चार आयामी प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ तंत्रिका टर्मिनलों के रहने में endosome गतिशीलता के दृश्य

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

चार आयामी (4D) इमेजिंग हड्डीवाला तंत्रिका टर्मिनलों में रहने वाले endosomes के दो प्रकार के बीच व्यवहार और बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है. इन छोटे संरचनाओं का आंदोलन ऐसी endosome फ्यूजन और एक्सोसाइटोसिस रूप में की घटनाओं की पुष्टि की अनुमति, तीन आयामों में विशेषता है.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stewart, R. S., Kiss, I. M., Wilkinson, R. S. Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51477, doi:10.3791/51477 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

गेटिस साँप की मांसपेशी Abdominis चार आयामी (4D) प्रकाश इमेजिंग पतली transversus की मोटर तंत्रिका टर्मिनलों के भीतर छोटे संरचनाओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. कच्चे डेटा 3D Z-ढेर के समय चूक दृश्यों शामिल हैं. प्रत्येक स्टैक 400-1,500 एनएम द्वारा अलग फोकल विमानों पर epifluorescence प्रकाशिकी के साथ प्राप्त कर लिया 4-20 चित्र शामिल हैं. इस तरह के ध्यान के समायोजन के रूप में छवि के ढेर, के अधिग्रहण में कदम, उत्तेजना तरंग दैर्ध्य की स्विचिंग, और डिजिटल कैमरा के आपरेशन, छवि दर को अधिकतम और प्रकाश जोखिम से ऊतकों को नुकसान को कम करने के लिए संभव के रूप में ज्यादा के रूप में स्वचालित रहे हैं. अधिग्रहण के बाद, छवि के ढेर का एक सेट स्थानिक संकल्प में सुधार के लिए deconvolved है, वांछित 3 डी स्वरूप में परिवर्तित, और एक 4D "फिल्म" कि मांग की प्रयोगात्मक डेटा पर निर्भर करता है, कंप्यूटर आधारित विश्लेषण की विविधता के लिए उपयुक्त है बनाने के लिए इस्तेमाल किया. One आवेदन तंत्रिका टर्मिनलों-macroendosomes में पाया endosomes के दो वर्गों (एमईएस) के गतिशील व्यवहार का अध्ययन हैऔर (एईएस) जिसका आकार (दोनों प्रकार के लिए 200-800 एनएम) अम्लीय endosomes विवर्तन सीमा पर या पास हैं. हर समय बिंदु पर 3 डी सूचना तक पहुंच परम्परागत समय चूक इमेजिंग पर कई लाभ प्रदान करता है. विशेष रूप से, आकार और संरचनाओं के आंदोलन का वेग तेज ध्यान की हानि के बिना समय के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. 4D इमेजिंग से डेटा के उदाहरणों में वे exocytosed बजाय बस खड़ी दूर ध्यान देने का एक ही विमान से आगे बढ़ रहे हैं, सुझाव है कि एमईएस प्लाज्मा झिल्ली दृष्टिकोण और गायब हो जाते हैं कि पता चलता है. इसके अलावा प्रत्येक तीन orthogonal के अनुमानों में देखा के रूप में दो डाई युक्त संरचनाओं के बीच ओवरलैप के दृश्य से एमईएस और एईएस के ख्यात फ्यूजन है, का पता चला.

Introduction

ऊतक रहने के समय चूक इमेजिंग समय में एक ही बिंदु पर imaged निश्चित या रहने तैयारी में सराहना नहीं की जा सकती कि dynamical संरचना समारोह संबंधों के लिए दृश्य पहुँच प्रदान करता है. अक्सर बहरहाल, लौकिक जानकारी के लिए उपयोग के लिए tradeoff ऑप्टिकल संकल्प में कमी है. उच्च संख्यात्मक एपर्चर तेल विसर्जन उद्देश्यों को ही विकल्प के रूप में पानी विसर्जन या सूखी उद्देश्यों को छोड़ रहा है, क्योंकि फोकस के अपने सीमित दायरे के रहने वाले ऊतक में अव्यावहारिक है. इसके अलावा, confocal प्रकाशिकी द्वारा सकती वृद्धि के प्रस्ताव रोशनी के अपेक्षाकृत उच्च स्तर 1,2 आवश्यकता से phototoxicity के कारण कुछ जीने की तैयारी में उपयोग नहीं किया जा सकता. कई वास्तविक समय या समय चूक ऑप्टिकल तकनीक है कि प्रस्ताव बढ़ाया संकल्प उपलब्ध हैं, जबकि अन्त में, जो उनकी प्रयोज्यता ब्याज की संरचनाओं उद्देश्य 1 से कुछ सौ नैनोमीटर के भीतर तैनात किया जा सकता है, जहां तैयारी तक सीमित है. वर्णित विधि, अपेक्षाकृत कम कीमत वाले उपकरणों का उपयोग करता है बहुमुखी है, अभी तक अधिक सामान्य रूप से प्रयुक्त समय व्यतीत तकनीक की तुलना में सुधार के प्रस्ताव प्रदान करता है. यह व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं के साथ ही इमेजिंग सुविधाओं में उपयोग के लिए है.

विधि एक संवेदनशील डिजिटल कैमरा के साथ और तेजी से थोड़ा अलग फोकल विमानों (z-ढेर) में छवियों के सेट प्राप्त करने के लिए हार्डवेयर डिजाइन के साथ संयुक्त, पारंपरिक epifluorescence माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल करता. प्रत्येक z ढेर डिजिटली संकल्प को बढ़ाने के लिए deconvolved है. 3D समय चूक (4D) इमेजिंग की एक विशेषता यह organelles या अन्य संरचनाओं को हिलाने की सटीक ट्रैकिंग है. ठीक से सेट किया है, imaged संरचनाओं ध्यान से बाहर जाना नहीं है, और सभी तीन दिशाओं में आंदोलन मनाया और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. एक दाग संरचना केवल एक संकीर्ण फोकल हवाई जहाज़ के ऊपर या नीचे बहती से एक या एक से अधिक समय व्यतीत हो जाने के तख्ते पर गायब करने के लिए इस प्रकार यह असंभव है. विधि भी बातचीत और संभव फू का आकलन करने के लिए एक संवेदनशील उपकरण के रूप में कार्य करता हैछोटे संरचनाओं के सायन. परम्परागत epifluorescence या सीमा विवर्तन (कुछ सौ एनएम) के पास संरचनाओं के confocal छवियों विलय कर छवियों उनके संबंधित लेबल 3 के ओवरलैप दिखाने भले ही फ्यूजन की पुष्टि नहीं करते. फ्यूजन का सुझाव दिया, लेकिन यह वस्तुओं विवर्तन सीमा से नीचे है कि एक दूरी से क्षैतिज या खड़ी अलग हो रहे हैं कि संभव बना रहता है. तीन या चार आयामी इमेजिंग, इसके विपरीत, तीन orthogonal दिशाओं में से प्रत्येक में वस्तुओं को देखने के लिए परमिट. सभी तीन दृश्यों में संलयन की उपस्थिति निश्चितता के स्तर बढ़ जाता है. और, कुछ जीने की तैयारी में, निर्देशित या दोनों लेबल समय में एक साथ ले जाने पर कथित रूप से जुड़े हुए वस्तुओं की ब्राउनियन आंदोलन आगे सबूत प्रदान करता है. बेशक, जब विवर्तन सीमा के निकट पृष्ठभूमि से समझदार संरचनाओं में निश्चितता, या वे दो रंगों (फ्यूजन) होते हैं कि दिखाने का स्तर, निरपेक्ष नहीं है. अगर इस तरह के प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) के रूप में लागू हो, विशेष तकनीक,4, अधिक उपयुक्त हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Supravital रंगों के साथ तैयारी दाग

  1. गेटिस साँप विच्छेदन प्रोटोकॉल के लिए स्टीवर्ट एट अल. 5 देखें और टेंग एट अल. 6 साँप ऊतक अब समय के लिए शारीरिक रहता है, और कम जीवाणु संक्रमण के साथ, (देखें नीचे) कम तापमान पर रखा जाता है. स्तनधारी ऊतकों आमतौर पर कमरे के तापमान या उच्च पर बनाए रखा है.
  2. Lysosomal महत्वपूर्ण डाई धुंधला के लिए, ठंड साँप Ringers समाधान 1:5,000 (0.2 माइक्रोन) में डाई भंग. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. ठंड Ringers के साथ कई बार धोएं. जितनी जल्दी हो सके छवि.
  3. KCl उत्तेजना का उपयोग FM1-43 धुंधला के लिए, उच्च KCl Ringers 1:500 (7 माइक्रोन) में डाई पतला. 30-60 सेकंड अधिकतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. ~ 1 मिनट / कुल्ला, ठंड Ringers के साथ जल्दी से तीन बार धोएं. जितनी जल्दी हो सके छवि.
  4. अतिपरासारी (सूक्रोज) उत्तेजना का उपयोग FM1-43 धुंधला के लिए, के रूप में ऊपर 0.5 एम सुक्रोज Ringers में डाई पतला. 4 & # सेते176; 2-5 मिनट के लिए सी. ठंड Ringers साथ ऊपर 1.3 चरण में के रूप में धो लें. जितनी जल्दी हो सके छवि.
  5. FM1-43 धुंधला के लिए बिजली की उत्तेजना के माध्यम से, टेंग एट अल. 6 संक्षेप में देखते हैं, तैयारी शारीरिक खारा समाधान और डाई युक्त पकवान रखा गया है. तंत्रिका 200 μsec आयताकार दालों (~ 7 वी, 30 हर्ट्ज, 18 μsec) की एक preprogrammed ट्रेन के साथ प्रेरित है. ठंड Ringers साथ ऊपर 1.3 चरण में के रूप में धो लें. जितनी जल्दी हो सके छवि.

2. इमेजिंग के लिए तैयारी विन्यस्त करें

  1. ब्याज की संरचनाओं खुर्दबीन उद्देश्य के लिए संभव के रूप में बंद कर रहे हैं कि इतनी तैयारी पूरबी.
  2. एक औंधा माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जाता है, तो जिनके नीचे एक पतली दौर कवर पर्ची शामिल एक कक्ष का उपयोग. आमतौर पर, इमेजिंग कक्ष केंद्र में एक 25 मिमी व्यास # 1 मोटाई गिलास को कवर पर्ची के साथ एक पतली स्टेनलेस स्टील नीचे होना चाहिए. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जाता है, तो एक नीचे coverslip आवश्यक लेकिन उपयोगी है नहीं हैप्रेषित प्रकाश के साथ इमेजिंग की अनुमति के लिए (जैसे अंतर हस्तक्षेप विपरीत, डीआईसी) नमूना पूरबी और ब्याज की वस्तुओं का पता लगाने के लिए.
  3. उच्चतम संभव 3D संकल्प प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त उद्देश्य चुनें. Tradeoffs संख्यात्मक एपर्चर लेंस की (एनए), दूरी काम, बढ़ाई, और प्रकार के बीच में कर रहे हैं (सूखा, पानी और तेल विसर्जन). ऊतक संस्कृतियों की तरह पतली तैयारी के लिए, तेल उद्देश्यों सबसे अच्छा कर रहे हैं. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, जलीय स्नान पर एक कवर पर्ची नाव, और कवर पर्ची के शीर्ष और उद्देश्य के बीच विसर्जन के तेल का उपयोग करें.
  4. Deconvolution सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया जाता है, तो विक्रेता निश्चित उद्देश्यों के लिए पूर्व निर्धारित बिंदु प्रसार कार्य (PSFs) प्रदान हो सकता है. ऐसी कोई जानकारी प्रदान की, या किसी असमर्थित उद्देश्य चुना है, फ्लोरोसेंट microdots या इसी तरह विवर्तन सीमित वस्तुओं 7,8 इमेजिंग द्वारा पीएसएफ निर्धारित है.

3. वांछित क्षेत्र की गहराई और भारतीय सैन्य अकादमी के नंबर की स्थापनासमय चूक फ्रेम प्रति वांछित GES

  1. क्षेत्र की कुल गहराई का चयन इतना है कि चलती है या ब्याज की संरचनाओं गायब या वे z-दिशा में ले जाने के रूप में ध्यान से बाहर जाना नहीं है बातचीत. Z-क्षेत्र थोड़ा imaged किया जा रहा सेल या कोशिका प्रक्रिया के ऊर्ध्वाधर आयाम से अधिक होना चाहिए. हड्डीवाला मोटर टर्मिनलों के लिए, 15-20 माइक्रोन खासियत है.
  2. ध्यान की प्रत्येक वेतन वृद्धि के लिए आवश्यक Z-अक्ष कदम की गणना. Z-अक्ष के साथ संकल्प उद्देश्य के गुणों पर निर्भर करता है; यह xy विमान संकल्प के बारे में एक चौथाई है. Confocal इमेजिंग या deconvolution सॉफ्टवेयर भी इस्तेमाल किया जाता है, तो z-अक्ष संकल्प सुधार हुआ है. Z-दिशा 5 में जानबूझकर oversampling द्वारा अंतिम संकल्प में सुधार, लेकिन यह भी नीचे 3.3 कदम देखें. एक ठेठ कदम अंतराल 40-100X उद्देश्यों के लिए 400-1,500 एनएम से रेंज में है. लाइट प्रत्येक Z-कदम छवि के बीच बंद बंद किया जाना चाहिए.
  3. Z ढेर प्रति छवियों की संख्या का चयन करें, अर्थात् क्षेत्र के वांछित गहराई विभाजितकदम अंतराल से. एक ठेठ z ढेर पूरा करने का समय 1-10 सेकंड है. प्रत्येक छवि विमान एक अलग समय बिंदु से मेल खाती है, क्योंकि तेजी से बढ़ वस्तुओं (100 एनएम / सेक) एक 3 डी छवि ढेर में धुंधला दिखाई दे सकता है. इसके अलावा, प्रत्येक अतिरिक्त छवि photobleaching और संभव phototoxicity (चर्चा देखने के लिए) के लिए योगदान देता है. किसी भी स्थिति से संबंधित है, तो ढेर प्रति कम छवियों को इकट्ठा करने के लिए एक बड़ा z कदम चुनें. छवि प्रक्षेप सॉफ्टवेयर (नीचे कदम 6.3) का उपयोग बाद में क्षतिपूर्ति.

4. समय चूक फ्रेम दर चुनें

सुचारू रूप से इस तरह के आंदोलन, बातचीत या संलयन घटनाओं 9 के रूप में समय के साथ परिवर्तन को हल करने के लिए अभी पर्याप्त है कि एक दर प्रयोग से चुनें. Oversampling अनावश्यक रूप से प्रकाश के संपर्क में बढ़ जाती है, जबकि नमूना के तहत, गति कलाकृतियों के नमूने (त्रुटियों) का उत्पादन कर सकते हैं. एक लंबी अनुक्रम या एक ही तैयारी, एक अपेक्षाकृत छोटे कुल समय अंतराल के साथ प्रत्येक (से कई दोहराया दृश्यों या तो लीजिए

5. एक विशेष तैयारी के लिए सभी लाइव इमेजिंग पूरा

साँप तैयारी आम तौर पर ठंडा रह गया है, तो ~ 1-2 घंटे के लिए मजबूत रहते हैं.

6. वांछित उपयोग के अनुसार डेटा का विश्लेषण

  1. सभी कच्चे डेटा फ़ाइलों को बनाये रखें. डिजिटल भंडारण आमतौर पर एक समस्या नहीं है, प्रसंस्करण समय भी तेजी से पर्सनल कंप्यूटर या कार्यस्थानों के साथ महत्वपूर्ण है. इस कारण से, ब्याज [आरओआई] के एक क्षेत्र में फसल छवियों. ब्याज की पूरे क्षेत्र में पूरे समय के दौरान फसली खिड़की में है कि आश्वासन देता हूं.
  2. Deconvolve छवि उपयुक्त सॉफ्टवेयर और सही बात फैल समारोह का उपयोग कर ढेर. उस संकल्प में सुधार हुआ है की पुष्टि और कहा कि कोई विरूपण साक्ष्य द्वारा उत्पन्न किया गया हैdeconvolution एल्गोरिथ्म. चित्रा 3 उदाहरण छवियों को दिखाता है.
  3. Z-अक्ष स्पष्ट संकल्प का विस्तार करने के लिए एक प्रक्षेप एल्गोरिथ्म का प्रयोग करें. एक स्पष्ट 0.25 माइक्रोन जुदाई के लिए एक वास्तविक 1.5 माइक्रोन छवि विमान जुदाई से एक 6X विस्तार का सुझाव दिया है. वैकल्पिक रूप से, oversampling के कुछ संयोजन (3.2 कदम) और प्रक्षेप का उपयोग करें.
  4. अगर वांछित इसके विपरीत, चमक, शोर फ़िल्टरिंग, photobleaching और अन्य विशिष्ट छवि प्रसंस्करण समायोजन प्रदर्शन करना. छवि हेरफेर मानकों सबसे अधिक वैज्ञानिक काम के लिए, यह एक ही सुधार एक ढेर के भीतर और अलग अलग समय बिंदुओं पर दोनों, सभी छवियों के लिए लागू किया है कि उचित है कि हुक्म. एक विशेष समायोजन का परिणाम सभी छवियों 9 के बीच मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
  5. डेटा के निर्यात के लिए एक विशेष प्रदर्शन मोड का चयन करें. सबसे सरल प्रदर्शन हरी लाल या लाल नीले anaglyphs (चित्रा 3 में उदाहरण), स्टीरियो जोड़े, या बारी का उपयोग स्टीरियो वीडियो है righ / छोड़ाटी आंख शटर चश्मे के साथ फ्रेम. Anaglyphs एकल रंग तक ही सीमित हैं. Z-अक्ष दृश्य संकल्प में सुधार करने के लिए अगर वांछित स्पष्ट छवि गहराई में वृद्धि.
  6. विभिन्न फ़िल्टरिंग और छवि सुधारने तकनीकों के साथ प्रयोग. उदाहरण के लिए, Laplacian छानने पृष्ठभूमि के ऊपर छोटे संरचनाओं के विपरीत बढ़ाने के लिए उपयोगी है. आसपास के क्षेत्रों की चमक कम हो जाता है, जबकि एक चल खिड़की के केंद्र में पिक्सेल की चमक बढ़ी है. कुछ फ़िल्टरिंग तरीकों संयोजन में अच्छी तरह से काम नहीं करती है.
  7. समय के साथ तैयारी की पर्याप्त आंदोलन अगर वहाँ बहाव सुधार लागू करें. इस तरह के आंदोलन दवाओं कार्रवाई क्षमता और synaptic क्षमता को दबाने के लिए जोड़ा भी साथ, मांसपेशियों में रहने वाले आम है. एक पिक्सेल पंजीकरण एल्गोरिथ्म (जैसे. Imaris, एडोब aftereffects के, ImageJ के लिए TurboReg प्लगइन) समय चूक छवियों aligns और कम कर सकते हैं, लेकिन आम तौर पर पूरी तरह से, इस तरह के प्रस्ताव को समाप्त नहीं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

दिखाया गया डेटा (चित्रा 3 में कम और उच्च वृद्धि दृश्य देख; endocytic डाई (FM1-43) तेज प्रत्येक bouton भरता है कि एक धुन्ध बनाता है) सांप neuromuscular टर्मिनलों से कर रहे हैं और विशेष रूप से, macroendosomes (एमईएस) और अम्लीय endosomes (एईएस) इन टर्मिनलों 5 भीतर. एमईएस तंत्रिका गतिविधि 10 के दौरान थोक endocytosis द्वारा बनाई गई और गतिविधि 6 रह गया है के बाद उनकी संख्या समय के साथ तेजी से गिरावट आती रहे. 4D लाइव इमेजिंग के उपयोग उनमें से कुछ exocytose क्योंकि उनकी संख्या कम हो जाती है, सुझाव है कि एमईएस प्लाज्मा झिल्ली की ओर ले जाने के लिए तय अगर और जल्दी से गायब करने के लिए था. ऐसे सभी एमईएस एक समय बिंदु पर मौजूद है (और पहले उन) और पूरी तरह से अगली बार बिंदु पर चला गया (और बाद उन) थे. इस प्रकार लापता होने के लिए आवश्यक समय हमारे फ्रेम अंतराल (30 सेकंड के रूप में के रूप में कम) और एक्सोसाइटोसिस साथ संगत से भी कम था. 4D डेटा द्वारा समर्थित नहीं एक वैकल्पिक सिद्धांत, एमईएस धीरे धीरे वी के नवोदित के माध्यम से नष्ट करना हैवे गायब हो जब तक esicles. पुटिका नवोदित 6 होता है, लेकिन कम से कम कुछ एमईएस के दौरान या 5 नवोदित बाद या तो exocytosed रहे हैं. 1 चित्रा और मूवी S1 दो समय चूक फ्रेम के बीच मुझे एक के लापता होने के उदाहरण देकर स्पष्ट करना. गायब हो किस्मत में एमईएस (संक्षिप्त उत्तेजना के बाद कई मिनट शुरुआत) फिल्म की समयावधि के दौरान धीमी अपव्यय के साथ संगत किया गया होता है, जो दो या अधिक फ्रेम (n = 16) से अधिक आकार या चमक बदलाव नहीं किया. इ लापता होने पारंपरिक समय चूक में पहले से मनाया, लेकिन यह संरचनाओं बस ध्यान देने का विमान छोड़ दिया था कि संभव था. इसके अलावा, दृष्टिकोण (मूवी S1) की एक किस्म से देखने इ लापता होने अचानक था कि पुष्टि की. पारंपरिक रहते इमेजिंग के साथ (एक ही नजरिए से देख रहे हैं, जैसे XY छवि विमान) शोर कलाकृतियों एक संरचना अपरिवर्तित रहा था कि पुष्टि करने के लिए अन्वेषक की क्षमता को सीमित. इस तरह की कलाकृतियों अक्सर मौजूद हैंलेकिन दूसरों को नहीं एक दृश्य में.

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन मोटर टर्मिनलों में endosomes प्रकाश 10 के विवर्तन सीमा के निकट, आकार में छोटे होते हैं कि पता चला है. इन endosomes इसलिए फ्यूजन बिल्कुल प्रकाश स्तर पर बंद हुआ स्थानिक संघ से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है. एमईएस एक lysosomal महत्वपूर्ण डाई (लाल fluorescing) के साथ FM1-43 (हरी fluorescing), और एईएस के साथ लेबल रहे थे. (पीला दिखने) दोनों रंग में fluoresced संरचनाओं कि कभी कभी 4D छवि रिकॉर्ड में नोट कर रहे थे. उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, परिप्रेक्ष्य की एक किस्म से इन डबल लेबल और इसलिए जाहिरा तौर पर जुड़े हुए endosomes के विचारों के निकट और स्पष्ट संरचना के भीतर voxels में दो लेबल के संयोग की जांच के क्रम में उत्पन्न किया गया. 2 आंकड़ा एक ख्यात जुड़े हुए एई मुझे पता चलता है तीन orthogonal दिशाओं से देखा के रूप में. एक राय यह xy विमान है; अन्य दृश्यों कि विमान के लिए और एक दूसरे के लिए orthogonal रहे हैं. इस पद्धति का उपयोग करके यह पाया गया कि voxelsवे स्पष्ट रूप से एक या एक से अधिक देखने के विमानों में नहीं किया था इस उदाहरण के रूप में, या कि, छा या तो. मूवी S2 एई इ (3 आयामों में पूरी तरह से rotatable) एक इंटरैक्टिव आभासी वास्तविकता प्रदर्शन के रूप में प्रस्तुत जुड़े हुए एक ही ख्यात पता चलता है.

डिजिटल deconvolution पारंपरिक और confocal दोनों सूक्ष्मदर्शी 11 से, 3 डी का संकल्प के साथ ही 4D छवियों को बढ़ाने के लिए एक उपयोगी उपकरण है. Deconvolution इस्तेमाल किया उद्देश्य के सीमित स्थानिक संकल्प के लिए, कुछ हद तक क्षतिपूर्ति कि एक संख्यात्मक, चलने की प्रक्रिया है. यह संकल्प एक अत्यल्प बिंदु की छवि के कब्जे उद्देश्य की बात फैल समारोह-3D मात्रा के रूप में होती है. सिद्धांत रूप में, deconvolution उद्देश्य सही थे, तो नतीजा होगा कि छवि पुनर्स्थापित करता है. 3 लाल हरे anaglyphs की एक जोड़ी के रूप में प्रदर्शित दो अलग डेटा सेट, प्रत्येक का एक 3 डी की मात्रा देखें आंकड़ा है. सही छवियों डिजिटल डे के बाद तीखेपन में विशिष्ट सुधार दिखाछवि ढेर के कनवल्शनफ़िल्टर्स.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक macroendosome (इ) प्लाज्मा झिल्ली के साथ स्पष्ट संपर्क के बाद गायब हो जाता है. एक सांप तंत्रिका पेशी तैयारी विद्युत FM1-43 की उपस्थिति में प्रेरित किया गया था. डेटा के तरीके में वर्णित है और एक भी bouton के Z-गहराई को वर्णन करने के लिए छह समय अंक (60 सेकंड के अंतराल) में "3 डी की मात्रा दृश्य" के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं के रूप में 4D इमेजिंग का उपयोग कर एकत्र किए गए थे. एक मुझे समय अंक 5 और 6 के बीच गायब होने से पहले कई तख्ते पर दूर वाई अक्ष (लाल धराशायी लाइन) से आगे बढ़ मनाया जा सकता है. बस लापता होने से पहले, मुझे FM1-43 पुटिका द्वारा चित्रित bouton के प्लाज्मा झिल्ली (पर स्थित होना प्रतीत होता है धुंधला या "धुंध") चित्रा 3 किंवदंती देखें. इ में फिर से प्रकट नहीं किया थाबाद में समय अंक (नहीं दिखाया डेटा, मूवी S1 देखें). स्केल बार, 2 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

फिल्म S1:. इ की 4D समय चूक दृश्य लापता होने के फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें. चित्र 1 में प्रदर्शित ही कच्चे डेटा सेट एक कम बढ़ाई पर एक "4D मात्रा दृश्य" के रूप में दिखाया गया है. मूल समय चूक अनुक्रम 8 समय अंक, 60 सेकंड के द्वारा अलग प्रत्येक शामिल हैं; प्लेबैक / सेक 4 तख्ते पर है. अनुक्रम संक्षेप की ओर ध्यान आकर्षित करने के लिए शाफ़्ट (15 डिग्री / कदम) के बारे में 24 3 डी रोटेशन चरणों में से प्रत्येक की शुरुआत में रोक दिया गया है जल्द ही किया जा इ (लाल तीर) गायब. मुझे दिख रहा है कि नोट bouton (प्लाज्मा झिल्ली) की बढ़त गायब हो जाता है दृष्टिकोण है, और में, वापस नहीं करता हैसभी को देखने के दृष्टिकोण. क्योंकि कम z-अक्ष संकल्प के XY संकल्प की तुलना में, मेरे आकार लंबा और परिप्रेक्ष्य को देखने के आधार पर छोटा करने के लिए प्रकट होता है. छवियाँ एक QuickTime फिल्म के रूप में निर्यात किया, और प्रो QuickTime का उपयोग एनोटेट गया. स्केल बार, 2 माइक्रोन.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक ख्यात जुड़े हुए endosome के orthogonal देखा गया. एक तंत्रिका पेशी तैयारी क्रमिक रूप से तरीके में वर्णित के रूप में 0.5 एम सुक्रोज उत्तेजना का उपयोग एमईएस लेबल करने एईएस और FM1-43 (हरा) लेबल करने के लिए एक lysosomal महत्वपूर्ण डाई (लाल) के साथ सना हुआ था. एक 4D फिल्म से एक बार बिंदु से डाटा तीन झुकाव में 3 डी की मात्रा विचारों के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं. शीर्ष (पैनल 1-3) से कम (xy विमान) ऊपर से पारंपरिक दृश्य है. मध्य (पैनल 4-6) में XY विमान को सीधा एक दृश्य है औरबड़ी लाल तीर की (मनमाना) दिशा में. नीचे (पैनल 7-9) उपरोक्त दोनों के विचारों को परस्पर सीधा एक दृश्य के बड़े नीले तीर की दिशा में है. एक इ (हरा) एक हरा तीर से चिह्नित किया गया है; दो एईएस (लाल) लाल तीर से चिह्नित कर रहे हैं. (पीला) दोनों रंगों से युक्त एक endosome पैनल 3, 6 में एक पीले तीर द्वारा चिह्नित है, और 9. लाल और हरे रंग के सभी तीन orthogonal के अनुमानों में समान रूप से पूरा हो गया है की कि ओवरलैप नोट है. स्केल बार, 2 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

फिल्म S2:. एमईएस और अम्लीय endosomes एईएस युक्त छवि के इंटरएक्टिव रोटेशन . फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें चित्रा 2 के डेटा सेट एक पूरी तरह से rotatable 3 डी छवि (QuickTime वर्चुअल Reali के रूप में विन्यस्त दिखाया गया हैप्रारूप Ty; ) किसी भी दिशा से देखने के लिए छवि को घुमाने के लिए माउस का उपयोग करें. ख्यात इ जुड़े हुए / एई सभी दृष्टिकोणों से पीला रहता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. Deconvolution 3D स्थानिक संकल्प को बढ़ाता है. दो कम (ऊपर) में दिखाया ठेठ साँप तंत्रिका टर्मिनलों, और उच्च (नीचे) बढ़ाई क्रमशः और FM1-43 के साथ उत्तेजना के दौरान दाग. FM1-43 पृष्ठभूमि "धुंध" के कारण व्यक्ति 50 एनएम vesicles की लेबलिंग के लिए, एमईएस ही सीमित हैं जो भीतर टर्मिनल BOUTONS के आकार से पता चलता है. डेटा (; बाईं आंख पर लाल, ऊपरी बाएँ पर नोट अक्षतंतु ऊपर से टर्मिनल के विमान में उतरता गहराई हरी लाल या लाल नीले चश्मे के साथ देखे जा सकते हैं) 3 डी मात्रा दर्शनों की लाल हरे anaglyphs के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं. वाम पैनल: कच्चे डेटा; सही पैनल: डेटा के बादdeconvolution. एमईएस के समाधान में महत्वपूर्ण सुधार ध्यान दें. शीर्ष पैनल: विद्युत उत्तेजना; पूरे टर्मिनल (~ 30 x 50 माइक्रोन) (; पैमाने पर पट्टी, 10 माइक्रोन चित्रा 1 और मूवी S1 के रूप में ही कच्चे डेटा) दिखाया. नीचे पैनलों: KCl उत्तेजना; चार व्यक्ति BOUTONS (~ 3 एक्स 5 माइक्रोन; पैमाने पर पट्टी, 2 माइक्रोन) को दिखाने के लिए बढ़ाया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

4D इमेजिंग का सबसे महत्वपूर्ण पहलू प्रकाश जोखिम की अवधि और तीव्रता का प्रबंधन है. Photobleaching छवि संकेत करने वाली शोर अनुपात कम हो जाती है और fluorophores के चुनाव सहित विभिन्न कारकों पर निर्भर करता है समस्याग्रस्त या नहीं हो सकता है. जीवित ऊतक (phototoxicity) को अविशिष्ट क्षति photobleaching से संबंधित है, और कभी कभी उद्देश्य 2,12 के लिए या इस तरह के अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) के रूप में उपयुक्त brightfield प्रकाशिकी, साथ आकृति विज्ञान की परीक्षा द्वारा डिजाइन फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग कर पहचाना जा सकता है.

यह अच्छी तरह से photobleaching और phototoxicity से जुड़े लोगों के परिमाण नीचे प्रकाश के स्तर पर होता है कि एक शारीरिक प्रभाव उत्पन्न करने के लिए, हालांकि, संभव है. उदाहरण के लिए, कई तैयारी का उपयोग कर जल्दी प्रयोगों में, प्रत्येक उत्तेजना के बाद एक अलग समय पर तय हो, एमईएस एक संक्षिप्त उत्तेजना के बाद समय के साथ गायब हो गया, जिस पर दर 6 मापा गया था. मानक व्यवहार है जैसावे देखा गया जब तक ओ लुप्त होती कम से कम, तैयारी अंधेरे में रखा गया. इसी तरह के प्रयोगों 4D रहते इमेजिंग का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे थे, बहुत से अधिक एमईएस प्रयोग (~ 20-60 मिनट) भर में बने रहे और गायब नहीं था. वास्तव में रिकॉर्डिंग और जिससे शुरुआत में एक भी 3 डी फ्रेम और अंत में एक भी फ्रेम को प्रकाश जोखिम को सीमित नहीं अलावा एक ही रहते इमेजिंग प्रोटोकॉल, का प्रयोग करें, तय तैयारी की है कि endosome लापता होने की उम्मीद समग्र दर बहाल.

इसके अलावा समस्या निवारण लापता होने की दर inversely, भाग में था और monotonically एक प्रयोग के दौरान कुल प्रकाश जोखिम से संबंधित संकेत दिया कि. पारंपरिक और multiphoton confocal प्रकाशिकी के माध्यम से जोखिम को कम करने के लिए असफल प्रयासों के बाद, समस्या अंत में एक ~ 3x अधिक संवेदनशील कैमरा (1 टेबल) की खरीद के द्वारा हल किया गया था. यह संभव हो तो इसी तरह की तुलना उपयोगकर्ता के आवेदन के आधार पर बनाया जा सिफारिश की है. यदि कुछ पीrocess या संक्रमण तीव्रता या रोशनी की कुल अवधि के कारण कोई संशोधन नहीं है कि इस बात की पुष्टि, समय के साथ प्रलेखित किया जा रहा है. Phototoxicity और photobleaching डाई विशिष्ट हैं. उदाहरण के लिए, हम एक टर्मिनल का कोई महत्वपूर्ण लुप्त होती के बाद दोहराया 4D इमेजिंग FM1-43 का उपयोग (30 मिनट से अधिक 350 व्यक्ति प्रकाश जोखिम) को देखा. इसी तरह की एक डाई, SGC5 (1 टेबल) का उपयोग कर एक ही इमेजिंग प्रोटोकॉल, हालांकि, कुछ लुप्त होती में हुई और, शायद, phototoxicity के रूप में अच्छी तरह से (नहीं दिखाया डेटा).

(अगर इस्तेमाल और confocal प्रकाशिकी; नहीं दिखाया गया है) डिजिटल deconvolution द्वारा प्रदान सुधार के अपवाद के साथ, वर्णित सरल तरीका नहीं "सुपर" संकल्प प्रदान करता है. हालांकि, विधि जिसका आकार में है या विवर्तन सीमा से थोड़ा बड़ा रहने संरचनाओं, विशेष रूप से चलती हैं, जब देखने व्यावहारिक या सहज ज्ञान युक्त संकल्प में सुधार का लाभ दिया है. विभिन्न दृष्टिकोण से includi वस्तुओं को देखने की क्षमतातीन orthogonal विमानों में से प्रत्येक में एनजी प्रस्तुति, एक संरचना वास्तव में शोर के स्तर से ऊपर है और यह एक या एक से अधिक fluorophores द्वारा लेबल है कि क्या मौजूद है के रूप में अन्वेषक गाइड. उदाहरण के लिए, एमईएस और एईएस की संख्या और आकार quantitate डिजाइन प्रयोग में, यह संरचना विभिन्न दृष्टिकोणों से दिखाई दे रहा था कि इस बात की पुष्टि और प्रत्येक आयाम (और इसलिए अपने तीन आयामी मात्रा) सीमा के भीतर उस के लिए विशिष्ट था कि संभव हो गया था संरचना. एक संरचना का स्थान भी बेहतर एक अक्षतंतु, तंत्रिका टर्मिनल आदि के भीतर, उदाहरण के लिए, परिभाषित किया गया है. बल्कि यह ऊपर या नीचे से. देखने के क्षेत्र एक भी 2 डी छवि विमान को या 3 डी डेटा की एक एकल प्रक्षेपण के लिए या तो सीमित था जब इसके विपरीत,, ख्यात संरचनाओं अक्सर साबित हुई "शोर." इसी तरह, ख्यात डबल लेबल संरचनाओं अक्सर एक को देखने के नजरिए (या दो) से नहीं बल्कि सभी से संपाती दिखाई दिया कि दो संरचनाओं साबित हुई. तीन orthogonal निदेशक से विज़ुअलाइज़ेशनमाहौल मात्रात्मक और सांख्यिकीय विश्लेषण में उपयोग के लिए endosomes या इसी तरह की संरचनाओं का अस्तित्व, आकार, और लेबलिंग विशेषताओं का आकलन करने के लिए एक मानक और दिनचर्या कसौटी प्रदान करता है.

कई प्रयोगशालाओं में पाया प्रकार के एक पारंपरिक वीडियो माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जा सकता है कि में वर्णित पद्धति व्यावहारिक है. इंस्ट्रूमेंटेशन बहुमुखी बजाय विशेष, और अपेक्षाकृत सस्ती है. एक विशेष माइक्रोस्कोप के लिए विशेष सॉफ्टवेयर का यहां इस्तेमाल किया गया था, वहीं छवि अधिग्रहण और डाटा प्रोसेसिंग दोनों के लिए खुला स्रोत सॉफ्टवेयर इसी तरह के परिणाम 13 उत्पादन कर सकते हैं. (Deconvolution सहित) तकनीक के रूप में लंबे समय तक प्रकाश जोखिम इस्तेमाल किया रहने तैयारी द्वारा सहन किया है, के रूप में इसी तरह के फायदे के साथ एकल और multiphoton confocal इमेजिंग के लिए लागू कर रहे हैं. भविष्य में, डिजाइन सुधार आगे उपयोगिता 4D रहते इमेजिंग में वृद्धि होगी. ये ध्यान केंद्रित की गति और उत्तेजना / उत्सर्जन फिल्टर चा बढ़ाता है कि मुख्य रूप से, हार्डवेयर शामिलnging, और भी अधिक संवेदनशील वीडियो कैमरों की उपलब्धता.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य ग्रांट एन एस-024572 (RSW के लिए) के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
SGC5 Biotium, Hayward, CA 70057 Final conc: 10 mM
FM1-43FX Invitrogen, Carlsbad, CA F35335 Final conc: 7 mM
LysoTracker Red Invitrogen, Carlsbad, CA L7528 Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 86 mM
KCl 60 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
Sucrose 0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm  Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA 175W Xenon arc lamp www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA www.sutter.com
Sensicam CCD camera Cooke Instruments, Tonawanda, NY www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera Photometrics, Tucson, AZ www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0 Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2 Bitplane, South Windsor, CT Drift correction; 3D and 4D data presentation www.bitplane.com
AfterEffects CS6 Adobe, San Jose, CA Drift correction www.adobe.com
ImageJ 1.46 National Institutes of Health, Bethesda, MD Multiple plugins available; Stereo pair construction http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY Stereo pair construction www.zeiss.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122, (6), 753-767 (2009).
  2. Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
  3. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
  4. Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
  5. Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
  6. Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
  8. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
  9. Cromey, D. W. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).
  10. Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20, (21), 7986-7993 (2000).
  11. Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19, (12), 4855-4866 (1999).
  12. Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. 1495-1505 (2010).
  13. Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics