네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

Neuroscience

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Summary

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

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Stewart, R. S., Kiss, I. M., Wilkinson, R. S. Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51477, doi:10.3791/51477 (2014).

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Abstract

가터 뱀의 근육을 abdominis 사차원 (4D) 빛의 영상은 얇은 transversus의 모터 신경 터미널에서 작은 구조의 행동을 연구하는 데 사용되었습니다. 원시 데이터는 3D의 Z-스택의 시간 경과 시퀀스를 포함한다. 각 스택은 400-1,500 nm의로 구분 초점 평면에서 표면 형광 광학으로 획득 한 4-20 이미지가 포함되어 있습니다. 이러한 포커스의 조정 등의 화상 스택의 입수 단계는, 여기 파장의 스위칭, 및 디지털 카메라의 동작은, 화상 비율을 최대화하고, 노광에서의 조직 손상을 최소화하기 위해 가능한 한 자동화된다. 인수 후, 이미지 스택의 세트가 공간 해상도를 향상시킬 수 deconvolved되어, 원하는 3D 형식으로 변환하고, 4D "영화"그 노력 실험 데이터에 따라, 컴퓨터 기반 분석의 다양한 적합을 만드는 데 사용됩니다. 하나의 응용 프로그램은 신경 터미널 - macroendosomes에서 발견 엔도 좀의 두 클래스 (MES)의 동적 거동의 연구이다및 (AES) - 누구의 크기 (두 가지 유형 200 ~ 800 nm의) 산성 엔도 좀은 회절 한계에 또는 근처에 있습니다. 각 시점에서의 3D 정보에 대한 액세스는 종래의 시간 경과 이미징에 비해 여러 장점을 제공한다. 특히, 크기 및 구조의 이동 속도는 날카로운 초점의 손실없이 시간을 통해 정량화 할 수있다. 4D 촬상 데이터의 예로는 그들이 exocytosed보다는 단순히 수직 거리에 초점이 하나의 평면에서 이동하는 것을 제안, MES는 원형질막 접근 사라지는 것으로 나타났다. 또한 각 3 직교 전망에서 볼 때 두 염료를 포함하는 구조에 대한 중복 시각화하여 MES 및 AES의 추정 융합입니다 밝혔다.

Introduction

조직 생활의 시간 경과 영상은 시간의 한 지점에서 이미지가 고정 또는 생활 준비에 알 수없는 동적 구조 - 기능 관계에 대한 시각에 대한 액세스를 제공합니다. 그러나, 종종 시간 정보에 액세스하기위한 트레이드 오프는 광학 해상도의 감소이다. 높은 수치 조리개 기름 침지 목표는 유일한 대안으로 침수 또는 건조 목적을두고 있기 때문에 초점이 자신의 좁은 범위의 조직 생활에 실용적이다. 또한, 공 초점 광학에 의해 제공 증가 된 해상도는 조명의 상대적으로 높은 수준의 1,2 필요한에서 광독성 환경에 따라 약간의 생활 준비에 활용 될 수 없습니다. 여러 실시간 또는 시간 경과 광학 기술이 제공하는 향상된 해상도를 사용할 수있는 동안 마지막으로, 자신의 적용은 그 구조가 목표 1의 몇 백 나노 미터 내에 위치 할 수있는 준비로 제한됩니다. 기재된 방법상대적으로 저가의 장비를 사용한다 다목적, 아직 더 일반적으로 사용되는 시간 경과 기술에 비해 향상된 해상도를 제공합니다. 그것은 개인의 실험실뿐만 아니라 영상 시설에서 사용하기위한 것입니다.

방법은 민감한 디지털 카메라로 급속 약간 다른 초점 평면 (Z-스택)에서의 이미지 세트를 획득하기 위해 설계된 하드웨어와 함께, 종래의 표면 형광 현미경을 이용한다. 각각의 Z-스택은 디지털 해상도를 증가 deconvolved된다. 3D 시간 경과 (4D) 영상의 하나의 기능은 세포 기관 또는 다른 구조물을 이동의 정확한 추적합니다. 제대로 설정하면, 몇 군데 구조는 초점이 이동하지 않고, 세 방향으로의 움직임을 관찰하고 정량화 할 수있다. 스테인드 구조는 단지 좁은 초점 평면 위 또는 아래에 표류하여 하나 이상의 시간 경과 프레임에 사라에 따라서는 불가능하다. 방법은 또한 상호 작용 가능한 푸을 평가하기위한 중요한 툴로서 기능작은 구조의 시온. 기존의 표면 형광 또는 회절 한계 (수백 nm의)에 가까운 구조의 공 촛점 이미지가 병합 된 이미지는 각각의 라벨 3의 중복을 보이고도 융합을 확인하지 않습니다. 융합 제안하지만 개체 회절 한계 이하의 거리에 의해 수평 또는 수직으로 분리되어 남아있을 수있다. 3-4 차원 화상은, 대조적으로, 세 개의 직교하는 방향의 각각에 오브젝트를 볼 수있게. 모두 세 가지보기에서 융합의 모양은 확실성 수준을 증가시킨다. 그리고, 약간의 생활 준비에, 감독 또는 둘 모두 라벨이 시간에 함께 이동할 때 상상 속으로 융합 개체의 브라운 운동은 더 증거를 제공한다. 물론 때 회절 한계 근처에서 배경 엄선한 구조의 확실성 또는 그들이이 염료 (융합)가 포함되어 있음을 보여주는 수준은 절대 아니다. 만약 예컨대 형광 공명 에너지 전달 (FRET)와 같은 적용, 특수 기술4, 더 적합합니다.

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Protocol

1. Supravital 염료와 준비 얼룩

  1. 가터 뱀 해부 프로토콜의 스튜어트 등. 5를보고등. 6 파충류 조직은 긴 시간에 대한 생리 학적 남아 있고, 적은 세균 오염과, (아래 참조) 낮은 온도로 유지합니다. 포유 동물 조직은 일반적으로 실온 또는 그 이상으로 유지된다.
  2. 리소좀 중요한 염료의 염색을 위해, 차가운 파충류 링거 용액 1:5,000 (0.2 μM)에 염료를 용해. 15 분 동안 4 ° C에서 알을 품다. 차가운 링거 여러 번 씻는다. 가능한 한 빨리 이미지.
  3. 의 KCl 자극을 사용하여 FM1 -​​ 43 염색의 경우, 고의 KCl 링거 1:500 (7 μM)에 염료를 희석. 30 ~ 60 초에 최대 4 ° C에서 알을 품다. ~ 1 분 / 린스, 차가운 링거 빠르게 세 번 씻으십시오. 가능한 한 빨리 이미지.
  4. 고장 성 (자당) 자극을 사용하여 FM1 -​​ 43 염색의 경우, 상기와 0.5 M의 자당 링거의 염료를 희석. 4 & #을 품다176, 2-5 분 동안 C. 차가운 링거와 함께 위의 단계 1.3로 씻으십시오. 가능한 한 빨리 이미지.
  5. FM1 - 43 염색에 대한 전기 자극을 통해, 탱 등. 6 간단히 참조, 준비는 생리 식염수와 염료를 포함하는 요리를 배치됩니다. 신경은 200 마이크로 초 직사각형 펄스 (~ 12 V, 30 Hz에서, 18 마이크로 초)의 사전 프로그래밍 된 기차로 자극된다. 차가운 링거와 함께 위의 단계 1.3로 씻으십시오. 가능한 한 빨리 이미지.

2. 이미징을위한 준비를 구성

  1. 그 구조는 현미경 대물에 최대한 가깝게되도록 준비 배향.
  2. 도립 현미경을 사용하는 경우, 그 하부 라운드 얇은 커버 슬립을 포함하는 챔버를 이용한다. 전형적으로, 촬상 챔버는 중앙에 25mm 직경 중 1 두께 유리 커버 슬립으로 얇은 스텐레스 바닥을 가져야한다. 직립 현미경을 사용하는 경우, 하부 커버 슬립은 필수이지만 유용되지전송 된 빛으로 영상을 허용 (예를 들어 미분 간섭 대비, DIC)는 시편의 방향과 관심의 개체를 찾을 수 있습니다.
  3. 가장 높은 3D 해상도를 얻기 위해 적절한 목표를 선택합니다. 장단점이 개구 렌즈 (NA), 작동 거리, 확대 및 유형 가운데있다 (건조, 물과 기름 침지). 조직 문화와 같은 얇은 준비를 위해, 석유 목표는 최고입니다. 직립 현미경을 사용하여, 수계 욕 커버 슬립을 띄워 커버 슬립의 상단과 대물 간의 침지 오일을 사용한다.
  4. 디콘 볼 루션 소프트웨어가 사용되는 경우, 판매자는 특정 목적의 소정의 점 분포 함수 (PSFS)을 제공 할 수 있습니다. 이러한 정보가 제공되지 않거나 지원되지 않는 목적을 선택하면, 형광 마이크로 도트 또는 유사한 회절 한정 개체 7,8 촬상하여 PSF를 결정하는 경우.

3. 원하는 필드의 깊이와 이마의 번호를 설정시간 경과 프레임 당 원하는 GES

  1. 필드의 전체 깊이를 선택하는 것이 너무 이동하거나 그 구조가 사라지거나 그들이 Z-방향으로 이동 초점이 이동하지 않는 상호 작용. Z 필드는 약간 군데 중의 셀 또는 셀 공정의 수직 치수를 초과해야한다. 척추 모터 단자의 경우, 15 ~ 20 μm의는 일반적입니다.
  2. 포커스의 각 증가에 필요한 Z-축 단계를 계산한다. Z-축을 따르는 해상도의 목적 특성에 따라 변화한다; 이것은 XY 플레인의 해상도의 약 네번째이다. 공 촛점 이미징 또는 컨볼 루션 소프트웨어 중 하나를 사용하는 경우, Z-축 해상도가 향상된다. z 방향 5 의도적으로 오버 샘플링에 의해 최종 해상도를 향상뿐만 아니라, 아래 3.3 단계를 참조하십시오. 전형적인 스텝 간격은 40-100X 목적의 400-1,500 nm 내지 범위이다. 빛은 각각의 Z-단계의 이미지에 사이 문을 닫았해야합니다.
  3. Z-스택 당 이미지 수를 선택, 즉 필드의 원하는 깊이는 분할스텝 간격으로. 일반적인 Z-스택을 완료하는 시간은 1-10 초이다. 각각의 이미지 비행기가 약간 다른 시점에 해당하기 때문에 빠른 속도로 움직이는 물체 (100 ㎚ / 초) 3D 이미지 스택에서 흐리게 나타날 수 있습니다. 또한, 각각의 추가 이미지는 광표백 가능한 광독성 (토론 참조)에 기여한다. 어느 상황이 속하는 경우, 스택 당 적은 수의 이미지를 수집하는 더 큰 Z-단계를 선택합니다. 이미지 보간 소프트웨어 (아래 단계 6.3)를 사용하여 나중에 보정합니다.

4. 시간 경과 프레임 속도를 선택합니다

부드럽게 같은 움직임, 상호 작용 또는 융합 이벤트를 9로 시간 변화를 해결하기 위해 단지 충분 속도를 실험에 의해 선택합니다. 오버 샘플링이 불필요하게 빛에 대한 노출이 증가하면서 샘플링에서 모션 아티팩트 (표본 오차)를 생성 할 수 있습니다. 하나의 긴 시퀀스 나 같은 준비, 상대적으로 작은 총 시간 간격으로 각 (에서 몇 가지 반복되는 시퀀스 중 하나를 수집

5. 특정 준비를 위해 모든 라이브 영상을 완료

파충류 준비는 일반적으로 냉각 긴 경우, ~ ~ 2 시간 동안 강력한 남아있다.

6. 원하는 용도에 따라 데이터 분석

  1. 모든 원시 데이터 파일을 유지합니다. 디지털 저장은 일반적으로 문제가되지 않지만, 처리 시간도 빠른 개인용 컴퓨터 나 워크 스테이션과 함께 중요하다. 이러한 이유로,이자 [투자 수익 (ROI)]의 영역에 자르기 이미지. 관심의 전체 영역이 전체 시간의 과정 동안 자른 창에 있음을 확신합니다.
  2. Deconvolve 콘텐츠 적절한 소프트웨어 및 정확한 점 분포 함수를 사용하여 스택. 그 해상도가 향상 확인하고 아무 유물에 의해 생성되지 않았디컨 볼 루션 알고리즘. 그림 3은 예를 들어 이미지를 보여줍니다.
  3. z 축 명백한 해상도를 확장 보간 알고리즘을 사용합니다. 명백한 0.25 μm의 분리에 실제 1.5 μm의 이미지 평면 분리에서 배의 확장을 제안한다. 또한, 오버 샘플링의 조합 (단계 3.2) 및 보간을 사용합니다.
  4. 원하는 경우, 콘트라스트, 밝기, 노이즈 필터링, 광표백 유용한 일반적인 화상 처리의 조정을 수행한다. 이미지 처리 표준은 대부분의 과학적인 작업을 위해, 그것은 동일한 수정을 스택 내의 서로 다른 시점에서 모두, 모든 화상에 적용되는 것이 적절하다는 것을 지시. 특정 조정의 결과는 모든 이미지 9 사이에서 평가되어야한다.
  5. 데이터의 수출을 위해 특정 표시 모드를 선택합니다. 가장 간단한 디스플레이는 녹색 - 빨강 또는 빨강 - 파랑 입체 사진 (그림 3의 예), 스테레오 쌍, 또는 교대를 사용하여 스테레오 영상입니다 맞 왼쪽 /T 눈은 셔터 안경 프레임. 입체 사진은 단일 색상으로 제한됩니다. Z 축 시각적 해상도를 향상시키기 위해 필요한 경우 겉보기 화상 농도를 향상시킨다.
  6. 다양한 필터링 및 이미지 향상 기술을 실험. 예를 들어, 라플라스 필터링을 배경 위의 작은 구조의 대비를 증가하는 데 유용합니다. 주변 영역의 밝기가 감소하는 동안 실행되는 윈도우의 중심 화소의 밝기가 향상된다. 몇 가지 필터링 방법은 조합에서 잘 작동하지 않습니다.
  7. 시간에 따른 제제의 상당한 움직임이있을 경우, 드리프트 보정을 적용한다. 이러한 운동은 약이 활동 전위와 시냅스 전위를 억제하기 위해 추가 심지어, 근육을 생활에 일반적입니다. 픽셀 등록 알고리즘 (예. IMARIS, 어도비 애프터 이펙 츠, ImageJ에 대한 TurboReg 플러그인) 시간 경과 이미지를 정렬 줄일 수 있지만, 일반적으로 완전히 같은 동작을 제거하지.

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Representative Results

표시 데이터 (그림 3에서 낮은 고배율 뷰를 볼 수 있으며, 세포 내 이입 염료 (FM1-43) 흡수는 각 부통을 채우는 안개를 만듭니다) 뱀 신경 근육 터미널에서이고, 특히, macroendosomes (MES) 및 산성 엔도 좀 (AES) 이 터미널 5 이내. MES는 신경 활동 10시 대량 엔도 시토 시스에 의해 만들어지고 활동이 6을 중단 한 후 자신의 수는 시간이 기하 급수적으로 감소된다. 4D 라이브 영상의 사용은 그들 중 일부는 exocytose 때문에 그들의 숫자가 감소한다는 것을 제안, MES는 세포막으로 이동하는 경우를 확인하고 신속하게 사라했다. 그러한 모든 행은 하나의 시점에서 본 (및 전과) 완전히 옆 시점 간 (및 그 이후)되었습니다. 따라서 소멸에 요하는 시간은 우리의 프레임 간격 (30 초만큼 짧게) 및 세포 외 유출에 부합 미만이었다. 4D 데이터가 지원하지 않는 다른 이론은, MES 천천히 V의 신진 통해 낭비입니다그들이 사라질 때까지 esicles. 소포 신진 6 발생하지만 적어도 일부 MES는 동안 또는 5 신진 후 하나 exocytosed 있습니다. 그림 1을 영화 S1 두 시간 경과 프레임 사이 ME의 실종을 보여줍니다. 사라질 운명에 MES는 (짧은 자극 후 몇 분 시작) 영화의 시간 동안 천천히 방출과 일치이었을 두 개 이상의 프레임 (N = 16)을 통해 모양이나 밝기를 변경하지 않았다. ME의 실종은 기존의 시간 경과 이전에 관찰 있지만, 구조가 간단 초점 비행기를 떠난 가능성이었다. 또한, 시각 (영화 S1)의 다양한 볼은 ME의 실종은 급격한 것으로 확인되었다. 기존의 라이브 영상과 함께 (하나의 관점에서보고, 예를 들면 XY 이미지 평면) 노이즈 유물은 구조가 변경되지 않은 것을 확인하기 위해 연구자의 ​​능력을 제한 할 수 있습니다. 이러한 유물은 종종 존재한다그러나 다른 하나의보기에.

전자 현미경 연구는 모터 단자에서 엔도 좀은 광 (10)의 회절 한계 근처의 크기가 작은 것으로 나타났다. 이 엔도 좀의 융합 따라서 절대적으로 빛 수준에 가까운 공간 협회 구별 할 수 없습니다. MES는 리소좀 중요한 염료 (빨간 형광)와 FM1-43 (녹색 형광), 및 AES로 표지되었다. (노란색 나오는) 두 색상으로 fluoresced 구조는 때때로 4D 영상 기록에 주목했다. 적절한 소프트웨어를 사용하여, 관점의 다양성에서이 두 번 표시하기 때문에 분명히 융합 엔도 좀의 전망이 근처에 그리고 명백한 구조 내에서 복셀의 두 레이블의 일치를 검사하기 위해 생성되었다. 그림 2 추정 융합 AE-ME 보여줍니다 세 개의 직교 방향에서 볼 때. 하나의보기는 XY 평면이다 다른 뷰는 평면에 서로 직교한다. 이 방법을 사용하여 그것을 발견하는 복셀그들은 분명히 하나 이상의보기 비행기에서하지 않았다 예에서와 같이하거나, 중복 하나. 영화 S2는 AE-ME (3 차원으로 완전히 회전) 대화 형 가상 현실 디스플레이로 제시 융합 같은 추정을 보여줍니다.

디지털 컨볼 루션은 기존과 공 초점 현미경 모두 11에서 3D의 해상도뿐만 아니라 4D 이미지를 향상시킬 수있는 유용한 도구입니다. 디콘 볼 루션은 사용 목적의 제한된 공간 해상도를 위해, 어느 정도 보정 수치, 반복적 인 과정이다. 이 해상도는 미소 한 점의 이미지에 의해 점유 된 목적의 점 확산 함수 - 3D 볼륨으로 특징입니다. 이론적으로, 디컨 볼 루션은 목적이 완벽하면 될 것이다 이미지를 복원합니다. 3 빨간색과 녹색의 입체 사진의 쌍으로 표시되는 두 개의 서로 다른 데이터 세트, 각각의 3D 볼륨이다 그림. 오른쪽 이미지는 디지털 드 후 선명도 일반적인 개선을 보여화상 스택의 컨볼 루션.

그림 1
그림 1. macroendosome (ME)은 세포막과 명백한 접촉 후 사라집니다. 뱀 신경 - 근육 준비 전기적 FM1-43의 존재에 자극했다. 데이터는 방법에 설명 된 단일 Bouton에서의 Z-깊이를 설명하기 위해 여섯 시간 지점 (60 초 간격)에서 "3D 볼륨보기"로 표시됩니다으로 4D 영상을 사용하여 수집 하였다. ME는 시간 지점 5와 6 사이에 사라지기 전에 여러 프레임에 걸쳐 멀리 Y 축 (빨간 점선)에서의 이동을 관찰 할 수 있습니다. 그냥 소멸하기 전에, ME는 FM1-43 소포로 구분 팽대의 세포막 (에 위치 할 것으로 보인다 염색 또는 "안개;") 그림 3 범례를 참조하십시오. ME는에 다시 나타나지 않았다나중에 포인트 (데이터 표시되지; 영화 S1 참조). 스케일 바, 2 μm의는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

MOVIE S1 :. ME의 4D 시간 경과보기 실종 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 1에 표시되는 같은 원시 데이터 세트가 낮은 배율에서 "4D 볼륨보기"로 표시됩니다. 원래 시간 경과 순서는 8 시간 점, 60 초로 구분을 포함한다; 재생 / 초 4 프레임입니다. 순서는 간단히에 관심을 끌기 위해 y 축 (15도 / 단) 약 24 3D 회전 각 단계의 시작 부분에 일시 정지 곧 될 ME (빨간색 화살표)을 사라. ME는 볼 수 있습니다, 부통 (세포막)의 가장자리는 사라 접근하고있는, 반환하지 않습니다모두 보는 관점. 이 때문에 하부 Z 축 해상도 XY 해상도에 비해 ME의 형상은 늘려 관점을 볼에 따라 짧아 보인다. 이미지는 QuickTime 동영상으로 수출 및 프로 퀵타임을 사용하여 주석이되었다. 스케일 바, 2 μm의.

그림 2
그림 2. 추정 융합 엔도 좀의 직교 뷰. 신경 근육 준비 순차적 방법에 설명 된대로 0.5 M 자당의 자극을 사용하여 MES에 라벨을 유해 및 FM1-43 (녹색) 레이블을 리소좀 중요한 색소 (빨강)로 염색 하였다. 4D 영화의 한 시점에서 데이터는 세 가지 방향에서 3D 볼륨보기로 표시됩니다. 상단 (패널 1-3)에서 (xy 평면) 위에서 기존의보기이다. 중간 (패널 4-6)에서 XY 평면에 수직 한 도면이며큰 빨간색 화살표의 (임의) 방향. 바닥 (패널 7-9)에서 위의 두 뷰에 서로 수직보기는 큰 파란색 화살표의 방향입니다. ME (녹색)은 녹색 화살표로 표시됩니다; 두 개의 유해 (빨간색)은 빨간색 화살표로 표시됩니다. (노란색) 두 염료를 포함하는 엔도 좀은 패널 3, 6에 노란색 화살표로 표시하고, 9. 빨간색과 녹색의 세 가지 직교 투영 똑같이 완료의 중복에주의한다. 스케일 바, 2 μm의는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

MOVIE S2 :. MES 및 산성 엔도 좀 유해를 포함하는 이미지의 대화 형 회전 . 동영상을 보려면 여기를 클릭 그림 2의 데이터 세트는 완전히 회전 된 3D 이미지 (퀵타임 가상 Reali로 구성 표시됩니다형식 타이; ) 모든 방향에서 볼 수있는 이미지를 회전하려면 마우스를 사용합니다. 추정 저를 융합 / AE는 모든 관점에서 노란색 남아있다.

그림 3
그림 3. 역대 합은 3D 공간 해상도를 향상시킵니다. 2 개의 로우 (상단)에 표시 일반적인 뱀 신경 터미널, 높은 (아래) 각각 확대 및 FM1-43로 자극시 스테인드.을 FM1-43 배경 "헤이즈는"개개인의 50 nm의 소포의 표시로, MES가 제한되는 내 터미널 BOUTONS의 모양을 보여줍니다. 데이터는 (; 왼쪽 눈에 빨간색, 왼쪽 상단의 주 축삭은 위의 터미널의 평면에 내려 깊이 녹색 - 빨강 또는 빨강 - 파랑 안경을 시각화 할 수 있습니다) 3D 볼륨보기의 빨강 - 녹색 입체 사진으로 표시됩니다. 왼쪽 패널 : 원시 데이터; 오른쪽 패널 : 데이터를 후디컨 볼 루션. MES의 해상도를 크게 개선합니다. 상단 패널 : 전기 자극; 전체 터미널 (~ 30 × 50 μm의 (), 스케일 바, 10 μm의 그림 1과 영화 S1과 같은 원시 데이터) 표시. 하단 패널 : KCl을 자극; 네 개의 개별 BOUTONS (~ 3 × 5 μm의, 스케일 바, 2 μm의)를 보여 확대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

4D 영상의 가장 중요한 측면은 노광의 지속 시간 및 강도의 관리이다. 광표백은 화상 신호 대 잡음비를 감소 및 형광체의 선택을 포함하는 다양한 요인에 따라 문제 여부 일 수있다. 생체 조직 (광독성)에 비특이적 손상 photobleaching에 관련되어, 때로는 목적 2,12 나 미분 간섭 대비 (DIC)로서 적합한 시야 광학계와 형태의 시험에 의해 설계 형광 프로브를 이용하여 식별 될 수있다.

확실히 광표백 및 광독성과 관련된 이들의 크기 이하 가벼운 수준에서 발생 생리적 효과를 유도하는 것도 가능하다. 예를 들어, 다 제제를 사용하는 초기 실험에서, 각 자극 후 다른 시간에 고정 MES 간단한 자극 후 시간에 따라 소실되는 속도는 6을 측정 하였다. 표준 연습 T는로그들이 볼 때까지 O 퇴색 최소화, 준비는 어둠 속에서 유지되었다. 유사한 실험 4D 라이브 영상을 사용하여 수행되었을 때, 많은 MES 실험 (~ 20 ~ 60 분)에 걸쳐 남아 사라지지 않았다. 실제로 기록함으로써, 처음에 하나의 3D 프레임과 끝의 단일 프레임으로 노광을 제한하지 제외한 동일한 라이브 촬상 프로토콜의 사용은, 고정 된 제제의 것과 엔도 좀 소실의 예상 전반적인 속도를 회복.

또한 문제 해결 실종의 비율이 반대로, 일부이고 단조 실험 기간 동안 총 빛 노출과 관련된 것으로 나타났다. 기존의 다중 광자 공 초점 광학을 통해 노출을 줄이기 위해 실패한 시도 후, 문제는 결국 ~ 3 배 더 민감한 카메라 (표 1)의 구입으로 해결되었습니다. 그것은 가능하면 유사한 비교가 사용자의 응용 프로그램에 따라 할 것을 권장합니다. 만약 어떤 Process에 또는 전환은 강도 나 조명의 총 지속에 기인하는 어떤 변경이 없음을 확인하고, 시간이 지남에 기록되고있다. 광독성 및 광 탈색 염료 다릅니다. 예를 들어, 우리는 하나의 터미널의 큰 페이딩을 반복 4D 영상 FM1-43을 사용하여 (30 분에 350 개인 빛 노출)를 보았다. 유사한 염료 SGC5 (표 1)를 사용하여 동일한 촬상 프로토콜이되지만, 일부 페이딩 결과 및, 아마도, 광독성도 (데이터는 도시되지 않음).

(사용 된 경우와 공 초점 광학계; 미도시), 디지털 디콘 볼 루션에 의해 제공된 개선을 제외 설명한 직접적인 방법은 "최고"해상도를 제공하지 않는다. 그러나,이 방법은 그 사이즈 또는 회절 한계보다 약간 큰 거실 구조 특히 동화상 것들, 볼 때 실용적이거나 직관적 해상도를 향상시키는 이점을 갖는다. 다양한 관점에서 includi에 개체를 볼 수있는 기능세 개의 직교 평면에서의 각 NG 프레젠테이션은 구조가 실제로 노이즈 레벨 이상 및이 하나 이상의 형광체에 의해 표시되어 있는지 존재 여부에 조사를 안내한다. 예를 들어, 행 및 AES의 개수와 크기를 정량화하도록 설계된 실험에서, 그것의 구조가 다양한 관점에서 보이는 것을 확인하고 각 차원 (따라서 그것의 3 차원 볼륨) 범위 내에 해당 전형적인라고 할 수 있었다 구조. 구조의 위치는 또한 더 나은 축삭 신경 단자 안에, 예를 들면, 정의된다. 오히려 위 또는 아래보다. 뷰 필드는 하나의 2D 이미지 평면에 또는 3D 데이터의 단일 돌출부에 하나 국한 때 대조적으로, 추정 구조는 종종 입증 "소음." 마찬가지로, 추정 이중 표지 구조는 종종 보는 관점 (또는 2)에서 전부는 아니지만에서 일치 등장 두 구조로 입증했다. 세 개의 직교 방향에서 시각화tions 양적 및 통계 분석에 사용하기 위해 엔도 솜 또는 유사한 구조의 존재, 크기 및 표시 특성을 평가하기위한 기본 루틴 및 기준을 제공한다.

많은 연구소에서 발견 분류 종래 비디오 현미경을 사용할 수 있음에 기재된 방법은 실제적이다. 장비는 다목적보다는 전문, 상대적으로 저렴하다. 특히 현미경에 특정 소프트웨어가 여기에 사용되는 동안, 이미지 수집 및 데이터 처리 모두를위한 오픈 소스 소프트웨어는 비슷한 결과 13를 생성 할 수 있습니다. (컨볼 루션 포함) 기술은 한 빛의 노출을 사용 생활 준비에 의해 허용되는 한, 동일한 효과를 가진 단일 및 다중 광자 공 초점 영상에 적용 할 수있다. 앞으로 디자인 개선은 더욱 유틸리티 4D 라이브 영상을 향상시킬 것입니다. 이들은 초점의 속도와 여기 / 방출 필터 차를 강화 주로 하드웨어를 포함nging, 더욱 민감한 비디오 카메라의 가용성을 제공합니다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 건강 그랜트 NS-024572 (RSW에)의 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
SGC5 Biotium, Hayward, CA 70057 Final conc: 10 mM
FM1-43FX Invitrogen, Carlsbad, CA F35335 Final conc: 7 mM
LysoTracker Red Invitrogen, Carlsbad, CA L7528 Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 86 mM
KCl 60 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
Sucrose 0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm  Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA 175W Xenon arc lamp www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA www.sutter.com
Sensicam CCD camera Cooke Instruments, Tonawanda, NY www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera Photometrics, Tucson, AZ www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0 Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2 Bitplane, South Windsor, CT Drift correction; 3D and 4D data presentation www.bitplane.com
AfterEffects CS6 Adobe, San Jose, CA Drift correction www.adobe.com
ImageJ 1.46 National Institutes of Health, Bethesda, MD Multiple plugins available; Stereo pair construction http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY Stereo pair construction www.zeiss.com

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References

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