4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

四次元(4D)画像化は、脊椎動物の神経末端を生体内エンドソームの2種類のうちの挙動および相互作用を研究するために利用される。これらの小さな構造の移動は、例えばエンドソーム融合およびエキソサイトーシスなどのイベントの確認を可能にする、三次元を特徴としている。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stewart, R. S., Kiss, I. M., Wilkinson, R. S. Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51477, doi:10.3791/51477 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

四次元(4D)光イメージングは​​、ガーターヘビの薄い腹横筋筋の運動神経終末内の小さな構造の挙動を研究するために使用されている。生データは、3Dのz-スタックの経時的配列を含む。各スタックは400-1,500 nmの区切られた焦点面でのエピ蛍光光学系を用いて取得4月20日の画像が含まれています。このようなフォーカスの調整などの画像スタックの取得の手順は、励起波長の切り替え、及びデジタルカメラの動作は、画像レートを最大化し、光露光から組織の損傷を最小限に抑えるために可能な限り自動化されている。取得後、画像スタックのセットは、空間分解能を向上させるためにデコンボリューションされ、所望の3Dフォーマットに変換され、4D「映画」ことが求められる実験データに応じて、コンピュータベースの様々な分析に適しているの作成に使用される。 1つのアプリケーションが、神経末端-macroendosomes(MES)で見つかったエンドソームの二つのクラスの動的挙動の研究であるおよび(有害事象)、サイズが(両方のタイプの200〜800 nm)の酸性エンドソームは、回折限界またはその付近である。各時点での3次元情報へのアクセスは、従来のタイムラプス撮影に比べていくつかの利点を提供する。特に、構造物の動きの大きさと速度は、鮮明な焦点を失うことなく経時的に定量することができる。 4Dイメージングからのデータの例は、MEは、それらがエキソサイトーシスではなく、単に垂直方向に離れて単焦点面から移動していることを示唆し、原形質膜に接近し、消滅することが明らかになった。また、各3正射影で見たように、2つの色素を含有する構造体の間の重複の視覚化によって、有害事象のMEとの推定上の融合で明らかにした。

Introduction

生体組織のタイムラプスイメージングは​​、単一の時点で撮像され、固定または住んで調剤に理解されることができない力学構造と機能の関係を視覚的にアクセスを提供します。しかし、多くの場合、一時的な情報へのアクセスのためのトレードオフは、光学解像度の低下である。高開口数油浸対物レンズは、代替として水浸漬またはドライの目標を残しているため、焦点の彼らの狭い範囲の生体組織に非実用的である。さらに、共焦点光学系によってもたらさ高解像度照明比較的高レベルの1,2必要から、光毒性に起因するいくつかの生体調製物中で利用することができない。最後に、いくつかのリアルタイムまたは時間経過の光学技術が利用可能であるが強化された解像度を提供することが、その適用は、関心のある構造は対物レンズ1の数百ナノメートル内に配置することができる製剤に限定されている。方法について説明比較的低コストの機器を利用した汎用性のある、さらにより一般的に使用されるタイムラプス技術と比較して改良された解像度を提供しています。なお、各施設ならびに撮像施設での使用を意図している。

この方法は高感度デジタルカメラで、迅速に、わずかに異なる焦点面(Zスタック)で画像のセットを取得するために設計されたハードウェアと組み合わせて、従来の落射蛍光顕微鏡を利用しています。それぞれのzスタックはデジタル分解能を高めるためにデコンボリューションされる。 3Dタイムラプス(4D)画像の特徴の一つは、細胞小器官または他の構造の移動を正確に追跡している。適切に設定すると、画像化された構造は、フォーカスの外に出ないし、すべての3方向の動きを観察し、定量化することができる。染色された構造は、単に狭い焦点面の上または下に漂流して、1つ以上の時間経過フレームにわたって消滅するためにこのように、それは不可能です。この方法はまた、相互作用し、可能FUを評価するための高感度なツールとして機能します小さな構造のシオン。回折限界(数百nm)の近くで、従来の落射蛍光または構造の共焦点画像がマージされた画像は、それぞれのラベル3の重なりを見せても融合を確認していません。融合は示唆し、それは、オブジェクトが回折限界未満である距離だけ水平方向または垂直方向に分離されている可能性が残る。三又は四次元イメージングは​​、対照的に、3つの直交方向のそれぞれにおいてオブジェクトの表示が可能になる。すべての3つのビューにおける融合の外観は、確実性のレベルを増加させる。そして、いくつかの生きた標本で、指向性または両方のラベルは、時間に一緒に移動すると推定される融合されたオブジェクトのブラウン運動は、さらなる証拠を提供しています。もちろん、とき回折限界の背景から、こだわりの構造における確実性のレベル、またはそれらが2色素(融合)が含まれていることを示すの近くに、絶対的なものではない。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)のような該当する場合、専門的な技術が、4は 、より適切である。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1。超生体色素で準備を染色

  1. ガーターヘビ解剖プロトコルの場合スチュワートらを参照してください。5とテン 6爬虫類組織は、より長い時間、低温度に保た少ない細菌汚染、(下記参照)で、生理学的のまま。哺乳動物組織は、通常、室温以上に維持される。
  2. リソソーム生体色素染色のために、冷たい爬虫類リンゲル液1:5,000(0.2μM)に色素を溶解する。 15分間4℃でインキュベートする。冷たいリンゲルで数回洗浄します。なるべく早く画像。
  3. 塩化カリウム刺激を使用して、FM1-43染色のために、高塩化カリウムリンガー1:500(7μM)に色素を希釈する。 30〜60秒、最大4℃でインキュベートする。 〜1分/すすぎ、冷たいリンガーで素早く3回洗浄する。なるべく早く画像。
  4. 高張(ショ糖)の刺激を使用して、FM1-43染色のために、上記のように0.5 Mショ糖リンガー色素を希釈する。 4&#でインキュベートする176; 2〜5分間のためのC。冷たいリンガー上記工程1.3と同様に洗浄する。なるべく早く画像。
  5. FM1-43染色のために電気刺激を介して、テン 6を参照して簡単に説明すると、製剤は、生理食塩水、色素を含有する皿が配置されている。神経を200秒の矩形パルス(〜7 V、30 Hzで、18秒)のあらかじめプログラムされた電車で刺激される。冷たいリンガー上記工程1.3と同様に洗浄する。なるべく早く画像。

2。イメージングのための準備を設定します

  1. 東洋近隣の構造は、顕微鏡対物レンズにできるだけ近くなるように調製。
  2. 倒立顕微鏡を使用する場合は、その底部の薄い丸いカバースリップを含有するチャンバを利用する。一般的に、撮影室が中心で25ミリメートル、直径1位厚ガラスカバースリップで、薄いステンレス製の底部を持っている必要があります。正立顕微鏡を使用する場合は、底部カバーガラスは必要なく、有用であるれていない透過光による画像撮影を可能にするために( 例えば微分干渉コントラスト、DIC)は、試験片の方向を、目的のオブジェクトを検索します。
  3. 可能な限り最高の3D解像度を得るために、適切な目標を選択します。開口間のトレードオフ(NA)、作動距離、倍率、レンズの種類(乾燥、水溶性および油浸)がある。組織培養物のような薄い準備のため、オイルの目標は最高です。正立顕微鏡を使用して、水性浴上にカバースリップをフロートし、カバースリップの上部と客観の間の液浸油を使用しています。
  4. デコンボリューションソフトウェアを使用する場合、ベンダは、特定の目的のための所定の点広がり関数(PSFの)を提供するかもしれない。そのような情報が提供されていない場合、またはサポートされていない目的が選択された場合、蛍光マイクロドットまたは類似の回折限界のオブジェクト7,8を撮影たPSFを決定する。

3。目的のフィールドの深度およびIMAの数を確立タイムラプスフレームあたり希望GES

  1. 彼らはz方向に移動するように関心のある構造の移動や相互作用が消失するか、焦点の外に出ないように、フィールドの全深さを選択します。 Z-フィールドは、わずかに撮像されている細胞または細胞プロセスの垂直寸法を超えている必要があります。脊椎動物のモータ端子の場合は、15から20程度が一般的である。
  2. 焦点の各増分に必要なz軸ステップを計算します。 z軸に沿った分解能は、対物レンズの特性に依存して変化する;それはxy平面の解像度の約4分の1である。共焦点イメージングまたはデコンボリューションソフトウェアのいずれかが使用される場合、z軸の解像度が向上する。 z方向5における意図的なオーバーサンプリングすることにより、最終解像度を向上させるだけでなく、下記の3.3のステップを参照してください。典型的なステップ間隔は40-100Xの目的のため400-1,500 nmの範囲である。光が各z段階の画像との間でオフシャッターべきである。
  3. zスタックあたりの画像数を選択し、すなわち、所望の被写界深度は、分割されたステップ間隔による。典型的なzスタックが完了するまでの時間は1〜10秒です。高速移動体(100ナノメートル/秒)は、各画像面は、わずかに異なる時刻に対応するので、3D画像スタックにぼやけて見えることができる。また、それぞれの追加のイメージは光退色し、可能な光毒性(説明を参照)に貢献しています。どちらの状況が関係する場合は、スタックごとに少ない画像を収集するために、より大きなZ-ステップを選択します。画像補間ソフトウェア(以下のステップ6.3)を使用して、後で補う。

4。タイムラプスフレームレートを選択します。

スムーズな動き、相互作用または融合現象9などの経時変化を解決するだけで十分である割合を実験によって選択します。オーバーサンプリングは、不必要に光への露出を増加させながらサンプリングの下で​​は、モーションアーチファクト(サンプリング誤差)が生じることがあります。単一の長いシーケンスまたは同じ調製、比較的小さな総時間間隔でそれぞれの(からのいくつかの反復配列のいずれかを収集する

5。特定の調製のためのすべてのライブイメージングを完了

爬虫類の製剤は、一般的に冷却し、より長い場合には、約1〜2時間、堅調に推移。

6。、所望の用途に応じてデータを分析

  1. すべての生データファイルを保持します。デジタルストレージは通常は問題ありませんが、処理時間があっても、高速のパーソナルコンピュータまたはワークステーションと有意である。関心のある領域へのこの理由のために、作物のイメージ[ROI]。関心領域全体が全時間経過時にトリミングされたウィンドウ内にあることを保証する。
  2. デコンボリューション画像は、適切なソフトウェアと適切な点広がり関数を用いてスタック。その解像度が向上して確認しているというアーティファクトによって生成されていないデコンボリューションアルゴリズム。 図3は、例示的な画像を示す。
  3. z軸見かけの解像度を拡大する補間アルゴリズムを使用してください。見かけ0.25μmの分離への実際1.5ミクロンの像面分離から6Xの拡大が示唆されている。あるいは、いくつかのオーバーサンプリングの組み合わせ(ステップ3.2)および補間を使用しています。
  4. 所望であればコントラスト、明るさ、ノイズフィルタリング、光退色および他の典型的な画像処理調整を行う。画像操作基準は、ほとんどの科学的研究のために、それは、同じ修正がスタック内の異なる時点で両方、すべての画像に適用することが適切であることを指示する。特定の調整の結果、すべての画像9の中で評価されるべきである。
  5. データのエクスポートのための特定の表示モードを選択します。最も簡単な表示が緑、赤または赤青のアナグリフ( 図3の例)、ステレオペア、または交互のいずれかを使用してステレオビデオですRIGH /左シャッターメガネとTアイフレーム。アナグリフは、単一色に制限されています。 z軸視覚解像度を向上させるために、所望であれば明ら​​かな画像深度を向上させる。
  6. 様々なフィルタリングと画像強調技術を試してみてください。例えば、ラプラシアンフィルタ処理は、バックグラウンドの上の小さな構造のコントラストを向上させることが有用である。周辺の明るさを低減しつつ実行されているウィンドウの中心の画素の輝度が向上する。いくつかのフィルタリング方法を組み合わせてうまく機能しないことに注意してください。
  7. 経時的な製剤の実質的な動きがある場合、ドリフト補正を適用する。このような動きは、薬は、活動電位とシナプス電位を抑制するために添加してもして、筋肉を生きているでは一般的です。ピクセル合わせアルゴリズム( 例えば 。IMARIS、アドビ後遺症、ImageJのためTurboRegプラグイン)は、タイムラプス画像を整列させ、減少させることができるが、通常は完全に、このような運動を排除しない。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

示されたデータは、( 図3に低域と高倍率のビューを参照してください。エンドサイトーシスの色素は(FM1-43)の取り込みは、各繊維末端を埋めるヘイズが作成されます)ヘビ神経筋端末からのものであり、特に、macroendosomes(MES)と酸性エンドソーム(AES)これらの端子5。のMEは、神経活動10中に大エンドサイトーシスによって作成され、活動が6を停止した後に、その数は時間とともに指数関数的に低下している。 4Dライブイメージングの使用は、MEが、それらのいくつかはexocytoseため、その数が減少することを示唆し、原形質膜に向かって移動するとすぐに消えるかどうかを決定することであった。全てのこのようなのMEは、一時点で存在する(そして前と)、完全に次の時点で行って(以降もの)であった。このようにして消失するのに要する時間は、我々のフレーム間隔(30秒だけ短く)およびエキソサイトーシスと一致未満であった。 4Dデータによってサポートされていない別の理論は、MesはゆっくりとVの発芽を経由して放散するということです彼らが消えるまでesicles。小胞の出芽は、6を発生しますが、少なくともいくつかのMEは、中または5出芽後のいずれかにエキソサイトーシスされる。 図1動画S1が 2時間経過フレーム間のMEの消失を示しています。消える運命にMESが(簡単な刺激の後に数分開始)ムービーの時間帯にゆっくりと放散と一致しているであろう、2つ以上のフレーム(N = 16)を介して形状や明るさを変更しませんでした。 ME消失は、従来のタイムラプスで以前に観察されたが、それは構造が単純に焦点面を残していたことが可能であった。また、様々な視点( 動画S1)から見MEは消失は突然であることを確認した。従来のライブイメージング(シングル観点から見て、 例えば 、XY画像平面)ノイズ·アーティファクトは構造が変化しなかったことを確認する研究者の能力を制限する。このようなアーティファクトは、多くの場合、存在している1ビューではなく、他。

電子顕微鏡研究は、モータ端子でのエンドソームは、光10の回折限界に近い、小型であることを示した。したがって、これらのエンドソームの融合は、光レベルでの緊密な空間連合からの絶対的に区別することはできません。のMEは、リソソーム生体染色色素(赤色蛍光)でFM1-43(緑色蛍光)とのAEで標識した。両方の色で蛍光を発した構造物(黄色表示される)は、時折、4D画像記録に認められた。適切なソフトウェアを使用して、視点の多様からこれらの二重ラベルされたので、明らかに融合したエンドソームの景色が近く、見かけの構造内のボクセル内の2のラベルの一致を調べるために作成した。 図2の推定融合したAE-MEは示しています3つの直交方向から見た。一つのビューには、XY平面である。他のビューは、その平面に直交している。この方法を使用することがわかったボクセルこの例のように、オーバーラップ、またはそれらがはっきりつ以上の視野平面内でなかったことのいずれか。 ムービーS2は、同一の推定上の融合したAE-MEは、インタラクティブ仮想現実ディスプレイ(3次元で完全に回転可能)として提示を示している。

デジタルデコンボリューションは、従来の共焦点顕微鏡の両方11から、3Dの解像度だけでなく、4D画像を強化するために便利なツールです。デコンボリューションを用いて対物レンズの限られた空間分解能のために、ある程度、補償数値的な反復プロセスである。この分解能は、対物レンズの点広がり関数、微小点の像によって占められる3Dボリュームとして特徴付けられる。理論的には、デコンボリューションは、目的が完璧だった場合に生じるであろう画像を復元する。 図3は、2つの異なるデータセット、赤-緑のアナグリフのペアとして表示された各3次元ボリュームである。右の画像は、デジタル·デ後の鮮鋭度の典型的な改善を示す画像スタックのコンボリューション。

図1
図1。macroendosome(ME)は、細胞膜との見かけの接触の後に表示されなくなります。ヘビ神経筋標本が電気FM1-43の存在下で刺激された。方法に記載し、単一神経繊維末端のZ深さを例示するために6時間点(60秒間隔)にて「3Dボリューム·ビュー」と表示されるデータは、4Dイメージングを用いて収集した。 MEは、時点5と6の間に消える前に、いくつかのフレームにわたって離れるY軸(赤色の破線)から移動を観察することができる。ちょうど消失する前に、MEは、FM1-43ベシクルによって描写神経繊維末端の原形質膜(に位置するように見える染色または「ヘイズ; ") 図3の凡例を参照してください。 MEは中の再表示されませんでしたそれ以降の時点(データは示されていない。 ムービーS1を参照)。スケールバーは2μmで。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

MOVIE S1:MEの4Dタイムラプス景色消失は 映画を見るにはここをクリックしてください。 図1に表示された同じ生データセットは低倍率での「4Dボリュームビュー」として表示されます。オリジナルのタイムラプスシーケンスは、8の時点、60秒で区切っを含む;再生は4フレーム/秒である。シーケンスを簡単に注意を引くためにY軸(15度/ステップ)約24 3D回転の各ステップの開始時に一時停止してまもなくするME(赤矢印)消える。で、ブートン(血漿膜)の端に近づく消え、返さない、MEが表示されていることに注意してくださいすべてのパースペクティブの表示。低いため、z軸の解像度の解像度をxyと比較して、MEの形状を長くし、視点を見に応じて短くなるように思われる。画像はQuickTimeムービーとしてエクスポート、およびQuickTime Proを使って注釈を付けた。スケールバーは2μm。

図2
図2。推定の融合したエンドソームの直交図。神経筋標本を順次方法に記載したように、0.5Mショ糖刺激を使用したMEにラベルを付けるためにAESとFM1-43(緑)を標識するためにリソソーム生体色素(赤)で染色した。 4D映画の一時点からのデータ三の配向で3Dボリュームビューとして表示されている。トップ(パネル1-3)で(xy平面)上から従来の図である。中間(パネル4-6)でxy平面に垂直な図であり、大きな赤い矢印の(任意の)方向で。一番下にある(パネル7-9)は大きな青い矢印の方向に、上記の両方のビューを相互に垂直である。 ME(緑)は、緑の矢印でマークされている。 2有害事象(赤)赤い矢印でマークされています。 (黄色)の両方の色素を含むエンドソームが黄色のパネル3,6の矢印、および9でマークされています。赤と緑の重複に注意して、すべての3正射影においても同様に完了しました。スケールバーは2μmで。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

MOVIE S2:MESおよび酸性エンドソームAEを含む画像のインタラクティブな回転。 ムービーを見るにはここをクリックしてください。 図2のデータセットが完全に回転可能な3D画像(QuickTimeの仮想レアーリとして設定表示されますTY形式; )どの方向から見て画​​像を回転させるために、マウスを使用しています。推定されるが私を融合した/ AEは、すべての角度から黄色のまま。

図3
図3。デコンボリューションは 、それぞれ2つの低(上)に示した代表的なヘビの神経終末、および高(下)の倍率を3次元空間分解能を向上させ 、FM1-43による刺激の際に染色した。 FM1-43の背景により、個々の50 nmの小胞のラベルを「曇り」は、MEのが閉じ込められている範囲内の端末繊維末端の形状を示す。データは、(深さが緑、赤または赤青メガネを用いて可視化することができます。左目に赤、左上に軸索を音符の上から端末の平面に下降)3Dボリュームビューの赤 - 緑のアナグリフとして表示されます。左パネル:生データ;右のパネル:後のデータデコンボリューション。のMES解像度が大幅に向上し注意してください。上のパネル:電気刺激;端末全体示し(〜30×50ミクロン)( 図1動画S1と同じ生データ、スケールバーは10μm)。下のパネル:塩化カリウム刺激; 4個々の神経繊維末端(〜3×5ミクロン、スケールバー、2μm)を表示するために拡大された。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

4Dイメージングの最も重要な側面は、露光の期間と強度の管理である。光退色は、画像の信号対雑音比を減少させ、フルオロフォアの選択を含む種々の要因に応じて、問題であってもなくてもよい。生体組織(光毒性)に対する非特異的損傷は、光退色に関連して、時には目的のために2,12又は微分干渉コントラスト(DIC)のような適切な明視野光学系を有する形態学の検査により設計された蛍光プローブを用いて同定することができる。

これはよく退色および光毒性に関連するものの大きさを下回る光レベルで生じる生理学的効果を誘導することは可能である。例えば、複数の製剤を使用して初期の実験では、各刺激後の異なる時点で固定されたMEが短い刺激後、経時的に消失する速度が6で測定た。標準的tがあるとしてそれらは観察されるまで、O退色最小限に、製剤は暗所に保存した。同様の実験は、4Dライブイメージングを用いて実施した場合には、さらに多くのMESが実験(〜20〜60分)を通じて残り、消えることはありませんでした。実際に記録することにより、最初と最後の一つのフレームにおける単一の3Dフレームに対する露光量を制限しない以外は同じライブ撮影プロトコルの使用は、固定された製剤のそれにエンドソーム消失の予想される全体的な速度を回復した。

さらにトラブルシューティングを逆単調実験中に、全露光に関連し、消失速度は、部分的にであることが示された。従来の多光子共焦点光学系を経由してリスクを軽減するために失敗した試行した後、問題は最終的に〜3倍以上の高感度カメラ( 表1)を購入することで解決した。可能であればそれは、ユーザのアプリケーションに応じて、同様の比較を行うことをお勧めします。もしいくつかのProcessまたは遷移は、強度や照明の全期間に帰属変更がないことを確認し、時間をかけて文書化されています。光毒性および光退色は、色素固有のものです。例えば、私たちは一つの端末の有意なフェージングを繰り返した後の4DイメージングFM1-43を使用して(30分かけて350個々の光のエクスポージャーを)見なかった。類似の色素を使用して同一の撮像プロトコルは、SGC5( 表1)は 、しかしながら、いくつかのフェージングをもたらし、おそらく、光毒性ならびに(データは示さず)。

(使用している場合、共焦点光学系;図示せず)は、デジタルデコンボリューションが提供する改善を除いて、記載され簡単な方法は「超」の解像度を提供していません。しかしながら、この方法は、サイズが回折限界よりもわずかに大きい又は生体構造、特に移動するものを、表示するときに実用的で直感的な解像度を向上させるという利点を有する。様々な角度からオブジェクトを表示する機能、includi三つの直交平面の各々におけるngのプレゼンテーションは、構造体が実際の雑音レベルより上で、それは、1つまたは複数のフルオロフォアによって標識されているか否かが存在するかどうかの調査者を案内する。例えば、MESおよび有害事象の数およびサイズ​​を定量するために設計された実験では、構造は様々な視点から可視であり、各次元(従って、その三次元体積)の範囲内で、そのための典型的であったことが確認できた構造。構造体の位置は、より良い軸索、神経終末内に、例えば、定義されている。むしろそれの上または下より。視野が単一の2D画像平面または3Dデータの単一の投影のいずれかに限られていた場合には対照的に、推定上の構造がしばしばであることが判明し「ノイズ」同様に、推定上の二重標識された構造は、多くの場合、1つの観察視点(または2)から、全てではないから一致登場二つの構造であることが判明した。 3直交方向から可視化tionsは定量的および統計解析で使用するためのエンドソームまたは類似の構造の存在、サイズ、およびラベル表示特性を評価するための標準的なルーチンの基準を提供します。

記載される方法論は、多くの研究室で見られるタイプの従来のビデオ顕微鏡を使用することができるという点で実用的である。機器は汎用性ではなく、特殊な、かつ比較的安価である。特定の顕微鏡に固有のソフトウェアは、ここで使用したが、画像取得及びデータ処理の両方のためのオープンソースソフトウェアは、同様の結果13を生成することができる。 (デコンボリューションを含む)の技術がある限り露光を使用生活の準備によって許容されるように、同様の利点を備えたシングルおよび多光子共焦点イメージングにも適用可能である。将来的には、設計の改善はさらに、ユーティリティ4Dライブイメージングを強化します。これらは、主に、フォーカスの速度および励起/発光フィルター茶を増強するハードウェアを含むngingであり、さらに高感度ビデオカメラを利用できる。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

Acknowledgments

この作品は、健康グラントNS-024572(RSW)の米国国立研究所によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
SGC5 Biotium, Hayward, CA 70057 Final conc: 10 mM
FM1-43FX Invitrogen, Carlsbad, CA F35335 Final conc: 7 mM
LysoTracker Red Invitrogen, Carlsbad, CA L7528 Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 86 mM
KCl 60 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
Sucrose 0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm  Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA 175W Xenon arc lamp www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA www.sutter.com
Sensicam CCD camera Cooke Instruments, Tonawanda, NY www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera Photometrics, Tucson, AZ www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0 Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2 Bitplane, South Windsor, CT Drift correction; 3D and 4D data presentation www.bitplane.com
AfterEffects CS6 Adobe, San Jose, CA Drift correction www.adobe.com
ImageJ 1.46 National Institutes of Health, Bethesda, MD Multiple plugins available; Stereo pair construction http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY Stereo pair construction www.zeiss.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122, (6), 753-767 (2009).
  2. Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
  3. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
  4. Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
  5. Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
  6. Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
  8. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
  9. Cromey, D. W. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).
  10. Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20, (21), 7986-7993 (2000).
  11. Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19, (12), 4855-4866 (1999).
  12. Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. 1495-1505 (2010).
  13. Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics