High Throughput Screening Kwantitatieve Expressie en zuivering Toegepast op Recombinant Disulfide-rijke Venom eiwitten die in
1Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB), Aix-Marseille Université, 2iBiTec-S, Service d'Ingénierie Moléculaire des Protéines (SIMOPRO), Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives (CEA) Saclay, France

Published 7/30/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Een protocol voor de kwantitatieve, high throughput screening expressie en analytische zuivering van fusie-eiwitten uit kleinschalige Escherichia coli culturen wordt beschreven en toegepast om de expressie van disulfide-rijke dierlijke gif eiwit targets.

Cite this Article

Copy Citation

Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli. J. Vis. Exp. (89), e51464, doi:10.3791/51464 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Escherichia coli (E. coli) is de meest gebruikte expressiesysteem voor de productie van recombinante eiwitten voor structurele en functionele studies. Echter, zuiveren eiwitten soms moeilijk omdat veel eiwitten worden uitgedrukt in een onoplosbare vorm. Bij het werken met moeilijke of meerdere doelen is daarom raadzaam om high throughput (HTP) eiwitexpressie screening op kleine schaal (1-4 ml culturen) gebruiken om snel de voorwaarden voor oplosbare expressie te identificeren. Om te gaan met de verschillende structurele genomics programma's van het lab, een kwantitatieve (binnen een bereik van 0,1-100 mg / L cultuur van recombinant eiwit) en HTP eiwitexpressie screening protocol is geïmplementeerd en gevalideerd op duizenden eiwitten. De protocollen zijn geautomatiseerd met gebruik van een vloeistofverwerking robot, maar kan ook handmatig worden uitgevoerd zonder gespecialiseerde apparatuur.

Disulfide-rijke gif eiwitten winnensteeds meer erkenning voor hun potentieel als therapeutische drug leads. Zij kunnen zeer krachtige en selectieve, maar hun complexe disulfidebinding netwerken ze moeilijk te produceren. Als lid van de Europese FP7 Venomics project ( www.venomics.eu ), onze uitdaging is om succesvolle productie strategieën te ontwikkelen met het doel de productie van duizenden nieuwe gif eiwitten voor functionele karakterisering. Geholpen door de redox eigenschappen van disulfidebinding isomerase DsbC, passen wij onze HTP productie pijpleiding voor de expressie van geoxideerd, functionele gif peptiden in E. coli cytoplasma. De protocollen zijn ook voor de productie van verschillende disulfide-rijke eiwitten. Hier laten we pijpleiding voor het produceren van dierlijke eiwitten gif. Met de hierin beschreven protocollen is het waarschijnlijk dat oplosbaar disulfide-rijke eiwitten worden verkregen in slechts een week. Zelfs een kleine schaal, is er de mogelijkheid om e gebruikene gezuiverde eiwitten voor het valideren van de oxidatietoestand door massaspectrometrie, voor de karakterisering in pilotstudies of voor gevoelige micro-assays.

Introduction

Gemotiveerd door de vooruitgang van de genomica en versneld tempo van de ontdekking van nieuwe eiwitten, zijn hoge doorvoer leidingen ontwikkeld om de traditionele benaderingen voor de screening en identificatie van optimale eiwitproductie strategieën parallelize. Potentiële variabelen te optimaliseren omvatten, maar zijn niet beperkt tot, variërende expressie stammen 1,2, temperatuur 3,4, 2,3 media, doel varianten 5, fusiepartners 6-13, co-expressie met chaperones 14,15, cytoplasmatische of periplasmische expressie 16-18, en zuivering bufferbestanddelen 3. Door de implementatie van high-throughput benaderingen, veel variabelen of veel doelen kunnen parallel worden getest met een hoog rendement, terwijl het beperken van batch-to-batch variatie. In onze ervaring, de strategie geeft ook goede reproduceerbaarheid bij opschaling met dezelfde cultuur (temperatuur, media, airconditioning, enz.) en zuivering omstandigheden (dezelfde resin, buffers, enz.). Verschillende high throughput platforms zijn in het afgelopen decennium de voorwaarden bepalen voor oplosbare eiwitexpressie, namelijk door het variëren van parameters als fusiepartners, expressie stammen of temperatuur 19-23.

We hebben onlangs gebruikten de high throughput screening benadering voor de expressie van oplosbare disulfide-rijke eiwitten 11. De geselecteerde eiwitten waren niet alleen giftig bronnen, maar ook disulfide-rijke remmers van diverse soorten waaronder planten, varkens, koeien en mensen. Het experiment werden de effecten van 12 verschillende fusiepartners en drie verschillende expressie spanningen op de oplosbaarheid en vouwing van 28-disulfide verknoopt eiwitten. We hebben aangetoond dat het gebruik van DsbC als fusiepartner voor de productie in de stam BL21 (DE3) pLysS enorm outproduced (in zowel opbrengst en het aantal oplosbare eiwitten verkregen) een andere combinatie van stam en fusie getest 11. Deresultaten van dit experiment vormde de basis voor het aanpassen van onze oorspronkelijke algemene hoge doorvoer pijpleiding (die is gebruikt voor de expressie screening van een groot aantal eiwitten) 22,24 in een meer geschikt voor de expressie van disulfide-rijke doelen. Disulfide-rijke eiwitten uit dierlijke giffen zijn van bijzonder belang. Vergiften zijn een complex mengsel van bioactieve peptiden en eiwitten, met potentiële waarde farmacologisch en therapeutisch. Expressie van disulfide-binding bevattende eiwitten is niet triviaal. Deze eiwitten bevatten in het algemeen tussen 6:59 disulfidebindingen en worden geoxideerd met de juiste disulfide-binding patronen om actief te zijn. Momenteel is het platform wordt gebruikt voor het screenen van de expressie van een groot aantal disulfide-rijke dierlijke eiwitten gif kader van KP7 Europese VENOMICS Project (www.venomics.eu) en benchmarking nieuwe protocollen voor hoge doorvoer expressie van duizenden doelen . Hier, een geautomatiseerde methodeis voorzien high throughput kleinschalige expressie screening en zuivering (zie figuur 1) die aan disulfide-rijke dierlijke eiwitten gif. De strategie voor disulfide rijke peptiden en eiwitten gebruikt een HIS-tag voor zuivering en de redox-actieve fusiepartner, DsbC, creëren splitsbare HIS-DsbC fusies met de eiwitten (zie figuur 2).

Hoewel de focus van de protocollen die hierin is automatisering met behulp van een vloeibare handlingrobot en HTP elektroforese, deze methoden zijn ook geschikt voor een high throughput handmatige aanpak, wat betekent dat zelfs laboratoria met een basisconfiguratie kunnen profiteren van de protocollen zonder enige voorwaarde voor dure apparatuur . Handmatige protocollen voor transformatie zuivering en analyse (niet specifiek voor disulfide-rijke eiwitten) zijn elders gepubliceerd 24 en wordt hier niet herhaald. De doorvoer van de handmatige procedure (van expressie kloon, geproduceerd door recombinatienationale klonen 25, de analyse van oplosbaar eiwit levels) is 96 (met SDS-PAGE detectie) of 384 (4 x 96, met dot-blot en SDS-PAGE 26) culturen per week (zie figuur 1). Dit kan worden verhoogd als die in een semi-geautomatiseerde manier (met behulp van een vloeibare handlingrobot en dot blot 26 of HTP elektroforese, zoals met een schuifmaat GXII LabChip systeem 22 analyse van de resultaten) tot maximaal 1.152 (12 x 96) culturen parallel dan een week, zoals hierin beschreven. Het kweken wordt uitgevoerd in deepwell 24 (DW24) formaat zodat regelmatig schudden incubators kan in tegenstelling culturen gekweekt in deepwell 96 (DW96) formaat, dat het gebruik van korte orbitale snelle schudden incubators voldoende beluchting noodzakelijk (schudden 800 rpm). Het gebruik van auto-inductie media 27 vereenvoudigt ook expressie, waardoor de handleiding inductie stap. Zelfs wanneer laboratoria vooraf gedefinieerde expressie en puri maken al gebruikficatie omstandigheden kunnen deze direct in de HTP systeem overgebracht gewoon efficiëntie. Een gedetailleerd schema van de high throughput screening pijpleiding disulfide-rijke eiwitten wordt verschaft in Figuur 3. De parameters geschrapt werden geselecteerd op basis van uitgebreide screening experimenten 11, 22, waardoor we de nuttigste voorwaarden voor eiwitproductie te kiezen.

Karakterisering kan worden uitgevoerd op gelabelde eiwitten direct gezuiverd uit kleinschalige uitingen in modelstudies waar tientallen microgram steekproef voldoende is, of voor gevoelige functionele assays en bindingsbepalingen (bijvoorbeeld een laag volume HTP patchklem systemen 28). Hetzelfde kan ook worden uitgevoerd op de ongemerkte doelstellingen na splitsing, mits de tag protease verwijderd (bijvoorbeeld door omgekeerde fase HPLC). Kwaliteitscontrole kan ook worden uitgevoerd door massaspectrometrie (om de verwachte grootte en oxidatie st bevestigenaten) of chromatografische methoden (om de zuiverheid of heterogeniteit te bevestigen) 29. Soms taggen decollete is niet nodig of zelfs ongewenst (vooral bij slecht oplosbare eiwitten 30,31), dus in dit protocol decollete is optioneel. Ongeacht, alle constructen is er een TEV protease splitsingsplaats (ENLYFQ / [G] 32) direct voorafgaand aan het doelgen natief eiwit na splitsing (zie figuur 2 en discussie). Bij splitsing van het fusie-tag gewenst, kan splitsing worden getest (de elutie fractie of "over kolom) en het kleine schaal efficiënt analyseren optimale voorwaarden indien nodig en het verkrijgen van betrouwbare schattingen van de opbrengsten voor verdere opschaling experimenten.

Er zijn twee mogelijkheden voor de hoeveelheid korrels tijdens de affiniteitszuivering, afhankelijk van de doelstellingen en verwachtingen van het experiment. Om te kunnen om zo veel eiwit te vangen mogelijk (te zuiveren voor proef testen of MS, of extrapolaten opschaling rente) een eindvolume van 200 pl hars te gebruiken, waardoor detectie van oplosbaar eiwit in het traject van 1-100 mg / L kweek voor verzadiging van het systeem (zie protocol (A) in paragraaf 8.1) . Indien het doel van het experiment is de detectie van geringe hoeveelheden oplosbare eiwitten dan een eindvolume van 50 pl hars geschikt is, waardoor detectie van oplosbaar eiwit in het traject van 0,1-25 mg / L kweek (zie protocol (B ) in paragraaf 8.2).

De productie kan worden opgeschaald eventueel tot milligram hoeveelheden gezuiverd doelen te vinden voor verdere structurele en functionele studies met de geïdentificeerde voor oplosbare expressie voorwaarden. De details van opschaling protocollen gebruikt AFMB zijn elders 22,24 besproken.

Verdere details aan de experimentele opstelling, kritische stappen in het protocol relevant zijn wijzigingen en trouble-shooting en de beperkingen van de techniek die in de schijfussion. Lees de discussie alvorens tot experimenten.

Gedurende de protocollen we verwachten slagingspercentage van 90% bij elke stap (bijvoorbeeld ten minste 90% van de kweken moet groeien op ieder stap). Als het succes van een stap in de proef beneden 90% van de monsters verwijderd en het experiment wordt herhaald voor de volledige collectie van constructen. Echter, dit succes is niet van toepassing op het aantal constructen die als oplosbare eiwitten of het aantal constructen die klieven met 100% rendement expressie, omdat dit sterk afhankelijk van de geteste eiwitten zijn.

De specifieke details voor de set-up van de robot werktafel zijn voorzien voor elk protocol (zie ook figuur 4), maar ze kunnen worden aangepast zoals vereist voor alternatieve werktafel set-ups. De robot hardware (Tecan) bestaat uit een 96-meerkanaals arm (MCA96), robot manipulator (Roma) en de 8-kanaals liquid handling hoofd (Liha). Alle stappen met behulp van de MCA96 kan ook worden uitgevoerd met de liha als een MCA96 niet beschikbaar, maar ze zullen langer duren omdat de liha moet worden gewassen tussen de stappen. Terwijl de robot is technisch niet een steriele omgeving, de opname van antibiotica algemeen voor zorgen dat er geen problemen met verontreinigingen of steriliteit.

Protocol

Deel A: Transformatie en Test Expression

Handmatige procedures voor klonering 22 en transformatie gezuiverd worden elders 24 besproken. De transformatie protocol kan volledig worden uitgevoerd op de robot 26, maar het is meestal tijdsefficiënte handmatig te doen. Daarom is de protocollen hierin beginnen vanaf de enting van de expressie precultures en plating van de transformatie van het vuur geschokt transformatie mengt handmatig gedaan. Voor meer informatie over de handmatige klonen en transformatie procedures zie de relevante verwijzingen 22,24.

1. Precultures en Plating

  1. Bereid de robot werktafel (zie figuur 4 voor functies):
    1. Zet een 300 ml buis met 150 ml steriel LB-medium (aangevuld met ampicilline (100 ug / ml) / chlooramfenicol (34 ug / ml), of andere geschikte antibiotica) op positie 8.
    2. Zet een steriele DW96 op positie 11. Put 4x voorbereide 24-well LB agar (Amp / Cam) weefselkweek platen (met 2 ml agar in elk putje) met hun deksels op in de posities 14 tot 17.
    3. Plaats de transformatie plaat (met de 96 transformatie mengt na hitteschok) op positie 13. Dit wordt gebruikt om de vloeistof precultures en LB agarplaten inoculeren. Zet een doos van steriele 200 ul pipet tips op positie 18.
  2. De 96-meerkanaals arm (MCA96) en 200 gl tips, aspireren 200 pi LB-bouillon (positie 8), en afzien in de DW96 op positie 11. Herhaal tot er een eindvolume van 1 ml LB-medium in elk putje van de DW96. Dit zal de vloeistof voorkweek worden.
  3. Met behulp van de robot manipulator (Roma), verwijder het deksel van de eerste 24-well LB agar plaat en zet deze elders (bijvoorbeeld in een hotel drager) totdat de beplating is voltooid voor die plaat.
  4. Met behulp van de 8-kanaals vloeistof handling (liha) hoofd, meng vervolgens aspireren 50 pl thij eerste kolom van de transformatie mengsel op positie 13. Dit volume transformatie mengsel net genoeg om de LB-Agar goed bedekken.
  5. Met de eerste 4 kanalen afgeven op de eerste kolom van de eerste 24 putjes LB agar plaat op positie 14 (zie figuur 5).
  6. Met de laatste 4 kanalen, afzien op de tweede kolom van de eerste 24-well LB agar plaat.
  7. Was alle tips grondig na doseren.
  8. Herhaal dit proces totdat alle transformaties zijn bedekt op de eerste plaat op positie 14, de overdracht van 96 - tot 24-wells met behulp van de bedrijfstoeslagregeling waarin is voorzien in figuur 5.
  9. Zodra de eerste plaat is voltooid, gebruikt u de Roma naar het deksel vervangen en verwijder het deksel van de volgende plaat op positie 15. Beweeg met de beplating regeling voor de komende 3 platen.
  10. Zodra plating gedaan is, stelt de Te-Shake tot 1.200 tpm en schud alle platen gedurende 1 minuut tot een homogene verdeling van de transformatie mix hebben. Met behulp van de MCA96 en de originele pipet tips, meng dan aspireren 60 ul van de resterende transformatie mix (positie 13) en afzien in de DW96 met LB-bouillon op positie 11.
  11. Dicht de DW96 precultures met ademende zelfklevende folie aan cultuur beluchting mogelijk te maken.
  12. Plaats in een 37 ° C incubator schudden op maximale snelheid O / N (200/800 rpm afhankelijk van shaker orbitaal).
  13. De LB-agar-platen moeten in een kap met hun deksels worden geplaatst af te drogen (10 min). Daarna worden ze omgekeerd geplaatst in een 37 ° C incubator plaat tot de volgende ochtend.
  14. De volgende dag wordt de voorkweek gebruikt om de test expressie in auto-inductie medium en voor de bereiding van glycerol voorraden inoculeren. Zet de agarplaten in een koelkast, een back-up. Indien nodig, vanaf de agar platen of de glycerol voorraden, de test uitdrukking zou opnieuw kunnen worden gedaan door het enten van een frisse LB precultuur direct.

2. Voorbereiding van de DW24 Zyp-5052 Plates

OPMERKING: Deze procedure duurt ongeveer 5 minuten in te vullen voor elke set van 4x DW24 platen.

  1. Vul 500 ml Zyp-5052 auto-inductie medium voor elk exemplaar van 96 kweken (464 ml ZY medium, 250 gl 2 M MgSO4, 10 ml 50x 5052, 25 ml 20x NPS, in die volgorde - recepten voor elke component in tabel 1) aangevuld met de juiste antibiotica.
  2. Bereid de robot werktafel:
    1. Plaats twee 300 ml troggen, elk ~ 250 ml medium op positie 5 en 6. Zet vier steriele DW24 platen op posities 14 tot 17. Put 200 pl gesorteerd op positie 18.
  3. Met behulp van de MCA96 en 200 ul tips, aspireren 200 ul van Zyp-5052 van positie 5 en afzien in de eerste DW24 plaat op positie 14. Doe dit in totaal 5 keer (4 tips zal afzien in een enkele, goed in een keer voor een totaal 4 ml). Herhaal dit voor de resterende 3 x DW24 platen op de posities 15 tot 17, schaching aan de Zyp-5052 op positie 6 voor de laatste twee DW24 platen.

3. Inenting en de groei van de Test Expression Cultures

OPMERKING: Inenting duurt ongeveer 10 minuten in te vullen voor elke set van 4x DW24 platen, en de groei gaat door O / N.

  1. Bereid de robot werktafel:
    1. Leg de DW96 plaat met de precultures (uit stap 1.15) op positie 11. Leg de vier DW24 platen die Zyp-5052 medium (uit stap 2.3) op de posities 14 tot 17.
  2. De liha verzamelbak 100 pl voorkweek van positie 11 naar test expressie kweken (1/40 verdunning) inoculeren met de regeling in figuur 5. Was de liha kop grondig in het wasstation tussen elke kolom van de 96-well precultures.
  3. Verzegel de DW24 platen met ademende film en incubeer bij 37 ° C onder schudden (200/400 rpm) gedurende 4 uur. Dit is de tijd van de groeifase waarin glucose van het medium bij voorkeur zal worden uitgeput 27.
  4. Verlaag de temperatuur tot 17 ° C. Na de 4 uur en uitputting van glucose, lactose zal beginnen te worden gemetaboliseerd, wat leidt tot inductie van meningsuiting, het verstrekken van de optimale groeiomstandigheden voor BL21 (DE3) pLysS of Rosetta 2 (DE3) pLysS, in dit werk 22. Laat de cellen om O / N. uiten Gebruik de resterende precultuur om glycerol voorraden maken.

4. Bereiding van glycerolvoorraden

OPMERKING: glycerol voorraden worden in drievoud worden opgeslagen op verschillende locaties bij diepvriezer storing.

  1. Bereid de robot werktafel:
    1. Zet microtiterplaten op positie 5 tot 7 de glycerolvoorraden huisvesten. Zet een 300 ml bak gevuld met 50 ml 100% glycerol op positie 8. Leg een DW96 met 800 pl precultuur (na stap 3.2) in elk putje op positie 11. Put 200 pl gesorteerd op positie 18.
  2. Met een slow aspiratie en doseren snelheid, gebruik maken van de MCA96 en 200 ul tips om glycerol toe te voegen in de DW96 met de precultures.
    1. Verzamelbak 200 pi glycerol (van positie 8).
    2. Pipetteer 150 ul (op positie 11), daarna pauzeer 20 seconden om de resterende glycerol onderaan de punt bereiken. Breng de resterende 50 pl.
  3. Met dezelfde tips, meng de cultuur en glycerol in de DW96 op positie 11 tot ze goed gemengd zijn. De uiteindelijke concentratie van glycerol is 20%. Aspireren 140 ul van de DW96 en afzien in de eerste microtiterplaat op positie 5.
  4. Herhaal stap 4.3 voor elke resterende microtiterplaat (posities 6 en 7).
  5. Seal elke microtiterplaat met plastic plakband en bewaar bij -80 ° C. Gooi de resterende cultuur in de DW96, ontsmetten met een antimicrobieel middel voor verwijdering.

5. Beoordelen van de groei van de culturen

600 is meestal hetzelfde voor de meeste culturen (ongeveer 12 onder deze omstandigheden) echter elke cultuur die niet worden opgemerkt.

  1. Neem 50 pi van elke cultuur (uit stap 3.4) en afzien in een platte bodem, duidelijk microtiterplaat met 150 pl medium.
  2. Meet de OD 600, rekening houdend met de 4-voudige verdunning. Als die er zijn die niet erg goed gingen groeien, noteer deze voor de uiteindelijke analyse.

6. Oogsten van de cellen

OPMERKING: Deze procedure duurt ongeveer 45 minuten in beslag.

  1. Centrifugeer de 4x DW24 platen (uit stap 3.4) bij 3000 xg gedurende 10 min dan de bovenstaande vloeistof in een afvalcontainer met een antimicrobieel middel. Tik op de platen, upside-down, op absorberend papier om overtollig medium te verwijderen.
  2. In de tussentijd bereiding van 100 ml lysisbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8, of andere gewenste buffer) bevattende lysozym (eindconcentratie 0,25 mg / ml).
  3. Bereid de robot werktafel:
    1. Zet de lysis buffer in een 300 ml trog op positie 5. Leg een schone DW96 op positie 11. Leg de 4 x DW24-platen die de cel pellets (uit stap 6.1) op de posities 14-17. Zet 200 ul tips op positie 18.
  4. Met behulp van de MCA96 en 200 ul tips, aspireren 125 ul van lysis buffer van positie 5 en afzien in elk DW24 plaat (posities 14-17). Herhalen. OPMERKING: 4 tips zal afzien in een enkele, goed in een keer voor een uiteindelijk volume van 1 ml in elk putje van de DW24 platen.
  5. Schud de platen op posities 14-17 met de Te-Shake (1000 rpm) gedurende 15 minuten om de pellets mengen.
  6. Nadat de pellets worden geresuspendeerd, gebruiken de eerste 4 kanalen van de liha 550 pl zuigen uit monsters 1 tot 4 (de eerste kolom van de eerste DW24, op positie 14), vervolgens de last 4 kanalen van de liha verzamelbak 550 ul monsters 5 tot 8 (de tweede kolom van de eerste DW24). Afzien in de eerste rij van de DW96 op positie 11.
  7. Herhaal stap 6.6, zodat alle celsuspensie wordt overgebracht naar de DW96.
  8. Na elke reeks monsters was de liha tips in de was station.
  9. Herhaal stap 6,6-6,8 voor elke kolom in elk DW24 plaat (posities 15-17) met de regeling in figuur 5. Verbinding met plastic folie.
  10. Voor zuivering op dezelfde dag of op korte termijn invriezen, bewaar bij -80 ° C gedurende ten minste 1 uur, of anders bij -20 ° C.

Deel B: Zuivering en analyse

7. Cell Lysis

OPMERKING: Deze procedure duurt ongeveer 60 minuten in beslag.

  1. Ontdooi de bevroren celsuspensies (uit stap 6.10) in een waterbad (bij kamertemperatuur of 37 ° C) gedurende ongeveer 15 minuten en resuspendeer in de schudincubator voor eenANVULLENDE 10 minuten. De culturen moeten stroperig.
  2. Neem 500 ul van DNase voorraad en meng het met 1 ml MgSO4 voorraad. Handmatig met een 8-kanaals pipet of de robot liha, afzien 15 pl in elk putje van de DW96, tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml DNase en 20 mM MgSO4 geven.
  3. Re-verzegeling van de plaat met plastic tape en schud nog eens 15 minuten. Op dit punt de kweken niet-viskeus moet zijn. Controleer zorgvuldig (visueel onderzoek) dat alle culturen zijn niet meer viskeuze. Opmerking: Dit is essentieel, als sommige culturen nog viskeus (bijvoorbeeld als het DNase per ongeluk vergeten of verkeerd afgeleverd in sommige putjes), de filter verstoppen, genereren van een ongelijke druk op de monsters en overloop of volledige verstopping van de filter plaat zou kunnen gebeuren tijdens de zuivering.
  4. Voor SDS-PAGE monsters van het gehele cellysaat, aspireren 10 ul lysaat en afzien in een 96-well plaat met PCR10 ul van 4x SDS-PAGE monsterbuffer en 20 pl water. Denatureren gedurende 3 min bij 95 ° C en vries tot analyse (Totaal fractie). Als een HTP elektroforese systeem beschikbaar is, kunnen de monsters worden geanalyseerd op deze plaats naar aanleiding van de fabrikant aanbevolen protocol voor de monstervoorbereiding. Voor meer details over de analyse van de monsters zie paragraaf 10.

8. Ni Affinity Purification

OPMERKING: Een langzame aspiratie snelheid moet worden gebruikt voor pipetteren alle hars schorsingen, zoals de schorsingen zijn vrij dik. Over het drogen van de hars leidt tot een vermindering bindingscapaciteit. Voor zuivering de gespecificeerde imidazool concentraties voor nikkel affiniteitshars. Als alternatief ionen (bijvoorbeeld kobalt) worden gebruikt, dan moeten de concentraties worden aangepast.

  1. A - Ni affiniteitszuivering voor detectie in het bereik van 1-100 mg / L (uiteindelijke hars volume = 200 ul)
    OPMERKING: Tzijn reiniging duurt ongeveer 1,5 uur in beslag, waardoor tot 4 in een dag kunnen worden uitgevoerd.
    1. Bereid de robot werktafel:
      1. Put 300 ml troggen met bindingsbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8), wasbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazool, pH 8) en elutiebuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool, pH 8) op de posities 6 tot 8, respectievelijk.
      2. Laat een lege 300 ml trog op positie 5 voor de harsslurry. Op positie 9 en 10 put plaat houders. Op positie 10 zet een DW96 met de SPE blok en filter / ontvanger plaat (20 micrometer) op de top.
      3. Plaats de DW96 met het lysaat (van stap 7.3) op positie 14. Op positie 18 en 19 zet de 200 ul wijde boring uiteinden en 200 ul uiteinden respectievelijk. Zet twee extra DW96 platen voor het wassen en elutie in een hotel. OPMERKING: Ze kunnen ook op een andere locatie worden gelegd op de werktafel of in een hotel niet beschikbaar is.
    2. Bereid 105ml in evenwicht 33% harsslurrie (35 ml hars + 70 ml bindingsbuffer). Voeg de harssuspensie aan de trog op positie 5 onmiddellijk voor het begin van de procedure.
    3. Met behulp van de MCA96 en 200 ul wijde boring tips (positie 18), meng de harsslurry op positie 5 grondig voor het aanzuigen en afgeven van 200 ul van harsslurrie in de DW96 met het lysaat op positie 14. Herhaal dit twee keer zodat 600 ul van harsslurrie werd toegevoegd aan het lysaat, het mengen van de hars suspensie voor elke aspiratie.
    4. Voer een 10 min mengstap met de MCA96 op positie 14 te kunnen binden en te voorkomen dat de hars pelleteren.
    5. Aspireren van positie 14 en verdeel 800 pl (in 200 pl percelen) op de filterplaat op positie 9, mengen vóór elke aspiratie anders het hars wordt onderaan de DW96 behouden.
    6. Zet het vacuüm op positie 10 gedurende ongeveer 90 seconden aan het lysaat door de plaat weer in deDW96 aan het verzamelen van de doorstroming, de zorg niet om uitdrogen van de hars. Zet de stofzuiger uit.
    7. Herhaal stap 8.1.5 en 8.1.6, zodat alle hars dan de filterplaat.
    8. Met behulp van de Roma-arm te bewegen de SPE blok die de filter plaat van positie 10 naar positie 9, zodat de volgende wasbeurt stap gaat rechtstreeks naar het afval en de overdracht van de DW96 met de flow-through op positie 10 naar een andere site (bijvoorbeeld in een hotel drager) tot het einde van de procedure.
    9. Met een nieuwe reeks van 200 pl voor (op positie 19), was de hars (op positie 9) met een totaal van 800 pi bindingsbuffer (van positie 6), en vacuüm toe te passen op positie 9, totdat de buffer doorlopen . Herhaal dit nog een keer.
    10. Gebruik de RoMa arm om een ​​nieuwe DW96 plaatsen op positie 10 van de 50 mM imidazol wassen verzamelen en verplaatsen van de SPE blok en filter plaat terug aan de top (positie 10).
    11. Voeg 800 ul van wasbuffer van positie 7 op positie 10, draai devacuüm op totdat de buffer gepasseerd is. Schakel de stofzuiger uit.
    12. Met de ROMA, verwijder de SPE blok en filter plaat in positie 9 en de DW96 met het wassen monster naar het hotel, en houd het opzij tot het einde van de procedure.
    13. Was de hars met nog eens 800 pi wasbuffer (van positie 7 op positie 9), van toepassing het vacuüm totdat de buffer gepasseerd is. Herhaal dit nog een keer.
    14. Gebruik de Roma naar een nieuwe DW96 plaatsen op positie 10 en plaats de SPE blok en filter plaat terug aan de top met de retentietijd te verzamelen.
    15. Voeg een totaal van 500 ui elutiebuffer (van positie 8 op positie 9) en incubeer in situ gedurende 3 minuten. Zet de stofzuiger totdat alle buffer gepasseerd is.
    16. Optioneel: Voor zeer uiten van eiwitten, een tweede elutie kan worden uitgevoerd in een frisse DW96 zoals in stappen 8.1.14 en 8.1.15.
    17. Monsters nemen van de doorstroom, wassen en elutie / s voor SDS-PAGE of HTP elektroforese.
      1. Voor HTP elektroforese monsters, volg dan de instructies van de fabrikant. Voor meer details over de analyse van de monsters zie paragraaf 10.
  2. B - Ni affiniteitszuivering voor detectie in het traject van 0,1-25 mg / L (uiteindelijke hars volume = 50 ul)
    Opmerking: Deze zuiveringsprocedure duurt ongeveer 30 minuten in beslag, waardoor tot 12 in een dag kunnen worden uitgevoerd.
    1. Bereid de robot werktafel:
      1. Put 300 ml troggen met bindingsbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8), wasbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol pH 8)en elutiebuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool, pH 8) op de posities 6 tot 8, respectievelijk.
      2. Laat een lege 300 ml trog op positie 5 voor de harsslurry. Op positie 9 en 10 put plaat houders. Op positie 10 zet een DW96 met de SPE blok en filter / ontvanger plaat (20 micrometer) op de top.
      3. Zet de DW96 met het lysaat (uit stap 7.3) op positie 14. Op positie 18 en 19 zet 200 ul wijde boring tips en 200 ul tips, respectievelijk. Zet een extra 96-wells microtiterplaat voor de elutie in een hotel. OPMERKING: Dit kan ook op een andere locatie die op de werktafel of in een hotel niet beschikbaar is.
    2. Bereid 50 ml in evenwicht 25% harsslurrie (12,5 ml hars + 37,5 ml bindingsbuffer). Voeg de harssuspensie aan de trog op positie 5 onmiddellijk voor het begin van de procedure.
    3. Met behulp van de MCA96 en 200 ul wijde boring tips (positie 18), meng de harsslurry op positie 5 grondig voor opzuigen en Vervennsing 200 pl hars slurrie in de DW96 met het lysaat op positie 14.
    4. Incubeer bij kamertemperatuur onder schudden met behulp van de Te-Shake bij 1400 rpm gedurende 10 min om binding mogelijk te maken.
    5. Aspireren van positie 14 en afzien van de volledige 1200 pl (in 200 pl percelen) met de wijde boring voor (positie 18) op de filterplaat op positie 10. Meng voor elke aspiratie anders het hars wordt onderaan de DW96 behouden.
    6. Schakel het vacuüm op op positie 10 voor ongeveer 30 seconden om het lysaat filteren door middel van de plaat in de DW96 aan het verzamelen van de doorstroming, de zorg niet om uitdrogen van de hars. Zet de stofzuiger uit.
    7. Met behulp van de Roma-arm, verplaats de SPE blok die de filter plaat van positie 10 naar positie 9, zodat de volgende wasbeurt stap gaat rechtstreeks naar het afval en de overdracht van de DW96 met de flow-through op positie 10 naar een andere site (bijvoorbeeld in een hotel drager) tot het einde van de procedure.
    8. Met de 200 μl voor (op positie 19), was de hars (op positie 9) met een totaal van 800 pi bindingsbuffer (van positie 6), en vacuüm toe te passen op positie 9 totdat de buffer gepasseerd is. Herhalen.
    9. Gebruik de RoMa arm om de verse DW96 plaatsen op positie 10 van de 50 mM imidazol wassen verzamelen en verplaatsen van de SPE blok en filter plaat terug aan de top (positie 10).
    10. Voeg 150 ul van wasbuffer van positie 7 op positie 10, zet het vacuüm op totdat de buffer gepasseerd is. Schakel de stofzuiger uit.
    11. Met de ROMA verwijder de SPE blok en filter plaat in positie 9 en de DW96 met het wassen monster naar het hotel, en houd het opzij tot het einde van de procedure.
    12. Was de hars met nog eens 800 pi wasbuffer (van positie 7 op positie 9), van toepassing het vacuüm totdat de buffer gepasseerd is. Herhalen.
    13. Gebruik de Roma naar de microplaat plaatsen op positie 9 en plaats de SPE blok en filter plaat terug aan de top te e verzamelene elutie.
    14. Voeg 190 pl elutiebuffer (van positie 8 op positie 9) en incubeer in situ gedurende 3 minuten. Breng het vacuüm totdat alle buffer gepasseerd is.
    15. Monsters nemen van de doorstroom, wassen en elutie voor SDS-PAGE of HTP elektroforese.
      1. Voor SDS-PAGE monsters van de doorstroom, afzien 10 pi in een 96-wells PCR-plaat met 10 ul van 4x SDS-PAGE monsterbuffer en 20 pl water. Voor SDS-PAGE monsters van de was-en elutie / s afzien 30 pi in PCR-platen met 10 ul van 4x SDS-PAGE sample buffer. Denatureren gedurende 3 min bij 95 ° C en vries tot analyse.
      2. Voor HTP elektroforese monsters, volg dan de instructies van de fabrikant. Voor meer details over de analyse van de monsters zie paragraaf 10.

9. Tag Splitsing (optioneel)

  1. Voeg de TEV protease (2 mg / ml) aan het geëlueerde eiwit (van stap 8.1.15 (en 8.1,16) of stap 8.2.14) in een verhouding van 1/10 (v / v).
  2. Incubeer bij kamertemperatuur (of 4 ° C voor de temperatuur-gevoelige eiwitten) O / N onder zacht schudden.
  3. Aan het einde van splitsing afzien 30 pi in een PCR-plaat met 10 ul van 4x SDS-PAGE sample buffer of volg de instructies van de fabrikant voor de HTP elektroforese monsters.
  4. Filter de resterende splitsing mengsel (van stap 9.2) via een 96-well filterplaat 0,22 urn en verzamel de oplosbare doorstroming in een DW96 door toepassing van vacuüm. Dit kan op een van de vacuüm locaties (bijvoorbeeld positie 10) op de vloeistofverwerking robot, zoals voor de elutie in paragrafen 8.1 en 8.2. Dit verwijdert alle eiwit dat neergeslagen tijdens decollete.
  5. Na filtratie afzien 30 pi in een PCR-plaat met 10 ul van 4x SDS-PAGE sample buffer of bereiden zoals HTP elektroforese monsters. Dit maakt de vergelijking van het eiwit voor splitsing, het mengsel na splitsing en soluble eiwit dat overblijft na splitsing en geeft goede aanwijzingen van de verwachte resultaten in de daaropvolgende schaal-up experimenten. Voor meer details over de analyse van de monsters zie paragraaf 10.

10. Analyse van de resultaten

  1. Identificeer de constructen tot expressie oplosbare eiwit door analyse van de zuivering monsters aan SDS-PAGE, dot blot of HTP elektroforesesysteem zoals Caliper LabChip.
    1. Analyseer de monsters elutie eerste constructen produceren van oplosbare proteïne te identificeren. In de meeste gevallen alleen de elutie monsters worden geanalyseerd als oplosbare constructen worden geïdentificeerd aan de tijd besteed aan de analyse te beperken.
    2. Als het eiwit niet in de elutie, lopen het wassen en doorstroming monsters te zien of het werd uitgedrukt en niet goed binden aan de hars.
    3. Voor constructen waarin geen oplosbaar eiwit kan worden gedetecteerd run het totaal cellysaat of de eiwit expressie.
      Opmerking: Een beperking is dat als de pprotein van belang niet boven de achtergrond expressie niveaus te presenteren, kan het niet mogelijk zijn om het eiwit te zien en kan leiden tot een vals negatief. Opgemerkt moet worden dat het altijd mogelijk is om eiwitten aan en neerslaan op de affiniteit hars en dit kan leiden tot een vals negatieve of onder-schatting van de opbrengst met de aanbevolen protocol (een zeldzame gebeurtenis in dit werk). Indien het eiwit precipiteert na elutie (witte pellet zichtbaar enkele minuten / uren na elutie) wordt aanbevolen de buffersamenstelling (bijv. zoutconcentratie) te veranderen en / of uitvoeren van een differentiële scanning fluorimetrie assay optimaliseren buffers. Een klein monster van de hars kan worden geresuspendeerd in SDS-PAGE monsterbuffer en gekookt om te detecteren of een eiwit wordt op de hars behouden.
    4. Als het eiwit niet werd uitgedrukt, maar de cellen heeft groeien, een nieuwe uitdrukking strategie voort te zetten, of als de OD 600 was niet hoog genoeg teruggroeien en opnieuw analyseren van de cultuur. >
    5. Bij splitsing monsters te analyseren, moeten ze worden geanalyseerd in een side-by-side wijze, zodat elke construct kan worden zichtbaar voordat een splitsing na splitsing in aangrenzende rijstroken, de analyse te vereenvoudigen.
  2. Tenzij volgens een methode die directe kwantificering van de elutie concentratie geeft, moet kwantificeren positieve monsters worden uitgevoerd door meting van de absorptie bij 280 nm (A280).
    1. Meet de A280, waarbij de extinctie coëfficiënt van het eiwit te houden en met de elutiebuffer als een spatie, een schatting van eiwitten op te leveren om de hoogste expressie oplosbare constructen identificeren.
    2. Voor de meest betrouwbare vergelijking van oplosbare opbrengsten, is het raadzaam om de opbrengsten te normaliseren door de dichtheid van de cultuur (met behulp van de OD 600 meting), die werd genomen in sectie 5. Als alle culturen groeide uit tot ongeveer dezelfde dichtheid, normalisatie is niet vereist.
e "> 11. Kwaliteitscontrole

  1. Monsters kunnen direct worden geanalyseerd vanuit de elutie of splitsing monster door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC / MS).
  2. Alternatief ontzouten eerst (imidazool en eventuele buffer zouten die aanwezig zouden kunnen zijn) met ZipTip pipetpunten of vloeistofchromatografie methoden, vervolgens analyseren met behulp van matrix geassisteerde laser desorptie / ionisatie time-of-flight (MALDI-TOF) en electrospray ionisatie ( ESI) massaspectrometrie.
  3. Kleine functionele studies kunnen worden uitgevoerd om te controleren of de functie van het eiwit is zoals verwacht. Als grotere hoeveelheden nodig zijn voor de functie, kan een opschaling cultuur worden gemaakt en de functie getest van de grotere cultuur eenmaal grootte en oxidatietoestand zijn bevestigd op de kleine schaal.

Representative Results

Representatieve resultaten worden getoond in Figuur 6 voor de expressie screening van 96 disulfide-rijke eiwitten van de VENOMICS pijpleiding. De eiwitten zijn gerangschikt toenemend aantal disulfidebindingen vervolgens toenemend aantal resten. De peptiden werden uitgedrukt in het cytoplasma met een HIS-tag en DsbC fusiepartner. Bij gebruik van de aanbevolen kweekomstandigheden, wordt een OD 600 van 12 normaal bereikt. De peptiden werden gezuiverd met behulp protocol 8.2-B met een eindvolume van 50 pl nikkel affiniteitshars, dus maximaal ~ 25 mg / l fusie-eiwit kan worden gedetecteerd in dit experiment.

Figuur 6A toont de resultaten van de elektroforese Caliper LabChip-systeem (met de fusie voor splitsing) en het scoresysteem gebaseerd op extrapolatie op in mg / L kweek van het fusie-eiwit (in niveaus van 0,1 tot 2 mg / L kweek, 2 10 mg / L kweek, 10 tot 25 mg / l cultuur en geen t gedetecteerd.) Merk op dat de gesplitste DsbC tag normaal draait op ongeveer 32 kDa, in plaats van 27 kDa zoals verwacht. Ook de DsbC fusies ook draaien rond 5 kDa hoger dan verwacht. Voor een groot deel van de doelstellingen zien we niet alleen de intacte fusie (bovenste band), maar ook de fusiepartner alleen (onderste band). Voor sommige van deze doelstellingen optimale kweekomstandigheden de verhouding van het intacte fusie (bovenste band) vergeleken DsbC alleen waardoor een toename van de uiteindelijke opbrengst kunnen verbeteren. Het scoresysteem is gebaseerd alleen op het niveau van intacte fusie. Slechts 16 van de 96 proteïnen kon niet worden gedetecteerd op het fusie-niveau. Dit betekent een algehele succes niveau van 83%. Van de 80 proteïnen die kunnen worden gedetecteerd, 45 daarvan werden gedetecteerd in concentraties van meer dan 2 mg / L kweek (56%). Afhankelijk doel en fusie eiwit opbrengsten zijn gewoonlijk in het traject van 2-100 mg / L kweek (hoewel in dit voorbeeld met het protocol 8.2 B maximaal ~ 25 mg / l fusie-eiwit kan worden gedetecteerd).

t "> Analyse van het succes door het aantal disulfide bindingen (figuur 6B) toont redelijk succes voor alle getallen disulfidebindingen getest (tussen 1 en 7), met de laagste succesniveau zijnde 66% voor doelen die 6 disulfide obligaties. Een analyse van de verdeling van uitdrukkingssucces basis van iso-elektrische punt en het aantal resten (figuur 6C) vertoont geen bijzondere voorkeur voor de techniek, zowel met succes tot expressie doelen en doelstellingen die niet werden waargenomen verspreid over de plot.

Figuur 6D toont een voorbeeld van de massaspectrometrie resultaten van electrospray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS) voor een enkel doel, vóór en na reductie van het monster met DTT. Normaliter zou een exhaustieve massaspectrometrie niet te worden uitgevoerd (een deelmonster niet moeten worden geanalyseerd), maar met het oog op een grondige demonstration we hebben laten zien beide resultaten. De getoonde doel is een 5,7 kDa disulfide-rijk gif eiwit met 4 disulfidebindingen. Het spectrum links toont de resultaten voor het eiwit voorafgaand aan reductie met DTT, aangezien het na splitsing ontziltingsinstallatie zonder verdere tussenkomst. Het spectrum aan de rechterkant toont het eiwit na reductie met DTT gevolgd door ontzouten om overtollig DTT verwijderen. De ionen die overeenkomt met de experimentele massa zijn aangegeven met pijlen op het spectrum en de aanduiding voor elk ion wordt getoond in groen. De experimentele massaspectrometrie berekend voor deze ionen (voor het eiwit voorafgaand aan reductie (-DTT) en na verlaging (+ DTT)) worden weergegeven in de tabel. De massa (5709,6 Da voor de steekproef voor de verkorting en 5717,6 Da voor het gereduceerde monster) vertonen een massa verschil van 8 Da. Een massaverschil van 2 Da overeen met de aanwezigheid van geoxideerd 1 disulfidebinding derhalve een massaverschil van 8 Da de aanwezigheid van 4 disulfide bindingen (zoals verwacht) inde niet-gereduceerd monster.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische weergave van de hoge doorvoer expressie onderzoeksprotocol Met dit protocol. Kan 96-384 omstandigheden worden beproefd door een persoon in een week met handmatige methoden of tot 1,152 voorwaarden beschreven semi-geautomatiseerde apparatuur. Expressieplasmiden zijn opgebouwd volgens een recombinatie klonering technologie, zodat vele doelstellingen kunnen worden gesubkloneerd in een keer. Zodra oplosbare expressieomstandigheden zijn geïdentificeerd en splitsing uitgevoerd, indien gewenst, het eiwit kan overgaan tot kwaliteitscontrole oxidatie en zuiverheid microassays en / of grote schaal controleren.

Figuur 2 Figuur 2. Schematische universele recombinatorisch kloneren en construct ontwerpen. Van doelvermelding klonen, verschillende expressievectoren kan worden gesubkloneerd in een experiment in een high throughput wijze (tot 6 x 96 klonen inschrijving in een week). De expressie gebrachte eiwit codeert voor een HIS-tag voor nikkel affiniteit zuivering. De DsbC (ontbreekt de periplasmatische signaalsequentie voor cytoplasmatische expressie) fusiepartner gebruikt om oplosbaarheid en / of steun vouwen en correct oxidatie van het doeleiwit verhogen. Merk op dat het doelwit coderende sequentie een N-terminal TEV protease ter (ENLYFQ) moet bevatten als tag splitsing gewenst. De inzet linksboven toont de productie van het item klonen met een donor vector en doelsequenties, die kan worden verkregen door PCR of gensynthese. Entry klonen kunnen ook worden verkregen uit commerciële binnenkomst kloon collecties. Meerdere recombinationele klonen systemen zijn beschikbaar, maar maken we gebruik van de Gateway system, zoals weergegeven in het schema.

Figuur 3
Figuur 3. High throughput screening pijpleiding meerdere disulfide-rijke doelen. Doelen worden initieel uitgedrukt als HIS-DsbC fusies in het cytoplasma van BL21 (DE3) pLysS E. coli bij 37/17 ° C met behulp van auto-inductie medium (Zyp-5052). Zuivering wordt uitgevoerd op nikkel hars gevolgd door detectie van oplosbare constructen door HTP elektroforese (of dot blot / SDS-PAGE). Als de eerste ronde van expressie screening mislukt, worden alternatieve kweekomstandigheden geprobeerd. Als constructen oplosbare eiwitten in voldoende hoge opbrengsten, microassays en kwaliteitscontrole kan worden uitgevoerd en desgewenst kan grootschalige productie worden nagestreefd. Voor objecten waar oplosbare opbrengst niet hoog genoeg zijn, kan expressie screening verder met alternatieve strains en temperaturen dan andere fusiepartners en periplasmische expressie. Optionele stappen zijn aangegeven met stippellijnen dozen.

Figuur 4
Figuur 4. Robot Werktafel instelling van de HTP platform. De indeling op onze vloeistofverwerking robot werktafel getoond, hoewel alternatieve werktafel kan worden gebruikt, mits deze soortgelijke sites beschikbaar. De opstelling bestaat uit een wassen station (WS) voor de (8-kanaals liquid handling hoofd (liha)), twee microplaat dragers met 4 posities elk (MP4, posities 1-4 en 5-8), een vacuüm zender met 2 standen (Te-stofzuigers, posities 9 en 10), een microplaat drager met 3 standen (MP3, posities 11-13), twee plaat shakers met 2 posities elk (Te-Shakers, posities 14-15 en 16-17) en een drager voor wegwerp tips met 3 standen (Diti, posities 18-20). Naast dere twee hotel dragers voor diepe putjes en een voor microplaten (niet getoond). De hardware op de vloeistof handlingrobot geïnstalleerd is een 96-meerkanaals arm (MCA96) voor gebruik met disposable tips, een 8-kanaals liquid handling hoofd (liha) met vaste tips en een robot manipulator (Roma) die platen / apparatuur beweegt rond op de werktafel. De nummering van de posities aangeduid gehele protocol.

Figuur 5
Figuur 5. Schematische voor het overbrengen van een 96-well plaat in vier 24-well platen.

Figuur 6
Figuur 6. Representatieve resultaten worden getoond voor de expressie scherm van 96 disulfide-rijke venom proeiwitten. De eiwitten werden als HIS-DsbC fusies in het cytoplasma en gezuiverd met 50 pi nikkel hars (Protocol 8.2-B). A) expressiescreenen resultaten tonen virtuele gel en vergroot tot de expressieopbrengst. Het contrast in de virtuele gel is aangepast lane naar lane ter compensatie van zeer zwakke of intense banden. Merk op dat voor sommige doelen twee banden te zien, de bovenste band overeenkomend met de intacte fusieproteïne en de onderste band overeenkomend met het fusie-tag alleen. B) Het aandeel eiwitten aanwezig op elk expressieniveau in vergelijking met het aantal disulfidebindingen in het eiwit. Het werkelijke aantal eiwitten in elke groep overlayed op de grafiek. C) De verdeling van expressieniveaus basis van iso-elektrisch punt (pI) en het aantal resten. D) Een voorbeeld van de massaspectrometrie resultaten voor een 5,7 kDa disulfide-rijk venoom eiwit met 4 disulfidebindingen. Het spectrum vande linkerkant toont het eiwit voorafgaand aan reductie met DTT en het spectrum aan de rechterkant toont het eiwit verminderd met DTT en vervolgens ontzout. De ionen die overeenkomt met de experimentele massa zijn gemarkeerd met pijlen en hun opdrachten worden in het groen. De experimentele massa voor het eiwit voorafgaand aan reductie en na reductie zijn in de tabel en vertonen een massaverschil van 8 Da, corresponderend met de aanwezigheid van geoxideerde eiwitten voor toevoeging van reductiemiddel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken .

Bestanddeel Recept Commentaar
ZY ~ 928 ml
10 g trypton
5 g gistextract
925 ml water
Mix en vervolgens autoclaaf te steriliseren. 2 M MgSO4 100 ml
49,3 g MgSO4 · 7H 2 O
~ 60 ml water
Roer totdat het is opgelost dan autoclaaf te steriliseren.
50x 5052 1 L
250 g glycerol
730 ml water
25 g glucose
100 g α-lactose
Voeg in de juiste volgorde, roer op vuur tot alle opgeloste dan autoclaaf te steriliseren.
20x NPS 1 L
900 ml water
66 g (NH4) 2 SO4
136 g KH 2 PO 4
142 g Na 2 HPO 4
Voeg in de juiste volgorde en roer tot alles opgelost dan autoclaaf te steriliseren.

Tabel 1. Recept voor onderdelen van Zyp-5052 medium.

Discussion

Er bestaat geen universele protocol voor de expressie van oplosbare, gevouwen, functionele eiwitten. Om kosten-en tijd-efficiënt zijn, de meeste laboratoria of eiwit kernfaciliteiten werken met meerdere doelen te gebruiken dan ook de hoogste throughput eiwit expressie screening om de beste 'generieke' combinatie van variabelen om een ​​oplosbare actieve eiwit te verkrijgen voor de meerderheid van de doelen te vinden. We hebben DsbC geïdentificeerd als een algemeen toepasbaar fusiepartner voor oplosbare expressie van disulfide-rijke peptiden en proteïnen 11. Met DsbC fusies en high throughput methoden binnen een week de oplosbare expressie van meerdere doelen kunnen worden waargenomen 11 en aanvullende variabelen, zoals beschreven in de inleiding, kan worden gescreend in latere rondes op de doelen die verdere optimalisatie vereisen. De hierin beschreven protocollen worden gericht op de expressie van disulfide-rijke eiwitten en peptiden. Voor gebruikers die expruk niet-netvormig eiwitten in een high throughput manier, de bijbehorende protocollen zijn eerder gepubliceerd en kan elders 22,24 worden gevonden.

De high throughput opzet is ideaal voor een aantal toepassingen, waaronder het screenen van een groot aantal verschillende eiwitten voor oplosbare expressie en screening van een groot aantal expressieconstructen (waaronder verschillende fusie-tags) voor verscheidene doelgenen tegelijk ( of meerdere expressieconstructen voor een enkel doel) om slagingspercentages te verbeteren. Het platform kan ook worden gebruikt voor benchmarking en validering van nieuwe protocollen op een groot aantal doelwitten. Andere toepassingen omvatten het screenen van varianten van een moeilijke doel, bijvoorbeeld alle orthologen of leden van dezelfde familie, of het succes van de productie van een paneel van mutanten van een enkel doel in een experiment getest. Dit protocol is ook gebruikt in combinatie met co-expressievectoren (with een gelabeld eiwit) om de uitklap en voorlopige karakterisatie van eiwit-eiwit complexen vervolgens grondiger biofysische analyse om de juiste complexvorming en stoichiometrie 33 bevestigen mogelijk. De hoeveelheid eiwit gezuiverd is soms geschikt voor micro-assays (functionele testen, eiwit-DNA 34 of eiwit-eiwit interactie assays). Er zijn verschillende voordelen voor de high throughput screening strategie expressie: (i) het vermogen om een ​​groot aantal doelwitten te testen of een groot aantal variabelen in een enkel experiment, (ii) beperkt batch-to-batch variatie, (iii) de eenvoud en het gemak van het werken op een kleinere schaal met behulp van diepe putten, (iv) schaalbaarheid en reproduceerbaarheid op grotere schaal, (v) de mogelijkheden voor automatisering, en (vi) de eenvoud van tracking en handling (geen etikettering van de afzonderlijke buizen, minder fouten ontstaan ​​bij gebruik van de plaatformaat dan bij de behandeling van individuele buizen in het mengen of uitwisselen van klonen).

24. Voor een maximale efficiëntie, is het nuttig om een geschikt systeem voor hoge doorvoer klonen hebben, naar de sub-klonen van grote aantallen doelen te vereenvoudigen. Voor de eerste fase van het VENOMICS project maken we gebruik van de veelzijdige Gateway recombinatie systeem 25 dat subklonering mogelijk maakt in elke bestemming vector in een tempo van honderden klonen per week. Protocollen voor Gateway recombinatie klonen is te vinden op de website van Invitrogen. Andere alternatieven voor high throughput klonen omvatten ligatie-onafhankelijke klonen (LIC) 35,36 en-beperking free (RF) klonen 37. Er zijn meerdere manieren om het doel genen te verkrijgen voor expressie, onder meer door PCR uit template-DNA, van instapniveau kloon collecties ofsynthetische genen, die is gekozen voor het VENOMICS projectstrategie. Synthetische genen kunnen worden besteld met recombinatie locaties aan weerszijden van het gen en gen-synthese maakt een eenvoudige codonoptimalisering van de doelgen sequentie (zeldzame E. coli codons sluiten). Dit is aanbevolen maar niet essentieel. Voor objecten zonder codonoptimalisering dat een groot aantal zeldzame codons, 2 Rosetta (DE3) pLysS (welke tRNA draagt ​​voor zeldzame codons die niet hoog tot expressie in E. coli) bevatten, kunnen beter geschikt zijn dan BL21 (DE3) pLysS. Hoewel er stammen beschikbaar die de reductie van disulfide bindingen in de normaal reducerende omgeving van het cytoplasma beperken, in onze handen zij niet zo succesvol als normale E. geweest coli stammen 11.

Analytische weegschaal affiniteitszuivering wordt uitgevoerd vanaf de testexpressie culturen om de oplosbare fusie-eiwitten herstellen en kwantificeren opbrengsten. Kwantitatieve gegevens kan worden verkregen op the oplosbare opbrengst van fusie-eiwitten die binnen een bereik van 0,1-100 mg / l cultuur. Als een doel is niet oplosbaar, kunnen alternatieve expressie en inductie temperaturen, stammen of media worden getest voor verschillende fusiepartners worden nagestreefd. Voor oplosbare expressie van disulfide-rijke eiwitten, eerder gerangschikt we het effect van fusiepartners als DsbC> DsbA> GST> MBP> TRX> HIS-tag voor cytoplasmatische expressie 11. Periplasmische meningsuiting is een andere mogelijkheid dat de succesvolle vouwen van disulfide-rijke doelen kan helpen. Het periplasma is minder reducerende omgeving dan het cytoplasma en bevat nuttige redox chaperones disulfide binding staan. DsbC, DsbA en MBP-eiwitten zijn gewoonlijk gelokaliseerd in het periplasma van de periplasmatische signaalsequenties. Dit biedt de mogelijkheid om deze tags te benutten om de disulfide-rijke doelstellingen om de periplasmaruimte sturen teneinde vouwen helpen. Voor hardnekkige targets, zou de volgende stap om purify de onoplosbare HIS-gelabeld doelwit van insluitingslichamen, oplosbaar te maken en opnieuw te vouwen (dit is buiten het bestek van dit protocol en zal hier niet besproken 3 9). Dit kan relatief eenvoudig voor doelen met slechts een of twee disulfidebindingen, maar wordt steeds moeilijker naarmate het aantal disulfidebindingen toeneemt. Alternatief, en met name voor eiwitten en peptiden met vier of meer disulfidebindingen, kan het gunstig om complexere productiesystemen zoals gist, insecten of zoogdierlijke expressie proberen.

Met de vooruitgang in miniaturisatie en automatisering, zullen HTP elektrofysiologie lab-on-a-chip technologie 28 ongetwijfeld de weg van de toekomst voor functionele analyses zijn. We voorzien dat voor de meeste doeleinden (misschien met uitzondering structurele studies) zal de noodzaak voor grootschalige kweken ontkrachten. Kleinschalige kweken niet alleen nuttig voor het screenen van expressie omstandigheden, maar ook in staat om suf biedendoende hoeveelheden monster voor deze geminiaturiseerde functionele assays. De mogelijkheid om meerdere doelen gelijktijdig produceren in voldoende hoeveelheden voor functionele karakterisatie de kosten van het kweken en gebruiken van deze soort platforms verlagen Expressie en karakterisering van recombinant eiwitten meer tijd en kosten-effectief.

De protocollen die hierin zijn toegepast om de expressie van disulfide-rijke peptiden en eiwitten in de beginfase van de Europese FP7 VENOMICS project. Vergiften zijn een uitstekende bron van bioactieve peptiden die vaak interessante farmacologische potentie. Echter, de productie is een uitdaging vanwege hun complexe disulfide-binding patronen en kleine omvang. Met behulp van high-throughput platformen zoals die hierin beschreven, het VENOMICS project heeft tot doel een bibliotheek van 10.000 nieuwe gif peptiden genereren om de diversiteit in de natuur waargenomen reproduceren. Deze bibliotheek wordt benut voor de karakterisering van disulfide-rich peptiden met potentiële farmacologische of therapeutische toepassingen met het doel de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Het platform wordt momenteel gebruikt voor benchmarking en valideren van nieuwe protocollen voor gebruik in de VENOMICS project.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door The VENOMICS project, Europese projectsubsidie ​​N ° 278346 via het Zevende Kaderprogramma (KP7 GEZONDHEID 2011-2015). De VENOMICS project is een samenwerking tussen verschillende onderzoeksinstellingen en bedrijven in Europa:

AFMB, Aix-Marseille Universite (Frankrijk), CEA Saclay (Frankrijk), NZYTech (Portugal), SistemasGenomicos (Spanje), de Universiteit van Luik (België), VenomeTech (Frankrijk), Vitamib (Frankrijk), Zeeland Pharma (Denemarken)

Dit werk werd ondersteund door de Franse infrastructuur voor Integrated Structural Biology (Frisbi) ANR-10-InSb-05-01.

De auteurs willen ook graag de heer Jeremy Turchetto bedanken voor het helpen met de voorbereidingen voor de opnames van de video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot Tecan Group Ltd. Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates.
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8
96-well PCR (PCR96) plates Greiner Bio-One 652270 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/
LB medium Autoclaved for sterility.
Antibiotic stocks Kanamycin (50 mg/ml), ampicillin (100 mg/ml), chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at −20 °C. Use a 1:1,000 dilution.
Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity Greiner Bio-One 780270 Autoclaved for sterility.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/
Expression vectors For the expression of target constructs. Store at −20 °C.
BL21 (DE3) pLysS competent cells Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C.
Breathseal breathable adhesive film Greiner Bio-One 676050
PCR machine with 96-well plate block For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.
24-well sterile tissue culture plates Greiner Bio-One 662165 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/
LB-agar Autoclaved for sterility.
200 μl sterile disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 617 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Multitron shaking incubator, with 3 mm throw Infors AJ103 Not essential, a regular shaking incubator can also be used.
http://www.infors-ht.com/index.php/en/
Plate incubator
Microtiter plate For glycerol stocks and elution using purification protocol B.
Glycerol For the preparation of glycerol stocks.
200 μl disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 616 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Adhesive tape pads  Qiagen 19570 http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads
Bactinyl Orapi Group Or equivalent microbial disinfectant.
ZYP-5052 medium See Table 1 for recipes of components.
Deep well 24 (DW24) plates, 10 ml capacity Whatman 7701-5102 Autoclaved for sterility.
http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102
Flat-bottomed, clear microtiter plate Greiner Bio-One 655101 For absorbance readings.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/
Plate reading spectrophotometer Optional. For measuring OD600 of cultures.
Centrifuge with rotor for deep well plates  Suitable for 3,800 x g.
Lysozyme 50 mg/ml in water. Store at −20 °C.
Imidazole ACS grade Merck IX0005-1 A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.
Lysis buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.
Water bath
Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) Misonix Inc. Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.
DNase  2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C.
Magnesium sulphate (MgSO4) 2 M stock in water, autoclaved.
SDS-PAGE or Caliper sample buffer 
Binding buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Wash buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Elution buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity Macherey-Nagel 740686.4 http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx
200 μl disposable wide bore tips Tecan Group Ltd. 30 050 348 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Ni Sepharose 6 Fast Flow resin GE Healthcare 17-5318-02 For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use.
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802
Tobacco Etch Virus (TEV) protease Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C.
96-well 0.22 µm filter plate Millipore MSGV N22 10 Optional. To filter the soluble fraction after cleavage.
http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210
SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion.
Spectrophotometer and cuvettes For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.
ZipTip pipette tips Millipore Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control.
http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0
Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berrow, N. S., et al. Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).
  2. Correa, A., Oppezzo, P. Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening. Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).
  3. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5, 135-146 (2008).
  4. Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).
  5. Graslund, S., et al. The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins. Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).
  6. Bird, L. E. High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli. Methods. 55, 29-37 (2011).
  7. Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).
  8. Kapust, R. B., Waugh, D. S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).
  9. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).
  10. Marblestone, J. G., et al. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO. Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).
  11. Nozach, H., et al. High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli. Microb Cell Fact. 12, 37 (2013).
  12. Sachdev, D., Chirgwin, J. M. Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification. Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).
  13. Smith, D. B. Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies. Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).
  14. de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
  15. Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli. Microb Cell Fact. 9, 67 (2010).
  16. de Marco, A. Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria. Microb Cell Fact. 11, 129 (2012).
  17. Katzen, F., Beckwith, J. Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli. Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).
  18. Klint, J. K., et al. Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli. PloS One. 8, e63865 (2013).
  19. Braud, S., et al. Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins. Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).
  20. Douzi, B. G. A., et al. A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry). Advances and new technologies in toxinology. 149-152 (2010).
  21. Groisillier, A., et al. MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms. Microb Cell Fact.. 9, 45 (2010).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55, 65-72 Forthcoming.
  23. Xiao, R., et al. The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).
  24. Saez, N. J., Vincentelli, R. Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli. Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology. Chen, Y. W. 1091, Humana Press. 33-53 (2014).
  25. Katzen, F. Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system. Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
  26. Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format. Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).
  27. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).
  28. Spencer, C. I., et al. Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics. Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).
  29. Sala, E., de Marco, A. Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography. Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).
  30. Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction. Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).
  31. Zanier, K., et al. Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins. 339, Science. New York, N.Y. 694-698 (2013).
  32. Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. The P1' specificity of tobacco etch virus protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).
  33. Vincentelli, R., Romier, C. Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex. Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).
  34. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  35. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).
  36. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  37. van den Ent, F., Lowe, J. RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).
  38. Vincentelli, R., et al. High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies. Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats