprepas för hela samlingen av konstruktioner. Emellertid är denna framgång inte tillämpliga på det antal konstruktioner som uttrycker som lösliga proteiner eller den andel av konstruktionerna som klyver med 100% effektivitet, eftersom detta kommer att vara mycket beroende av de testade proteinerna.

De specifika detaljerna för installation av roboten arbetsbord finns för varje protokoll (se även figur 4), men de kan anpassas efter behov för alternativa arbetsbord uppställningar. Roboten hårdvara (Tecan) består av en 96-multichannel arm (MCA96), robotmanipulator (Roma) och 8-kanals vätskehanteringshuvudet (Liha). Alla steg som utnyttjar MCA96 kan även utföras med användning av Liha om en MCA96 inte är tillgänglig, men de kommer att ta längre tid på grund av att Liha måste tvättas mellan stegen. Medan roboten är tekniskt sett inte en steril miljö, införandet av antibiotika ger i allmänhet att det inte finns problem med kontaminering eller sterilitet.

Protocol

Del A: Transformation och Test Expression

Manuella rutiner för kloning 22 och omvandling till rening diskuteras på annan plats 24. Transformationsprotokoll kan fullständigt genomföras på roboten 26, men det är vanligtvis mer tidseffektivt att göra det manuellt. Därför protokollen börjar häri från ympning av uttrycket pre-kulturer och plätering av omvandlingen från värmen chockad omvandlingen blandar görs manuellt. För ytterligare information om de manuella kloning och transformationsförfaranden se relevanta referenser 22,24.

1. Pre-kulturer och plätering

  1. Förbered robotbordet (se figur 4 för positioner):
    1. Sätt en 300 ml tråg innehållande 150 ml sterilt LB-medium (kompletterat med ampicillin (100 pg / ml) / kloramfenikol (34 pg / ml), eller ett annat lämpligt antibiotikum) vid position 8.
    2. Sätt en steril DW96 i position 11. Sätt 4x förberedda 24-väl LB-agar (Amp / Cam) vävnadsodlingsplattor (innehållande 2 ml agar i varje brunn) med tillhörande lock på i positionerna 14-17.
    3. Sätt transformationsplattan (innehållande 96 transformation blandar efter heatshock) vid position 13. Detta kommer att användas för att ympa de flytande pre-kulturer och LB-agarplattor. Sätt en låda av sterila 200 il pipettspetsar i position 18.
  2. Med användning av 96-multichannel arm (MCA96) och 200 | il tips, aspirera 200 | il LB-buljong (position 8) och fördela i det DW96 vid position 11. Upprepa tills det finns en slutlig volym av 1 ml LB-buljong i varje brunn i den DW96. Detta kommer att bli den flytande förkulturen.
  3. Med hjälp av robotmanipulatorn (Roma), ta bort locket på den första 24-brunnars LB-agarplatta och placera den på andra ställen (t ex i ett hotell bärare) tills pläteringen är färdig för denna platta.
  4. Med hjälp av 8-kanals vätskehantering (Liha) huvud, blanda sedan aspirera 50 pl than första kolumnen i transformationsmixen i position 13. Denna volym av transformationsmixen är precis tillräckligt för att täcka LB-Agar väl.
  5. Med de första fyra kanaler, dispensera på den första kolumnen i den första 24-brunnars LB-agarplatta vid position 14 (såsom visas i fig 5).
  6. Med de senaste fyra kanaler, dispensera på den andra kolumnen i den första 24-brunnars LB-agarplatta.
  7. Tvätta alla tips noggrant efter dosering.
  8. Fortsätt tills alla transformationer har pläterade på den första plattan i position 14, överföring från 96 - till 24-brunn med den ordning som i Figur 5.
  9. När den första plattan har slutförts, använd romerna att ersätta locket och ta bort locket från nästa platta i position 15. Fortsätt att använda bordläggningen schema för de kommande 3 plattor.
  10. När bordläggningen är klar, ställ in Te-Shake till 1.200 rpm och skaka alla plattor i 1 min för att få en homogen fördelning av transformationsmixen. Använda MCA96 och den ursprungliga pipettspetsar, blanda sedan aspirera 60 l av den återstående transformationsmixen (position 13) och fördela i DW96 innehåller LB buljong i position 11.
  11. Täta DW96 pre-kulturer med andas självhäftande film för att låta kulturen luftning.
  12. Placera i ett 37 ° C skakande inkubator vid maximal hastighet O / N (200/800 rpm beroende på shaker orbital).
  13. Den LB-agarplattor ska placeras i en huv med tillhörande lock av tills torr (10 min). Då de placeras omvänt i en 37 ° C platta inkubator fram till följande morgon.
  14. Nästa dag är förkulturen användes för att ympa testuttryck i autoinduktion medium och för framställning av glycerol lager. Sätt agarplattorna i kylskåp, som en back up. Om det behövs, från agarplattorna eller glycerol lager, testuttryck kan göras om genom ympning en färsk LB förodling direkt.

2. Framställning av DW24 ZYP-5.052 Plates

OBS: Denna procedur tar cirka 5 minuter att fylla i för varje uppsättning av 4x DW24 plattor.

  1. Späd 500 ml ZYP-5052 autoinduktion medel för varje replikat av 96 kulturer (464 ml ZY medel, 250 ^ 2 M MgSO 4, 10 ml 50x 5052, 25 ml 20x NPS, i den ordningen - recepten för varje komponent är ges i tabell 1) kompletterat med lämpliga antibiotika.
  2. Förbered robotbordet:
    1. Sätt två 300 ml tråg, vardera innehållande ~ 250 ml medium vid position 5 och 6. Sätt fyra sterila DW24 plattorna vid positionerna 14-17. Sätt 200 | il tips vid position 18.
  3. Använda MCA96 och 200 pl tips, aspirera 200 pl ZYP-5052 från position 5 och fördela i den första DW24 plattan i position 14. Gör detta totalt 5 gånger (4 tips kommer att avstå i en enda bra på en gång för totalt av 4 ml). Upprepa för de återstående 3 x DW24 plattor vid positionerna 15 till 17, switching till ZYP-5052 vid position 6 för de senaste två DW24 plattor.

3. Ympning och tillväxt av test Expression kulturer

OBS: Ympning tar ca 10 min att fylla i för varje uppsättning av 4x DW24 plattor, och tillväxten fortsätter O / N.

  1. Förbered robotbordet:
    1. Sätt DW96 plattan innehåller pre-kulturer (från steg 1,15) i position 11. Sätt de fyra DW24 plattor som innehåller ZYP-5052-medium (från steg 2,3) i positionerna 14-17.
  2. Använda Liha aspirera 100 pl förodling från position 11 för att ympa provuttrycks kulturer (1/40 utspädning) med hjälp av det system som i Figur 5. Tvätta Liha huvudet ordentligt vid tvätthall mellan varje kolumn av de 96 brunnar pre-kulturer.
  3. Täta DW24 plattor med andningsbar film och inkubera vid 37 ° C med skakning (200/400 rpm) under fyra timmar. Detta är den tid av tillväxtfasen under vilken Glucose från mediet kommer företrädesvis vara uttömda 27.
  4. Minska temperaturen till 17 ° C. Efter 4 h och utarmning av glukos, kommer laktos börja metaboliseras, vilket leder till induktion av uttryck, som ger de optimala tillväxtbetingelserna för BL21 (DE3) pLysS eller Rosetta 2 (DE3) pLysS, i detta arbete 22. Låt cellerna att uttrycka O / N. Använd den återstående förkulturen att glycerol lager.

4. Framställning av glycerolstam

Anmärkning Glycerol lagren bör göras i triplikat som skall lagras på olika platser i händelse av frys misslyckande.

  1. Förbered robotbordet:
    1. Sätt mikrotiterplattor vid position 5 till 7 för att hysa glycerol lager. Sätt en 300 ml tråg fylls med 50 ml av 100% glycerol vid position 8. Sätt en DW96 innehållande 800 | il av förkultur (efter steg 3,2) i varje brunn vid position 11. Sätt 200 | il tips vid position 18.
  2. Med hjälp av ett slow aspiration och dispense hastighet, använder MCA96 och 200 pl tips att lägga glycerol i DW96 innehåller pre-kulturer.
    1. Aspirera 200 pl av glycerol (från position 8).
    2. Dispensera 150 pl (vid position 11) först, sedan göra en paus för 20 sek för att tillåta den återstående glycerol för att nå botten av spetsen. Fördela de återstående 50 pl.
  3. Med användning av samma tips, blanda kulturen och glycerol i DW96 vid position 11 till dess att de är ordentligt blandade. Den slutliga koncentrationen av glycerol är 20%. Aspirera 140 pl från DW96 och fördela i den första mikrotiterplattan i position 5.
  4. Upprepa steg 4.3 för varje återstående mikrotiterplatta (positionerna 6 och 7).
  5. Förslut varje mikrotiterplatta med plasttejp och förvara vid -80 ° C. Kassera återstående kulturen i DW96, dekontaminering med ett antimikrobiellt medel före avyttring.

5. Bedöma tillväxten för kulturerna

600 är vanligtvis densamma för de flesta kulturer (cirka 12 i dessa villkor), men alla kulturer som inte växer bör noteras.

  1. Ta 50 l av varje kultur (från steg 3,4) och fördela i en flatbottnad, klar mikrotiterplatta innehållande 150 l av medium.
  2. Mät OD 600, med hänsyn till 4-faldig utspädning. Om det finns någon som inte växte mycket bra, notera detta för den slutliga analysen.

6. Skörd av cellerna

OBS: Denna procedur tar cirka 45 minuter att slutföra.

  1. Centrifugera 4x DW24 plattor (från steg 3,4) vid 3000 x g under 10 minuter och därefter kassera supernatanten till en avfallsbehållare som innehåller antimikrobiellt medel. Knacka plattorna, upp och ner, mot ett absorberande papper för att ta bort överflödigt medium.
  2. Under tiden bereda 100 ml lysbuffert (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8, eller någon annan föredragen buffert) innehållande lysozym (slutlig koncentration 0,25 mg / ml).
  3. Förbered robotbordet:
    1. Sätt lysbuffert i en 300 ml tråg vid position 5. Sätt en ren DW96 vid position 11. Sätt de 4 x DW24 plattor innehållande cellpelletarna (från steg 6,1) i positionerna 14-17. Sätt 200 il tips vid position 18.
  4. Använda MCA96 och 200 pl tips, aspirera 125 l av lyseringsbuffert från position 5 och fördela i varje DW24 platta (positionerna 14-17). Upprepa. Anmärkning 4 tips kommer dispensera in i en enda brunn på en gång till en slutlig volym av 1 ml i varje brunn av DW24 plattorna.
  5. Skaka plattorna vid positionerna 14 till 17 med användning av Te-Shake (1000 rpm) under 15 min för att återsuspendera pellets.
  6. När pelletsen återsuspenderas, använd de första fyra kanalerna hos Liha att aspirera 550 pl från prover 1 till 4 (den första kolumnen i den första DW24, vid position 14), och sedan med hjälp av last fyra kanalerna hos Liha aspirera 550 | il av prov 5 till 8 (den andra kolumnen i den första DW24). Fördela i den första raden av DW96 i position 11.
  7. Upprepa steg 6.6, så att alla cellsuspensionen överförs till DW96.
  8. Efter varje uppsättning prover tvätta Liha tips i tvätthall.
  9. Upprepa steg 6,6-6,8 för varje kolumn i varje DW24 platta (positionerna 15-17) med hjälp av det system som i Figur 5. Täta med plastfilm.
  10. För rening på samma dag eller kortvarig frysning, förvara vid -80 ° C under minst en timme, annars i -20 ° C.

Del B: Rening och analys

7. Cellys

Den här proceduren tar ca 60 minuter att slutföra.

  1. Tina frysta cellsuspensioner (från steg 6,10) i ett vattenbad (vid rumstemperatur eller 37 ° C) under ca 15 min och återsuspendera i den skakande inkubator under en entterligare 10 min. Kulturerna bör bli trögflytande.
  2. Ta 500 l av DNas lager och blanda det med 1 ml MgSO 4 lager. Manuellt med en 8-kanals pipett eller med roboten Liha och dispensera 15 | il i varje brunn i den DW96, för att ge en slutlig koncentration av 10 pg / ml av DNas och 20 mM MgSO 4.
  3. Re-försegla plattan med plasttejp och skaka i ytterligare 15 min. Vid denna punkt kulturerna bör vara icke-viskös. Kontrollera noggrant (genom visuell undersökning) att alla kulturer är inte längre trögflytande. OBS: Detta är kritisk, om vissa kulturer fortfarande är trögflytande (till exempel om den DNas av misstag glömt eller inte fördelas på lämpligt sätt i vissa brunnar), filtret kommer att täppa, genererar en ojämn press på de prover och bräddavlopp eller total igensättning av filterplattan kan hända under reningen.
  4. För SDS-PAGE-prover av den helt cellysat, aspirera 10 | il av lysat och dispensera in i en 96-brunnars PCR-platta innehållande10 | il 4x SDS-PAGE-provbuffert och 20 fil vatten. Denaturera under 3 min vid 95 ° C och frysa tills analys (total fraktion). Om ett HTP elektroforessystem finns tillgängligt, kan proverna analyseras på det här stället att följa tillverkarens rekommenderade protokoll för provberedning. För ytterligare information om analys av proverna, se avsnitt 10.

8. Ni Affinitetsrening

OBS: En långsam aspiration hastighet bör användas för pipettering alla harts upphängningar, eftersom upphängning är ganska tjock. Över-torkning av hartset kommer att resultera i en reduktion i bindningskapacitet. För rening, de specificerade imidazol halterna gäller för nickel affinitetsharts. Om alternativa joner (t.ex. kobolt) används, då koncentrationerna bör justeras i enlighet därmed.

  1. A - Ni-affinitetsrening för detektering inom området från 1 till 100 mg / L (slutlig hartsvolym = 200 | il)
    OBS: Thans reningsförfarande tar ca 1,5 timmar att slutföra, vilket innebär att upp till 4 kan utföras på en dag.
    1. Förbered robotbordet:
      1. Sätt 300 ml tråg innehållande bindningsbuffert (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8), tvättbuffert (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol pH 8) och elueringsbuffert (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol pH 8) i positionerna 6-8, respektive.
      2. Lämna en tom 300 ml tråg i position 5 för hartsuppslamningen. I position 9 och 10 put platthållare. Vid position 10 sätta en DW96 med SPE-blocket och filter / mottagare plattan (20 ^ m) ovanpå.
      3. Sätt DW96 innehåller lysat (från steg 7,3) i position 14. Vid position 18 och 19 satte de 200 ^ breda borr tips och 200 pl tips, respektive. Sätt två extra DW96 plåtar för tvätt och eluering på ett hotell. OBS: De kan också sätta på en annan plats på arbetsbordet om ett hotell inte är tillgänglig.
    2. Bered 105ml till jämvikt 33% hartsuppslamning (35 ml harts + 70 ml bindningsbuffert). Lägg hartssuspension till tråget vid position 5 omedelbart innan proceduren.
    3. Använda MCA96 och 200 ^ breda borrspetsar (position 18), blanda hartsuppslamningen i position 5 ordentligt innan aspirera och fördela 200 pl hartsuppslamningen i DW96 innehåller lysat i position 14. Upprepa två gånger så att 600 l av hartsuppslamningen har lagts till lysatet, blandning av hartset suspensionen innan varje aspiration.
    4. Utför en 10 min blandningssteg med hjälp av MCA96 vid position 14 för att medge bindning och för att förhindra hartset från pelletering.
    5. Aspirera från position 14 och dispensera 800 ^ il (i 200 | il delar) på filterplattan vid position 9, blandning innan varje aspiration annars hartset kommer att kvarhållas vid botten av DW96.
    6. Stäng av vakuumet på vid position 10 i ungefär 90 sekunder för att välja lysatet genom plattan in iDW96 att samla genomflödet, till att inte torka ut hartset. Stäng av vakuumet av.
    7. Upprepa steg 8.1.5 och 8.1.6, så att alla av hartset befinner sig då i filterplattan.
    8. Med hjälp av romerna armen flyttar SPE blocket som håller filterplattan från position 10 till position 9 så att nästa tvättsteg går direkt till avfallet och överföra DW96 innehåller genomflödet i position 10 till en annan plats (t.ex. till ett hotell bärare) till slutet av proceduren.
    9. Med en ny uppsättning av 200 il tips (på plats 19), tvätta hartset (vid position 9) med totalt 800 l av bindningsbuffert (från position 6), och tillämpa vakuum vid position 9 tills bufferten har passerat . Upprepa en gång till.
    10. Använd Romerna armen för att placera en färsk DW96 i position 10 för att samla in 50 mM imidazol tvätta och flytta SPE blocket och filterplattan tillbaka på toppen (position 10).
    11. Lägg till 800 l av tvättbuffert från position 7 på position 10, vridvakuum på tills bufferten har passerat genom. Stäng av vakuum av.
    12. Med ROMA, ta bort SPE blocket och filterplattan till läge 9 och DW96 innehåller tvättprovet till hotellet, och hålla den åt sidan till slutet av proceduren.
    13. Tvätta hartset med ytterligare 800 ^ il tvättbuffert (från position 7 till läge 9), applicera vakuum tills bufferten har passerat genom. Upprepa en gång till.
    14. Använd romerna att placera en färsk DW96 i position 10 och placera SPE blocket och filterplattan tillbaka på toppen för att samla eluering.
    15. Lägg totalt 500 ul av elueringsbuffert (från position 8 till position 9) och inkubera in situ under 3 min. Sätt på vakuum tills all buffert har passerat genom.
    16. Tillval: För högt uttrycka proteiner, kan utföras en andra eluering i en färsk DW96 som i steg 8.1.14 och 8.1.15.
    17. Ta prover av genomflödet, tvätt och eluering / s för SDS-PAGE eller HTP-elektrofores.
      1. För HTP elektrofores prover, följa tillverkarens anvisningar. För ytterligare information om analys av proverna, se avsnitt 10.
  2. B - Ni-affinitetsrening för detektering inom området av 0,1 till 25 mg / L (slutlig hartsvolym = 50 | il)
    OBS: Detta reningsförfarande tar ca 30 minuter att slutföra, vilket innebär att upp till 12 kan utföras på en dag.
    1. Förbered robotbordet:
      1. Sätt 300 ml tråg innehållande bindningsbuffert (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8), tvättbuffert (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol pH 8)och elueringsbuffert (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol pH 8) i positionerna 6-8, respektive.
      2. Lämna en tom 300 ml tråg i position 5 för hartsuppslamningen. I position 9 och 10 put platthållare. Vid position 10 sätta en DW96 med SPE-blocket och filter / mottagare plattan (20 ^ m) ovanpå.
      3. Sätt DW96 innehåller lysat (från steg 7,3) i position 14. Vid position 18 och 19 satte 200 il breda borr tips och 200 pl tips, respektive. Sätt ett reservhjul 96-brunnars mikrotiterplatta för eluering på ett hotell. OBS: Detta kan också sättas på en annan plats på arbetsbordet om ett hotell inte är tillgänglig.
    2. Bered 50 ml av jämviktades 25% hartsuppslamning (12,5 ml harts + 37,5 ml bindningsbuffert). Lägg hartssuspension till tråget vid position 5 omedelbart innan proceduren.
    3. Använda MCA96 och 200 ^ breda borrspetsar (position 18), blanda hartsuppslamningen i position 5 ordentligt innan aspire och dispensing 200 pl av harts uppslamningen i DW96 innehållande lysatet vid position 14.
    4. Inkubera vid rumstemperatur under skakning med användning av Te-Shake vid 1400 rpm under 10 min för att medge bindning.
    5. Aspirera från position 14 och dispensera den fullständiga 1200 il (i 200 | il delar) under användning av de breda bore tips (position 18) på filterplattan vid position 10. Blanda innan varje aspiration annars hartset kommer att kvarhållas vid botten av DW96.
    6. Stäng av vakuumet på vid position 10 i ungefär 30 sekunder för att välja lysatet genom plattan in i DW96 för uppsamling av genomflödestest, se till att inte torka ut hartset. Stäng av vakuumet av.
    7. Med hjälp av romer armen, flytta SPE blocket som håller filterplattan från position 10 till position 9 så att nästa tvättsteg går direkt till avfallet och överföra DW96 innehåller genomflödet i position 10 till en annan plats (t.ex. i en hotellbärare) till slutet av proceduren.
    8. Med de 200 μl tips (vid position 19), tvätta hartset (vid position 9) med totalt 800 l av bindningsbuffert (från position 6), och tillämpa vakuum vid position 9 tills bufferten har passerat. Upprepa.
    9. Använd Romerna armen för att placera den färska DW96 i position 10 för att samla in 50 mM imidazol tvätta och flytta SPE blocket och filterplattan tillbaka på toppen (position 10).
    10. Tillsätt 150 l av tvättbuffert från position 7 på position 10, slå på vakuum på tills bufferten har passerat. Stäng av vakuum av.
    11. Med ROMA bort SPE blocket och filterplattan till läge 9 och DW96 innehåller tvättprovet till hotellet, och hålla den åt sidan till slutet av proceduren.
    12. Tvätta hartset med ytterligare 800 ^ il tvättbuffert (från position 7 till läge 9), applicera vakuum tills bufferten har passerat genom. Upprepa.
    13. Använd romerna att placera mikroplattan i position 9 och placera SPE blocket och filterplattan tillbaka på toppen för att samla in ee eluering.
    14. Addera 190 pl av elueringsbuffert (från position 8 till position 9) och inkubera in situ under 3 min. Applicera vakuum tills all buffert har passerat genom.
    15. Ta prover av genomflödet, tvätt och eluering för SDS-PAGE eller HTP-elektrofores.
      1. För SDS-PAGE-prover av genomflödet och dispensera 10 | il i en 96-brunnars PCR-platta innehållande 10 | il av 4X SDS-PAGE-provbuffert och 20 fil vatten. För SDS-PAGE-prover av den tvätt och eluering / s dispensera 30 | il till PCR-plattor innehållande 10 | il 4x SDS-PAGE-provbuffert. Denaturera under 3 min vid 95 ° C och frysa fram till analys.
      2. För HTP elektrofores prover, följa tillverkarens anvisningar. För ytterligare information om analys av proverna, se avsnitt 10.

9. Tag Cleavage (tillval)

  1. Lägg TEV-proteas (2 mg / ml) till det eluerade proteinet (från steg 8.1.15 (och 8.1,16) eller steg 8.2.14) i ett förhållande av 1/10 (vol / vol).
  2. Inkubera vid rumstemperatur (eller 4 ° C i temperaturkänsliga proteiner) O / N med varsam skakning.
  3. I slutet av klyvning dosera 30 pl i en PCR-platta med 10 pl 4x SDS-PAGE provbuffert eller följa tillverkarens anvisningar för HTP elektroforesprover.
  4. Filtrera den återstående klyvningsblandning (från steg 9,2) genom en 96-brunnars 0,22 fim filterplatta och samla det lösliga genomströmning i en DW96 genom att applicera vakuum. Detta kan göras på ett av vakuum platser (t.ex. position 10) på vätskerobothantering, liksom för elueringen stegen i avsnitten 8.1 och 8.2. Detta avlägsnar varje protein som fälls ut under klyvning.
  5. Efter filtrering, dosera 30 pl i en PCR-platta med 10 pl 4x SDS-PAGE provbuffert eller förbereda som HTP elektroforesprover. Detta medger jämförelse av proteinet före klyvning, blandningen efter klyvning och solenls ö protein som återstår efter klyvning och ger goda indikationer på de förväntade resultaten i efterföljande skala upp experiment. För ytterligare information om analys av proverna, se avsnitt 10.

10. Analys av resultat

  1. Identifiera de konstruktioner som uttrycker lösligt protein genom analys av de renings proverna på SDS-PAGE, dot blöt eller HTP elektrofores-system, såsom Caliper LabChip.
    1. Analysera eluerings proverna först identifiera konstruktioner producerar lösligt protein. I de flesta fall endast eluerings proverna analyseras om lösliga konstruktioner identifieras, för att minimera tiden för analysen.
    2. Om proteinet inte är i elueringen, kör tvätt-och genomflödesprover för att se om det uttrycktes och band inte ordentligt till hartset.
    3. För konstruktioner där inget lösligt protein kan detekteras run hela cellysat för att se om proteinet uttrycktes.
      ANMÄRKNING: En begränsning här är att om protein av intresse är inte att presentera ovanstående bakgrundsuttrycksnivåer, kan det inte vara möjligt att se proteinet och kan leda till ett falskt negativt. Det måste noteras att det alltid är möjligt för proteiner att hålla sig och faller på affinitetsharts och detta kan leda till ett falskt negativt eller underskattning av avkastningen genom att använda det rekommenderade protokollet (en ovanlig händelse i detta arbete). I händelse av att proteinet faller ut vid eluering (en vit pellet syns några minuter / timmar efter eluering) rekommenderas att ändra buffertsammansättning (t.ex. saltkoncentration) och / eller utföra en differentialavsökande fluorimetri analys för att optimera buffertar. Ett litet prov av hartset kan även återsuspenderades i SDS-PAGE-provbuffert och kokas för att upptäcka om ett protein som hålls kvar på hartset.
    4. Om proteinet inte uttrycktes men cellerna växte, driva ett nytt uttryck strategi, eller om OD 600 var inte tillräckligt hög återföds ständigt och ny analys kulturen. >
    5. Om klyvnings prover ska analyseras, bör de analyseras i en sida-vid-sida-sätt, så att varje konstruktion kan visas före klyvning en efter klyvning i intilliggande körfält, för att förenkla analysen.
  2. Såvida inte på ett sätt som ger direkt kvantifiering av elueringen koncentration bör kvantifiering utföras för positiva prov genom att mäta absorbansen vid 280 nm (A280).
    1. Mät A280, med utrotning koefficient av proteinet i beaktande och använda elueringsbufferten som ett tomt, för att ge en uppskattning av proteinutbyte i syfte att identifiera de högsta som uttrycker lösliga konstruktioner.
    2. För den mest tillförlitliga jämförelser av lösliga avkastning, rekommenderas att normalisera räntorna med densiteten av kulturen (med hjälp av OD 600 mätningar), som togs på 5 §. Om alla kulturer växte till ungefär samma densitet, är inte normalisering krävs.
e "> 11. Kvalitetskontroll

  1. Prover kan analyseras direkt från eluering eller klyvning provet genom vätskekromatografi-masspektrometri (LC / MS).
  2. Alternativt avsalta först (för att avlägsna imidazol och eventuella buffertsalter som kan finnas närvarande) med användning ZipTip pipettspetsar eller vätske metoder kromatografi, sedan analysera med användning av matris-assisterad laserdesorption / jonisering time-of-flight (MALDI-TOF) eller elektrosprayjonisering ( ESI) masspektrometri.
  3. Småskaliga funktionella studier kan utföras för att kontrollera om funktionen hos proteinet är som förväntat. Om större mängder krävs för funktion, kan en uppskalning kultur och testade från den större kulturen en gång storlek och oxidationstal funktion har bekräftats i liten skala.

Representative Results

Representativa resultat visas i Figur 6 för expression screening av 96 disul-rika proteiner från VENOMICS rörledningen. Proteinerna är anordnade genom att man ökar antalet disulfidbindningar sedan öka antalet rester. Peptiderna uttryckta i cytoplasman med en His-tag och DsbC fusionspartner. Vid användning av de rekommenderade odlingsbetingelser, är en OD 600 av 12 som normalt uppnås. Peptiderna renades med användning av protokollet 8,2-B med en slutlig volym av 50 | il av nickel affinitetsharts, så ett maximum av ~ 25 mg / L fusionsprotein som kunde detekteras i detta experiment.

Figur 6A visar elektroforesresultatet från Caliper LabChip systemet (visar fusions före klyvning) och poängsystem baserat på extrapolering för att ge i mg / L kultur av fusionsproteinet (i halter av 0,1 till 2 mg / l kultur, 2 till 10 mg / l kultur, 10 till 25 mg / L kultur och ingen t upptäckts.) Notera att den kluvna DsbC taggen löper normalt på cirka 32 kDa, snarare än 27 kDa som förväntat. På samma sätt DsbC fusioner kör också omkring 5 kDa högre än väntat. För en hel del av de mål som vi inte bara ser den intakt fusion (övre bandet), men också den fusionspartner ensam (undre bandet). För några av dessa mål att optimera odlingsbetingelser kan förbättra förhållandet mellan den intakta fusions (övre band) i jämförelse med DsbC ensam tillåta en ökning av det slutliga utbytet. Poäng bygger enbart på graden av intakt fusion. Endast 16 av 96 proteiner kunde inte upptäckas vid fusionsnivå. Detta motsvarar en total framgång nivå av 83%. Av de 80 proteiner som kunde detekteras, 45 av dessa påvisades i halter över 2 mg / L odling (56%). Beroende på målet och fusion, proteinutbyten är vanligtvis inom intervallet från 2 till 100 mg / l kultur (även om i detta exempel med användning av protokollet 8,2 B maximalt ~ 25 mg / L fusionsproteinet kan detekteras).

t "> En analys av framgången med antalet disulfidbindningar före (visas i Figur 6B) visar rimlig framgång för alla nummer av disulfidbindningar testade (mellan 1 och 7), med den lägsta framgångsnivå på 66% för mål innehåller 6 disulfid obligationer. En analys av fördelningen av uttrycks framgång bygger på isoelektrisk punkt och antalet rester (som visas i figur 6C) visar ingen särskild bias för tekniken, med både framgångsrikt uttryckta mål och mål som inte identifierades utspridda över hela tomten.

Figur 6D visar ett exempel på de masspektrometriska erhållna resultaten från elektrospray joniserings masspektrometri (ESI-MS) för ett enda mål, före och efter reduktion av provet med DTT. Normalt skulle en sådan uttömmande analys masspektrometri inte behöver utföras (ett reducerat prov inte behöver analyseras), men i syfte att grundliga demonstration vi har visat både resultat. Målet som visas är en 5,7 kDa disulfid rika gift protein med 4 disulfidbindningar. Spektrumet till vänster visar resultaten för proteinet före reduktion med DTT, som det var efter klyvning och avsaltning utan ytterligare ingripande. Spektrat på den högra sidan visar protein efter reduktion med DTT, följt av avsaltning för avlägsnande av eventuellt överskott av DTT. Jonerna som motsvarar de experimentella massorna är markerade med pilar på spektrum och beteckningen för varje jon visas i grönt. De experimentella moder massorna som beräknats för dessa joner (för proteinet före reduktion (-DTT) och efter reduktion (+ DTT)) visas i tabellen. Massorna (5709,6 Da för provet före reduktion och 5717,6 Da för det reducerade provet) uppvisar en massa skillnad på 8 Da. En massskillnad av 2 Da motsvarar närvaron av en oxiderad disulfidbindning därför en massa skillnad av 8 Da indikerar närvaro av fyra disulfidbindningar (som väntat) idet icke-reducerade provet.

Figur 1
Figur 1. Schematisk bild av hög genomströmning uttryck screening protokoll. Med hjälp av detta protokoll, kan 96-384 villkor prövas av en enda person i en vecka med hjälp av manuella metoder, eller upp till 1,152 förhållanden med den beskrivna halvautomatiska maskiner. Expressionsplasmider konstrueras med användning av en rekombination kloningsteknik så att ett stort antal mål som kan vara sub-klonades på en gång. När lösliga uttrycksförhållandena har identifierats och klyvning utförs, om så önskas, kan proteinet vidare till kvalitetskontroll för att kontrollera oxidation och renhet, microassays och / eller storskalig produktion.

Figur 2 Figur 2. Schematisk för universell rekombinationskloning och konstruera design. Från målposten kloner kan flera expressionsvektorer subklonas i ett enda experiment i ett high throughput mode (upp till 6 x 96 inträdes kloner i en vecka). Det uttryckta proteinet kodar för en His-markör för nickelaffinitetsrening. Den DsbC (som saknar sin periplasmisk signalsekvens för cytoplasmatisk uttryck) fusionspartner används för att öka lösligheten och / eller stöd vikning och korrekt oxidation av målprotein. Observera att målet kodande sekvensen bör innehålla en N-terminal TEV-proteas stället (ENLYFQ) om taggen klyvning önskas. Den infällda bilden i det övre vänstra visar produktionen av inträdes kloner med användning av en donatorvektor och målsekvenserna, som kan erhållas genom PCR eller gensyntes. Entry-kloner kan också erhållas från kommersiella entryklonen samlingar. Flera rekombinationskloning system finns tillgängliga, men vi utnyttjar Gateway systemam, såsom visas i den schematiska.

Figur 3
Figur 3. Hög throughput screening rörledning för flera disulfid rika mål. Målen initialt uttrycks som HIS-DsbC fusioner i cytoplasman av BL21 (DE3) pLysS E. coli vid 37/17 ° C med hjälp av autoinduktion medium (ZYP-5052). Rening genomföres på nickel harts följt av detektion av lösliga konstrukt från HTP elektrofores (eller med dot blöt / SDS-PAGE). Om den första omgången av uttrycks screening misslyckas, är alternativa odlingsbetingelser försökt. Om konstruktioner producera lösliga proteiner i höga nog avkastning, microassays och kvalitetskontroll kan utföras och, om så krävs, kan storskalig produktion eftersträvas. För mål där lösliga avkastningen inte är tillräckligt hög, kan uttryck screening fortsätta med alternativa strateins och temperaturer då andra fusionspartners och periplasmatiskt uttryck. Valfria steg visas med streckade rutor.

Figur 4
Figur 4. Robot Worktable setup för HTP-plattformen. Layouten på vårt vätskehanteringsrobot arbetsbord visas, även om alternativa arbetsbord kan också användas under förutsättning att det finns likvärdiga platser tillgängliga. Installationen består av en tvättstation (WS) till (8-kanals vätskehantering huvud (Liha)), två mikrobärare med 4 lägen vardera (MP4, positionerna 1-4 och 5-8), en vakuumstation med 2 lägen (Te-Vacs, positionerna 9 och 10), en mikrobärare med 3 lägen (MP3, positionerna 11-13), två platt shakers med 2 lägen vardera (Te-Shakers, positioner 14-15 och 16-17) och en bärare för engångsspetsar med 3 lägen (DiTi, positioner 18-20). Förutom denre är två hotell bärare för djupbrunnsplattor och ett för mikroplattor (ej visat). Den installerade på vätskehanteringsrobot hårdvara är en 96-flerkanalig arm (MCA96) för användning med engångsspetsar, en 8-kanals vätskehanterande huvudet (Liha) med fasta spetsar och en robotmanipulator (Roma) som rör sig plattorna / utrustning runt om arbetsbordet. Numreringen av positionerna betecknas hela protokollet.

Figur 5
Figur 5. Schematisk för överföring från en enda 96-brunnsplatta i fyra 24-brunnsplattor.

Figur 6
Figur 6. Representativa resultat visas för expressionen skärm av 96 disul-rika venom proproteiner. Proteinerna uttrycktes som HIS-DsbC fusioner i cytoplasman och renas med hjälp av 50 pl Nickel harts (protokoll 8.2-B). A) Expression screening resultat, som visar virtuella gel och scoring för uttrycket avkastning. Kontrasten i den virtuella gel har justerats körfält till körfält för att kompensera för mycket svaga eller starka band. Observera att för vissa mål två band kan ses, det övre bandet motsvarar det intakta fusionsproteinet och det undre bandet motsvarande fusionstaggen ensam. B) Proportionen av proteiner uttryckta vid varje expressionsnivå jämfört med antalet av disulfidbindningar i proteinet. Det faktiska antalet proteiner i varje grupp är överlagrade på grafen. C) Fördelningen av uttrycksnivåer baserat på isoelektrisk punkt (pl) och antalet rester. D) Ett exempel på masspektrometri resultaten för en 5,7 kDa disulfid rika gift protein med fyra disulfidbindningar. Spektrumet påden vänstra sidan visar protein före reduktion med DTT och spektrumet på den högra sidan visar protein reducerades med DTT och avsaltades därefter. Jonerna som motsvarar de experimentella massorna är markerade med pilar och deras uppdrag visas i grönt. De experimentella massorna för proteinet före reduktion och efter reduktion visas i tabellen och uppvisar en massa skillnad på 8 Da, vilket motsvarar närvaron av oxiderat protein före tillsats av reduktionsmedel. Klicka här för att se en större version av denna siffra .

Komponent Recept Kommentar
ZY ~ 928 ml
10 g trypton
5 g jästextrakt
925 ml vatten
Blanda och sedan autoklav för att sterilisera. 2 M MgSO 4 100 ml
49,3 g MgSO 4 · 7 H2O
~ 60 ml vatten
Rör om tills det är upplöst sedan autoklav för att sterilisera.
50x 5052 1 L
250 g glycerol
730 ml vatten
25 g glukos
100 g α-laktos
Lägg i sekvens, rör om under värme tills allt löst sedan autoklav för att sterilisera.
20x NPS 1 L
900 ml vatten
66 g (NH4) 2 SO4
136 g KH 2 PO 4
142 g Na 2 HPO 4
Lägg i sekvens och rör tills allt löst sedan autoklav för att sterilisera.

Tabell 1. Recept på komponenter i ZYP-5052-medium.

Discussion

Det finns ingen enda universell protokoll för uttryck av lösliga, vikta, funktionella proteiner. För att vara kostnadseffektivt och tidseffektivt, de flesta laboratorier eller proteinkärnanläggningar som arbetar med flera mål använder därför hög genomströmning proteinuttryck screening för att hitta den bästa "generiska" kombination av variabler för att erhålla ett lösligt aktivt protein för de flesta målen. Vi har identifierat DsbC som en allmängiltig fusionspartner för lösliga uttryck av disulfid rika peptider och proteiner 11. Använda DsbC fusioner och hög genomströmning metoder, inom en vecka kan observeras den lösliga uttryck för flera mål 11 och sedan ytterligare variabler, t.ex. de som diskuterats i inledningen, kan screenas i efterföljande rundor på de mål som kräver ytterligare optimering. De protokoll som beskrivs häri är inriktade på expression av disulfid-rika proteiner och peptider. Men för användare som vill expRess icke-retikulerade proteiner i en hög genomströmning sätt, har de motsvarande protokoll som publicerats tidigare och kan hittas någon annanstans 22,24.

Den höga genomströmning inställning är idealisk för en rad tillämpningar, inklusive screening av ett stort antal olika proteiner för lösligt uttryck eller screening av ett stort antal uttryckskonstruktioner (inklusive olika fusions taggar) för flera mål gener samtidigt ( eller multipelexpressionskonstruktioner för ett enda mål) i syfte att förbättra andelen framgångsrika. Plattformen kan även användas för den riktmärkning och validering av nya protokoll på ett stort antal mål. Andra tillämpningar är screening av varianter för en enda svår mål, till exempel, alla ortologer eller medlemmar av samma familj, eller för att testa framgång för produktion av en panel av mutanter av ett enda mål i ett experiment. Detta protokoll har också använts i kombination med co-expressionsvektorer (with ett enda taggat protein) för att tillåta den pådragbara nedåt och preliminär karakterisering av protein-protein-komplex, följt av mer noggrann biofysisk analys för att bekräfta den korrekta komplexbildning och stökiometrin 33. Mängden protein renades är ibland lämplig för mikroanalyser (funktionstester, protein-DNA-34 eller protein-protein-interaktionsanalyser). Det finns flera fördelar med hög genomströmning uttryck screening strategi: (i) möjligheten att testa ett stort antal mål och ett stort antal variabler i ett enda experiment, (ii) begränsad batch-till-batch variation, (iii) enkelhet och arbeta på en mindre skala med hjälp av djupa brunnar, (iv) skalbarhet och reproducerbarhet i större skala, (v) möjligheterna till automatisering, och (vi) enkelhet i spårning och hantering (ingen märkning av enskilda rör, mindre misstag introduceras vid användning av plattformat än med behandling av enskilda rör i blandning eller utbyte av kloner).

24. För maximal effektivitet är det fördelaktigt att ha ett lämpligt system för hög genomströmning kloning, för att förenkla subkloning av ett stort antal mål. För den inledande fasen av VENOMICS projektet använder vi den mångsidiga Gateway rekombinationssystemet 25 som tillåter subkloning i alla destinationer vektor i en takt av hundratals kloner per vecka. Protokoll för Gateway rekombination kloning finns på Invitrogen webbplats. Andra alternativ för hög genomströmning kloning inkluderar ligation oberoende kloning (LIC) 35,36 och begränsning Fritt (RF) kloning 37. Det finns flera sätt att få de mål gener för uttryck, bland annat genom PCR från mall-DNA, från entryklonen samlingar eller somsyntetiska gener, vilket är den strategi som valts för VENOMICS projektet. Syntetiska gener kan beställas med rekombinationsställen på varje ände av genen och gensyntes medger enkel kodon optimering av målgen-sekvensen (för att utesluta sällsynta E. coli-kodoner). Detta rekommenderas men inte nödvändigt. För mål utan kodon optimering som innehåller ett stort antal sällsynta kodon, Rosetta 2 (DE3) pLysS (som bär tRNA för sällsynta kodon som inte är mycket uttrycks i E. coli) kan vara bättre lämpade än BL21 (DE3) pLysS. Även om det finns stammar som finns att begränsa minskningen av disulfidbindningar i den normalt reducerande miljö i cytoplasman, i våra händer de inte har varit så framgångsrika som vanliga E. coli-stammar 11.

Analytisk skala affinitetsrening utförs från provuttrycks kulturer för att återvinna de lösliga fusionsproteiner och kvantifiera avkastningen. Kvantitativa data kan erhållas på the lösliga utbyten av fusionsproteiner som uttrycks i intervallet 0,1 till 100 mg / L av kultur. Om ett mål inte är lösligt, kan alternativa uttryck och induktionstemperaturer, stammar eller media testas innan olika fusionspartners bedrivs. För lösligt uttryck för disulfid rika proteiner, tidigare rankad vi effekten av fusionspartners som DsbC> DsbA> GST> MBP> TRX> HIS-tagg för cytoplasmatisk uttryck 11. Periplasmisk uttryck är en annan möjlighet som kan hjälpa den framgångsrika vikning av disulfid rika mål. Periplasman är en mindre reducerande miljö än cytoplasman och innehåller nyttiga redox följeslagare att hjälpa disulfidbindning. DsbC, DsbA, och MBP-proteiner är normalt lokaliserad till periplasman av sina periplasmiska signalsekvenser. Detta ger möjlighet att utnyttja dessa taggar för att styra disulfid rika mål till periplasmautrymmet för att hjälpa vikning. För svår mål, skulle nästa steg vara att purify den olösliga HIS-märkta mål från inklusionskroppar, lösa och vik (detta är utanför ramen för detta protokoll och kommer inte att diskuteras här 3 9). Detta kan vara ganska enkelt för mål med endast en eller två disulfidbindningar, men blir allt svårare eftersom antalet disulfidbindningar ökar. Alternativt, och särskilt för proteiner och peptider med fyra eller flera disulfidbindningar, kan det vara fördelaktigt att försöka mer komplexa produktionssystem, såsom jäst-, insekts-eller däggdjursexpressions.

Med framsteg inom miniatyrisering och automation, kommer HTP elektro lab-on-a-chip-teknik 28 utan tvekan vara vägen för framtiden för funktionella analyser. Vi tänker oss att för de flesta ändamål (kanske med undantag av strukturstudier) kommer detta att förneka behovet av storskaliga kulturer. Småskaliga kulturer kommer inte bara att vara användbar för screening av expressionsförhållanden, men också att kunna tillhandahålla sufräckligt belopp av prov för dessa miniatyriserade funktionella analyser. Förmågan att producera multipla mål parallellt i tillräckliga mängder för funktionell karakterisering kommer att sänka kostnaderna för odling och användning av denna typ av plattformar kommer expression och karakterisering av rekombinanta proteiner att bli mer kostnads-och tidseffektiv.

De protokoll som häri har tillämpats på uttrycket av disulfid rika peptider och proteiner i den inledande fasen av FP7 Europeiska VENOMICS projekt. Gifter är en utmärkt källa till bioaktiva peptider som ofta har intressanta farmakologiska potential. Dock är deras produktion utmanande på grund av deras komplexa disulfid-bindningsmönster och liten storlek. Med hjälp av hög genomströmning plattformar som den som beskrivs häri, VENOMICS projektet syftar till att skapa ett bibliotek med 10.000 nya gift peptider för att återge mångfalden observerats i naturen. Detta bibliotek kommer att utnyttjas för karakterisering av disulfid-rich peptider med potential farmakologiska eller terapeutiska tillämpningar med syfte att utveckla nya läkemedel. Plattformen används för närvarande för benchmarking och validering av nya protokoll för användning i VENOMICS projektet.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av The VENOMICS projektet europeiska projektbidrag nr 278346 genom det sjunde ramprogrammet (FP7 HÄLSA 2011-2015). Den VENOMICS Projektet är ett samarbete mellan flera forskningsinstitut och företag i Europa:

AFMB, Aix-Marseille Université (Frankrike), CEA Saclay (Frankrike), NZYTech (Portugal), SistemasGenomicos (Spanien), Universitet de Liège (Belgien), VenomeTech (Frankrike), Vitamib (Frankrike), Zealand Pharma (Danmark)

Detta arbete stöddes av den franska infrastruktur för integrerad strukturbiologi (FRISBI) ANR-10-InSb-05-01.

Författarna vill också tacka Mr Jeremy Turchetto för att hjälpa till med förberedelserna för inspelningen av videon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot Tecan Group Ltd. Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates.
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8
96-well PCR (PCR96) plates Greiner Bio-One 652270 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/
LB medium Autoclaved for sterility.
Antibiotic stocks Kanamycin (50 mg/ml), ampicillin (100 mg/ml), chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at −20 °C. Use a 1:1,000 dilution.
Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity Greiner Bio-One 780270 Autoclaved for sterility.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/
Expression vectors For the expression of target constructs. Store at −20 °C.
BL21 (DE3) pLysS competent cells Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C.
Breathseal breathable adhesive film Greiner Bio-One 676050
PCR machine with 96-well plate block For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.
24-well sterile tissue culture plates Greiner Bio-One 662165 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/
LB-agar Autoclaved for sterility.
200 μl sterile disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 617 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Multitron shaking incubator, with 3 mm throw Infors AJ103 Not essential, a regular shaking incubator can also be used.
http://www.infors-ht.com/index.php/en/
Plate incubator
Microtiter plate For glycerol stocks and elution using purification protocol B.
Glycerol For the preparation of glycerol stocks.
200 μl disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 616 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Adhesive tape pads  Qiagen 19570 http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads
Bactinyl Orapi Group Or equivalent microbial disinfectant.
ZYP-5052 medium See Table 1 for recipes of components.
Deep well 24 (DW24) plates, 10 ml capacity Whatman 7701-5102 Autoclaved for sterility.
http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102
Flat-bottomed, clear microtiter plate Greiner Bio-One 655101 For absorbance readings.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/
Plate reading spectrophotometer Optional. For measuring OD600 of cultures.
Centrifuge with rotor for deep well plates  Suitable for 3,800 x g.
Lysozyme 50 mg/ml in water. Store at −20 °C.
Imidazole ACS grade Merck IX0005-1 A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.
Lysis buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.
Water bath
Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) Misonix Inc. Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.
DNase  2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C.
Magnesium sulphate (MgSO4) 2 M stock in water, autoclaved.
SDS-PAGE or Caliper sample buffer 
Binding buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Wash buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Elution buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity Macherey-Nagel 740686.4 http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx
200 μl disposable wide bore tips Tecan Group Ltd. 30 050 348 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Ni Sepharose 6 Fast Flow resin GE Healthcare 17-5318-02 For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use.
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802
Tobacco Etch Virus (TEV) protease Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C.
96-well 0.22 µm filter plate Millipore MSGV N22 10 Optional. To filter the soluble fraction after cleavage.
http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210
SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion.
Spectrophotometer and cuvettes For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.
ZipTip pipette tips Millipore Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control.
http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0
Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berrow, N. S., et al. Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).
  2. Correa, A., Oppezzo, P. Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening. Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).
  3. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5, 135-146 (2008).
  4. Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).
  5. Graslund, S., et al. The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins. Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).
  6. Bird, L. E. High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli. Methods. 55, 29-37 (2011).
  7. Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).
  8. Kapust, R. B., Waugh, D. S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).
  9. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).
  10. Marblestone, J. G., et al. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO. Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).
  11. Nozach, H., et al. High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli. Microb Cell Fact. 12, 37 (2013).
  12. Sachdev, D., Chirgwin, J. M. Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification. Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).
  13. Smith, D. B. Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies. Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).
  14. de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
  15. Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli. Microb Cell Fact. 9, 67 (2010).
  16. de Marco, A. Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria. Microb Cell Fact. 11, 129 (2012).
  17. Katzen, F., Beckwith, J. Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli. Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).
  18. Klint, J. K., et al. Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli. PloS One. 8, e63865 (2013).
  19. Braud, S., et al. Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins. Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).
  20. Douzi, B. G. A., et al. A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry). Advances and new technologies in toxinology. 149-152 (2010).
  21. Groisillier, A., et al. MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms. Microb Cell Fact.. 9, 45 (2010).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55, 65-72 Forthcoming.
  23. Xiao, R., et al. The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).
  24. Saez, N. J., Vincentelli, R. Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli. Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology. Chen, Y. W. 1091, Humana Press. 33-53 (2014).
  25. Katzen, F. Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system. Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
  26. Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format. Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).
  27. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).
  28. Spencer, C. I., et al. Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics. Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).
  29. Sala, E., de Marco, A. Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography. Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).
  30. Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction. Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).
  31. Zanier, K., et al. Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins. 339, Science. New York, N.Y. 694-698 (2013).
  32. Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. The P1' specificity of tobacco etch virus protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).
  33. Vincentelli, R., Romier, C. Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex. Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).
  34. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  35. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).
  36. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  37. van den Ent, F., Lowe, J. RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).
  38. Vincentelli, R., et al. High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies. Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics