Визуализация эндосоме Dynamics в живых нервных окончаний с Четырехмерное флуоресценции изображений

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Четырехмерное (4D) визуализация используется для изучения поведения и взаимодействия между двумя типами эндосомах в живых позвоночных нервные окончания. Движение этих небольших структур характеризуется в трех измерениях, позволяя подтверждение событий, таких как эндосом синтеза и экзоцитоза.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stewart, R. S., Kiss, I. M., Wilkinson, R. S. Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51477, doi:10.3791/51477 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Четырехмерное (4D) свет визуализации была использована для изучения поведения малых структур в двигательных нервных терминалов тонкой поперечная мышца живота Подвязки змеи. Сырье данных содержит покадровой последовательности 3D Z-стеки. Каждый стек содержит 4-20 изображений, полученных с эпифлуоресцентной оптике в фокальных плоскостях, разделенных 400-1,500 нм. Шаги в приобретении стеки, таких как настройка фокуса, переключение длин волн возбуждения, и эксплуатация цифровыми камерами, автоматизированы как можно больше, чтобы максимизировать скорость изображения и уменьшения повреждения тканей от воздействия света. После приобретения, набор изображений стеков deconvolved улучшить пространственное разрешение, преобразуется в нужный формат 3D, и используется для создания 4D "кино", который подходит для разнообразных анализов компьютерных, в зависимости от экспериментальных данных стремились. Одним из применений является исследование динамического поведения двух классов эндосомах найденных в нервных окончаниях-macroendosomes (MES)и кислотные эндосомы (НЯ)-чьи размеры (200-800 нм для обоих типов) находятся на или вблизи дифракционного предела. Доступ к 3D информации в каждый момент времени обеспечивает ряд преимуществ по сравнению с обычными покадровой обработки изображений. В частности, размер и скорость движения структур может быть определена количественно с течением времени без потери фокусе. Примеры данных изображений 4D показывают, что МЭ подход плазматическую мембрану и исчезают, что указывает, что они экзоцитозу, а не просто перемещение в вертикальной плоскости от одной плоскости фокуса. Также выявлено является предполагаемый слияние МЧС и ОПЗ, по визуализации перекрытия между двумя красителей, содержащих структур, как видно на каждых трех ортогональных проекций.

Introduction

Покадровый визуализации живой ткани обеспечивает визуальный доступ к динамических структурно-функциональных отношений, которые не могут быть оценены в фиксированных или живых препаратов отображаемого в одной точке во времени. Часто, однако, плата за доступ к временной информации является уменьшение оптическим разрешением. Высокие цели масло-погружные числовая апертура непрактичны в живой ткани из-за их узкого круга внимания, оставляя погружение в воду или сухие целей в качестве единственных альтернатив. Кроме того, повышенное разрешение, обеспечиваемая конфокальных оптики не могут быть использованы в некоторых живых препаратов из-за фототоксичности от относительно высоких уровней освещенности, необходимых 1,2. Наконец, в то время как несколько в режиме реального времени или покадровой оптические методы доступны, что предложение улучшенное разрешение, их применимость ограничена препаратов, где структуры интересов могут быть расположены в пределах нескольких сотен нанометров в цели 1. Способ, описанныйиспользует относительно недорогое оборудование, является универсальным, но предлагает улучшенное разрешение по сравнению с более часто используемых методов покадровой. Он предназначен для использования в отдельных лабораторий, а также изображений объектов.

Способ использует обычную эпифлюорисцентной микроскопии, в сочетании с чувствительным цифровой камеры и с средств, предназначенных для быстро приобретать наборы изображений при слегка различных фокальных плоскостях (Z-стеки). Каждый Z-Stack имеет цифровую deconvolved увеличить разрешение. Одной из особенностей 3D покадровой (4D) изображений является точным сопровождение движущихся органеллы или другие структуры. При правильной настройке, распечатанных структуры не идут не в фокусе, и движение во всех трех направлениях можно наблюдать и количественно. Таким образом, невозможно для окрашенных структура исчезнуть в течение одного или нескольких покадровой кадров просто дрейфующими выше или ниже узкой фокальной плоскости. Способ также служит в качестве чувствительного инструмента для оценки взаимодействия и возможного фуСион малых структур. Обычные эпифлуоресцентная или конфокальной образы структур вблизи дифракционного предела (несколько сотен нм) не подтверждают слияние даже если объединены изображения показывают перекрытие их соответствующих этикеток 3. Fusion предлагается, но остается возможность, что объекты разделены горизонтально или вертикально на расстоянии, которая находится ниже дифракционного предела. Три или четыре-мерной визуализации, напротив, допускает просмотр предметов в каждом из трех ортогональных направлений. Появление синтеза во всех трех видах повышает уровень достоверности. И, в некоторых живых препаратов, направленных или броуновское движение предположительно конденсированных объектов предоставляет дополнительные доказательства, когда обе метки двигаться вместе со временем. Конечно, когда рядом с дифракционного предела уровень определенности в требовательных структур из фоне, или показывая, что они содержат две красители (фьюжн), не является абсолютным. Если это применимо, специализированные методы, такие как флуоресценции резонансной передачи энергии (FRET)4, являются более подходящими.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Пятно препарат с суправитальной красителей

  1. Для протокола вскрытия подвязка змея см. Stewart и соавт. 5 и Teng соавт. 6 Reptilian ткани остается физиологический течение более длительного времени, и с меньшим бактериального заражения, при хранении при низких температурах (см. ниже). Тканей млекопитающего, как правило, выдерживают при комнатной температуре или выше.
  2. Для окрашивания жизненно красителя лизосом, растворить краситель в холодных рептилий решений 1:5000 звонари (0,2 мкм). Инкубировать при 4 ° С в течение 15 мин. Промывают несколько раз холодной Ringers. Изображение как можно скорее.
  3. Для FM1-43 окрашивания с использованием KCl стимуляции, разбавить краску в высокой KCl Ringers 1:500 (7 мкм). Инкубируют при 4 ° С в течение 30-60 сек максимума. Вымойте быстро три раза с холодными Ringers, ~ 1 мин / полоскания. Изображение как можно скорее.
  4. Для FM1-43 окрашивания с использованием гипертонического (сахароза) стимуляции, разбавить краску в 0,5 М сахарозы Ringers как указано выше. Инкубировать при температуре 4 & #176; С в течение 2-5 мин. Вымойте, как в пункте 1.3 выше с холодными Ringers. Изображение как можно скорее.
  5. Для окрашивания FM1-43 с помощью электрической стимуляции см. Teng соавт. 6 Вкратце, препарат помещают в чашку, содержащую физиологический солевой раствор и краситель. Нерв стимулировали заданного поезда 200 мкс прямоугольных импульсов (~ 7 В, 30 Гц, 18 мкс). Вымойте, как в пункте 1.3 выше с холодными Ringers. Изображение как можно скорее.

2. Настройте Подготовка к визуализации

  1. Ориентируйте препарат так, чтобы структура интерес как можно ближе к объектива микроскопа.
  2. Если используется Инвертированный микроскоп, использовать камеру снизу которого содержит тонкую круглую крышку скольжения. Как правило, камера визуализации должны иметь тонкий из нержавеющей стали дно с 25 мм Диаметр # 1 толщина стекла покровным в центре. Если используется прямой микроскоп, нижнюю покровное не требуется, но полезноразрешить изображений с проходящего света (например, дифференциальное отличие вмешательства, ДВС-синдром), чтобы ориентировать образец и найти объекты, представляющие интерес.
  3. Выберите подходящий цели, чтобы получить максимально возможную 3D разрешение. Есть компромиссы среди числовой апертурой (NA), рабочее расстояние, увеличения и тип объектива (сухой, водо-и масло-погружение). Для тонких препаратами типа тканевых культур, задачи на нефть являются лучшими. Использование прямой микроскоп, плавать покровное стекло на водной бане, и использовать иммерсионное масло между верхней части покровного стекла и цели.
  4. Если используется деконволюция программного обеспечения, поставщик может обеспечить заданные функции рассеяния точки (НПФ) для определенных целей. Если такая информация не предоставляется, или если поддерживается цель выбрана, определить PSF по визуализации люминесцентных микроточки или аналогичные дифракционной объекты 7,8.

3. Установите требуемую глубину резкости и количества ИмаГЭС Желаемые за время покадровой Рамка

  1. Выберите общую глубину резкости, чтобы двигаться или взаимодействующих структур интерес не исчезают или не в фокусе, как они двигаются в направлении оси г. Г-поле должно слегка превышать вертикальный размер процесса клетки или клеточной которая отображается. Для позвоночных клеммах двигателя, 15-20 мкм характерно.
  2. Вычислить шаг Z-оси, необходимое для каждого приращения фокусе. Разрешение по оси изменяется в зависимости от свойств цели; это примерно одна четвертая часть ху резолюции плоскости. Если один конфокальной микроскопии или деконволюция программное обеспечение используется, улучшается разрешение ось г. Улучшение окончательное решение преднамеренным передискретизации в направлении оси г 5, но см. также шаг 3,3 ниже. Типичный интервал шага находится в диапазоне от 400-1,500 нм для целей 40-100X. Свет должен быть закрыты от между каждой г-ступенчатой ​​изображения.
  3. Выберите количество изображений в Z-Stack, а именно требуемую глубину резкости делитсяна шаг интервала. Время для завершения типичный Z-Stack составляет 1-10 сек. Быстродвижущихся объектов (100 нм / с) может быть нерезким в 3D стека изображений, потому что каждый самолет изображение соответствует несколько иной момент времени. Кроме того, каждый дополнительный изображений способствует фотообесцвечивания и возможного фототоксичности (см. Обсуждение). Если один ситуация сложилась, выбрать больший Z-стадию сбора меньше кадров в стеке. Компенсировать позже с помощью интерполяции изображений программное обеспечение (шаг 6.3 ниже).

4. Выберите Покадровый Frame Rate

Выбрать по экспериментам тариф, который просто соответствует плавно решить изменения во времени, такие как движения, взаимодействия или событий термоядерных 9. Под выборки может производить артефакты движения (ошибки выборки), в то время как передискретизация излишне увеличивает воздействие света. Сбор либо одну длинную последовательность или несколько повторяющихся последовательностей из того же препарата, каждый из которых имеет сравнительно небольшой общей временном интервале (

5. Заполните все Живая съемка для конкретного препарата

Рептильные препараты обычно оставаться устойчивым в течение ~ 1-2 часов, дольше, если охлаждением.

6. Анализ данных в соответствии с желаемого использования

  1. Сохраните все файлы исходных данных. В то время как цифровой запоминающий обычно не проблема, время обработки составляет значимой даже с быстрыми персональных компьютеров или рабочих станций. По этой причине, обрезать изображения в интересующей нас области [ROI]. Убедите, что весь регион представляет интерес в кадрированной окна в течение всего курса времени.
  2. Деконволюции изображения стеки помощью соответствующего программного обеспечения и правильной функции рассеяния точки. Убедитесь, что разрешение улучшается и что ни артефакт не была сформированаАлгоритм деконволюция. Рисунок 3 показывает пример изображения.
  3. Используйте алгоритм интерполяции расширить ось г кажущуюся разрешение. Расширение 6X от фактического изображения 1,5 мкм плоскости разделения на очевидной 0,25 разделения мкм предлагается. Вместо этого можно использовать определенное сочетание избыточной дискретизации (шаг 3.2) и интерполяции.
  4. Выполните контрастность, яркость, фильтрацию шумов, фотообесцвечивания и другие типичные настройки обработки изображений при желании. Image стандарты манипуляции диктуют, что для большинства научных работ, целесообразно, чтобы одни и те же исправления применяться ко всем изображениям, как в стеке и в различные моменты времени. Следствием конкретной регулировки следует оценивать среди всех изображений 9.
  5. Выберите конкретный режим отображения для экспорта данных. Самый простой дисплей стерео видео с использованием либо красно-зеленый или красно-синие анаглифы (примеры на рисунке 3), стерео пары или переменного влево / Рогт глаз кадры с затворных очков. Анаглифов ограничены одноцветных. Повышение кажущуюся глубину изображения при желании улучшить ось г визуальный разрешение.
  6. Поэкспериментируйте с различными методами улучшения фильтрации и изображения. Например, оператор Лапласа фильтрации можно использовать для увеличения контрастности небольших структур выше фона. Яркость пикселей при центре работает окне усиливается в то время как яркость прилегающих районах снижается. Обратите внимание, что некоторые методы фильтрации работают не очень хорошо в комбинации.
  7. Применение коррекции дрейфа если существует значительная движение препарата с течением времени. Такое движение является общим в живых мышцы, даже с препараты добавил подавить потенциалы действия и синаптические потенциалы. Алгоритм регистрации пикселей (например,. Imaris, Adobe AfterEffects, TurboReg плагин для ImageJ) выравнивает покадровой изображения и может уменьшить, но, как правило, не полностью устранить, такое движение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Данные, приведенные в от змея нервно-мышечных терминалов (см. низкие и высокие виды увеличения изображения на рисунке 3; эндоцитотический краситель (FM1-43) поглощение создает туман, который заполняет каждый Bouton) и, в частности, macroendosomes (MES) и кислотные эндосомы (НЯ) в этих терминалах 5. МЭ создаются объемной эндоцитоза во нейронной активности 10 и их число экспоненциально убывает со временем после активность перестала 6. Использование 4D живого изображения было определить, если МЭ двигаться к плазменной мембране и быстро исчезают, предполагая, что их количество уменьшается, так как некоторые из них exocytose. Все такие МЭ присутствовали на одной временной точке (и те, и раньше) и полностью исчезли в следующий момент (и тех, кто после). Таким образом, время, необходимое для исчезновения было меньше, чем наши интервала кадра (максимально коротким 30 сек) и в соответствии с экзоцитоза. Альтернативная теория, не подтверждается данными 4D, является то, что МЭ медленно рассеиваться через почкования Vesicles, пока они не исчезнут. Везикул подающий надежды происходит 6, но по крайней мере некоторые МЭ являются экзоцитозу во время или после бутонизации 5. Рисунок 1 и фильм S1 иллюстрируют исчезновение МНЕ между двумя временными интервалами кадров. МЭ суждено исчезнуть не менять форму или яркость в течение двух или более кадров (N = 16), которые были бы совместимы с медленной диссипации в течение периода времени фильма (начало несколько минут после краткого стимуляции). ME исчезновение наблюдалось ранее в обычной покадровой, но вполне возможно, что структуры попросту покинул плоскость фокуса. Кроме того, просмотр с различных точек зрения (фильм S1) подтвердил, что исчезновение ME была внезапной. С обычной живого изображения (взгляд с одной точки зрения, например, плоскость ху изображение) шума артефакты ограничить способность следователя для подтверждения, что структура не изменилась. Такие артефакты часто присутствуютв одной из точек зрения, но не других.

Электронно-микроскопические исследования показали, что эндосомы в клеммах двигателя малы по размеру, недалеко от дифракционного предела света 10. Поэтому слияние этих эндосомах не может быть абсолютно отличается от непосредственной пространственной ассоциации на уровне освещенности. МЭ метили FM1-43 (зеленый-флуоресцирующего), и ОПЗ с лизосом жизненно красителя (красно-флуоресцирующего). Структуры, которые флуоресцирующих в обоих цветах (появляясь желтый) изредка отмечается в графических записей 4D. Использование соответствующего программного обеспечения, взгляды этих двойных-меченных и поэтому, по-видимому, слитых эндосомах из различных точки зрения были созданы с целью изучения совпадение двух меток в вокселями вблизи и внутри кажущейся структуры. Рисунок 2 показывает предполагаемый слиты AE-ME если смотреть от трех ортогональных направлениях. Одна из точек зрения является плоскость ху; другие виды ортогональны этой плоскости и друг к другу. С помощью этого метода было установлено, что вокселейлибо перекрываются, как в этом примере, или что они явно не в одной или нескольких плоскостях просмотра. Movie S2 показывает то же самое предполагаемый слитый AE-ME представлены как интерактивный виртуальный дисплей реальность (полностью поворотной в 3 измерениях).

Цифровой деконволюция является полезным инструментом для повышения разрешение 3D, а также 4D изображений, как из обычного и конфокального микроскопа 11. Деконволюции является числовым, итерационный процесс, который компенсирует, в некоторой степени, для ограниченного пространственного разрешения целью используется. Эта резолюция характеризуется как объективные автора рассеяния точки функции-объема 3D занимаемой изображением бесконечно малой точке. В теории, деконволюция восстанавливает образ, который бы, если бы цель были совершенны. Рисунок 3 представляет собой 3D-вид объем двух различных наборов данных, каждый отображаемых в виде пары красно-зеленых анаглифов. Правильные изображения показывают типичное улучшение резкости после цифровой десвертки стека изображения.

Рисунок 1
Рисунок 1. Macroendosome (ME) исчезает после видимого контакта с плазматической мембраной. Змея нервно-мышечного препарата был электрически стимулировали в присутствии FM1-43. Данные были собраны с помощью 4D изображений как описано в способах и отображаются в виде "3D видах Объем" в шести точках времени (60 сек интервал), чтобы проиллюстрировать Z-глубину одного бутона. ME можно наблюдать отход от оси Y (красная пунктирная линия) на протяжении нескольких кадров, прежде чем исчезнуть между моментами времени 5 и 6. Незадолго до исчезновения, ME, кажется, находится на плазменной мембране Bouton в (очерченной FM1-43 пузырька окрашивание или "дымка"; см. рисунок 3 легенду). ME не появлялся впоздних временных точках (данные не приводятся; см. Movie S1). Шкала бар, 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

КИНО S1:. 4D покадровой виды МНЕ исчезновение Щелкните здесь для просмотра кино. того же набора исходных данных отображается на рисунке 1 показано, как "4D зрения объема» на более низком увеличении. Оригинальный последовательность покадровой состоит из 8 временных точек, отделенных друг от друга 60 сек; воспроизведение на 4 кадров / сек. Последовательность кратко остановился в начале каждого из 24 3D шагов вращение вокруг оси у (15 градусов / шаг), чтобы привлечь внимание к скоро-к-быть исчезают ME (красная стрелка). Обратите внимание, что ME видно, подходы край бутона (плазмалеммы), исчезает и не возвращается, ввсе просмотр перспективы. Из-за более низким разрешением Z-оси по сравнению с разрешением ху, форма ME-видимому, чтобы удлинить и сократить в зависимости от просмотра перспективу. Изображения были экспортированы в виде фильма QuickTime, и аннотированный с помощью QuickTime Pro. Шкала бар, 2 мкм.

Рисунок 2
Рисунок 2. Ортогональные проекции предполагаемого плавленого эндосомы. Препарат нерв мышцы последовательно окрашивали витальным красителем лизосом (красный) для обозначения ПЯ и FM1-43 (зеленый), чтобы маркировать MES с использованием 0,5 М сахарозы стимуляции как описано в способах. Данные одного момента времени кино 4D отображаются в виде 3D-просмотра объема в трех направлениях. В лучших (панелей 1-3) является обычным вид сверху (плоскости ху). В средних (панелей 4-6) представляет собой вид перпендикулярно плоскости х ив (произвольной) направлении большой красной стрелкой. В нижней (панелей 7-9) представляет собой вид взаимно перпендикулярны к обоим видом выше, в направлении большого синей стрелкой. ME (зеленый) отмечен зеленой стрелкой; два НЯ (красный) отмечены красными стрелками. Ядрышко, содержащий оба красители (желтый) отмечен желтой стрелкой в ​​панели 3, 6, и 9. Отметим, что перекрытие красный и зеленый одинаково полной во всех трех ортогональных проекций. Шкала бар, 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

КИНО S2:. Интерактивная вращение изображения, содержащего МЧС и кислотные эндосомы АЭ . Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм Набор данных рисунка 2 показана настроен как полностью вращающейся 3D-изображения (QuickTime Virtual Realiти формат; использовать мышь, чтобы вращать изображение для просмотра с любого направления). Предполагаемый слиты ME / AE остается желтый со всех точек зрения.

Рисунок 3
Рисунок 3. Деконволюция усиливает 3D пространственное разрешение. Две типичные змея нервные окончания, показанные при низкой (вверху) и высокий (внизу) увеличение соответственно и окрашенных во время стимуляции с FM1-43. FM1-43 фон "дымка", из-за маркировки отдельных пузырьков 50 нм, показана форма терминальных бутонов, в рамках которой МЭ приурочены. Данные отображаются в виде красно-зеленых анаглифов мнениями 3D объем (глубина могут быть визуализированы с красно-зеленых или красно-голубыми стеклами, красный на левый глаз; примечание аксонов в верхнем левом углу спускается в плоскости разъема с выше). Левые панели: необработанных данных; Справа панели: данные последеконволюция. Обратите внимание на значительное улучшение разрешения МЭ. Топ панели: электрическая стимуляция; Весь терминал показано (~ 30 х 50 мкм) (те же исходные данные, как на рисунке 1 и Movie S1; масштабная линейка, 10 мкм). Нижние планы: KCl стимуляции; увеличенных, чтобы показать четыре отдельных бутоны (~ 3 х 5 мкм; шкала бар, 2 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наиболее важным аспектом визуализации 4D является управление от продолжительности и интенсивности освещенности. Фотообесцвечивание уменьшается соотношение изображения сигнал-шум и может быть проблематичным или нет в зависимости от различных факторов, в том числе выбора флуорофорами. Неспецифическая повреждение живой ткани (фототоксичность) связана с фотообесцвечивания, и иногда может быть идентифицирован с помощью флуоресцентных зондов, предназначенных для этой цели 2,12 или на основании осмотра морфологии с подходящими светлого оптики, таких как дифференциальная интерференционного контраста (DIC).

Можно, однако, чтобы вызвать физиологический эффект, который происходит при освещенности значительно ниже величины, связанные с фотообесцвечивания и фототоксичности. Например, в ранних экспериментах с использованием нескольких препаратов, каждый фиксированный в другое время после стимуляции, скорость, с которой МЭ исчезли с течением времени после краткого стимуляции измеряли 6. В соответствии с общепринятой практикой то минимизации выцветания, препараты хранились в темноте, пока они не рассматривались. Когда подобные эксперименты проводились с использованием 4D живого изображения, многие другие МЭ оставался в течение всего эксперимента (~ 20-60 мин) и не исчезают. Использование одного и того же живого протокола изображений, за исключением фактически не используется для записи и тем самым ограничивая освещенность в одной 3D кадр в начале и один кадр в конце, восстановлены ожидаемый общий уровень эндосом исчезновения, что основных препаратов.

Далее устранение неисправностей показали, что скорость исчезновения был частично обратно и монотонно, связанные с общей освещенности во время эксперимента. После неудачных попыток по сокращению воздействия через обычные и многофотонных конфокальных оптики, проблема была, наконец, решена путем приобретения ~ 3x более чувствительной камеры (табл. 1). Рекомендуется, чтобы подобные сравнения быть сделано, если это возможно, в зависимости от приложения пользователя. Если некоторые рrocess или переход документируется с течением времени, убедитесь, что нет никаких изменений связано с интенсивностью или общей продолжительностью освещения. Фототоксичность и фотообесцвечивание являются краситель конкретных. Например, мы не видели значительного выцветания после многократного 4D визуализацию одного терминала (350 индивидуальных световых концентрацией свыше 30 мин) с использованием FM1-43. То же протокол визуализации с использованием аналогичный краситель, SGC5 (табл. 1), однако, привело к некоторому замирания и, по-видимому, также фототоксичность (данные не показаны).

За исключением улучшений, предоставляемых цифровой деконволюции (и конфокальной оптикой, если используется; не показаны), прямой метод описан не дает разрешение "супер". Однако метод имеет то преимущество, улучшение практического или интуитивное разрешение при просмотре живых структур, особенно те подвижные, размеры которых равна или немного больше, чем дифракционный предел. Возможность просматривать объекты с различных точек зрения, includiпрезентация нг в каждом из трех ортогональных плоскостей, направляет исследователя как на самом деле существует ли структура выше уровня шума и является ли она обозначена одним или несколькими флуорофоров. Например, в экспериментах, предназначенных для количественного определения количества и размера МОН и ПЭ, можно было подтвердить, что структура была видна с различных точек зрения, и что каждое измерение (и, следовательно, его трехмерный объем) находилась в диапазоне типично для что Структура. Расположение структуры также более четко определить, например, в пределах аксона нервной терминала, и т.д.. а не выше или ниже его. В противоположность этому, когда поле зрения было ограничено либо к одному 2D плоскости изображения или в одной проекции 3D данных, предполагаемые структуры часто оказывается "шум". Точно так же, предполагаемые двойные меченных структуры часто оказывается две структуры, которые появились совпадает с одной точки зрения просмотра (или два), но не от всех. Визуализация из трех ортогональных дирекTIONS предоставляет стандартный и текущее критерий оценки существования, размер, и маркировки характеристики эндосомах или аналогичных структур для использования в количественных и статистических анализов.

Методика описана практично в который может быть использован обычный видео микроскоп типа найти во многих лабораторий. Приборы является универсальным, а не специализированные, и относительно недороги. В то время как программное обеспечение относится к конкретному микроскопом был использован здесь, с открытым исходным кодом и для получения изображений и обработки данных может производить аналогичные результаты 13. Методы (в том числе деконволюции) применимы к одно-и многофотонной конфокальной микроскопии с аналогичными преимуществами тех пор, пока освещенность переносится препарата, используемого живого. В будущем, усовершенствования конструкции будет способствовать дальнейшему укреплению утилита 4D живого изображения. К ним относятся, в первую очередь, оборудование, что повышает скорость фокусировки и фильтра возбуждения / испускания чаnging, и доступность даже более чувствительны видеокамер.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана американского Национального института здравоохранения Грант NS-024572 (для RSW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
SGC5 Biotium, Hayward, CA 70057 Final conc: 10 mM
FM1-43FX Invitrogen, Carlsbad, CA F35335 Final conc: 7 mM
LysoTracker Red Invitrogen, Carlsbad, CA L7528 Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 86 mM
KCl 60 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
Sucrose 0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm  Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA 175W Xenon arc lamp www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA www.sutter.com
Sensicam CCD camera Cooke Instruments, Tonawanda, NY www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera Photometrics, Tucson, AZ www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0 Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2 Bitplane, South Windsor, CT Drift correction; 3D and 4D data presentation www.bitplane.com
AfterEffects CS6 Adobe, San Jose, CA Drift correction www.adobe.com
ImageJ 1.46 National Institutes of Health, Bethesda, MD Multiple plugins available; Stereo pair construction http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY Stereo pair construction www.zeiss.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122, (6), 753-767 (2009).
  2. Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
  3. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
  4. Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
  5. Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
  6. Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
  8. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
  9. Cromey, D. W. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).
  10. Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20, (21), 7986-7993 (2000).
  11. Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19, (12), 4855-4866 (1999).
  12. Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. 1495-1505 (2010).
  13. Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics