Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dört boyutlu (4D) görüntüleme omurgalı sinir terminalleri canlı endozomlar iki tip arasındaki davranış ve etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Bu küçük yapıların hareketi gibi endozom füzyon ve ekzositoz gibi olayların onay izin, üç boyutlu olarak karakterize edilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stewart, R. S., Kiss, I. M., Wilkinson, R. S. Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51477, doi:10.3791/51477 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Jartiyer yılan kas abdominis dört boyutlu (4D) görüntüleme hafif ince transversus motor sinir terminalleri içinde küçük yapıların davranışlarını incelemek için kullanılır olmuştur. Ham veri 3D z yığınlarının time-lapse dizileri içerir. Her yığın 400-1,500 nm ayrılmış odak uçakları epifluorışıma optik ile edinilen 4-20 görüntülerini içerir. Bu tür odak ayarı olarak görüntü yığınlarından edinimi adımlar, uyarma dalga boylarında anahtarlama ve dijital kamera operasyon, görüntü oranını maksimize etmek ve ışık maruz kalma doku hasarı en aza indirmek için mümkün olduğunca otomatik vardır. Kazanılmasından sonra, görüntü yığınlarının bir dizi uzamsal çözünürlüğü artırmak için deconvolved edilir, istenen 3D formatına dönüştürülmüş ve bir 4D "film" olduğunu aranan deneysel verilere bağlı olarak, bilgisayar tabanlı analizler çeşitli için uygundur oluşturmak için kullanılır. Bir uygulama sinir terminalleri-macroendosomes bulunan endozomların iki sınıf (MES) dinamik davranış çalışmadırve (AE)-büyüklükleri (her iki tipi için 200-800 nm) asidik endozomlar difraksiyon sınırı ya da yakınında bulunmaktadır. Her zaman noktasında 3D bilgilere erişim geleneksel time-lapse görüntüleme üzerinde çeşitli avantajlar sağlamaktadır. Özellikle de, boyut ve yapıların hareket hızı keskin bir odak kaybı olmaksızın zaman içinde ölçülebilir. 4D görüntüleme veri örnekleri onlar ekzositozlanmış yerine sadece dikey olarak uzak odak tek bir düzlemde hareket ediyor düşündüren, ME'ler plazma zarı yaklaşım ve yok olduğunu ortaya koymaktadır. Aynı zamanda, her üç ortogonal çıkıntılar görüldüğü gibi, iki boya içeren yapılar arasındaki örtüşme ile görselleştirme ME'ler ve AE'lerin varsayılan füzyon olduğunu ortaya çıkardı.

Introduction

Canlı doku Time-lapse görüntüleme zaman içinde tek bir noktada görüntülü sabit veya yaşayan hazırlıkları takdir edilemez dinamik yapı-işlev ilişkilerinin görsel erişim sağlar. Çoğu zaman, ancak, zamansal bilgilere erişim için takas optik çözünürlükte bir azalmadır. Yüksek sayısal açıklık yağ daldırma hedefleri tek alternatif olarak su daldırma veya kuru hedefleri bırakarak, çünkü odak onların dar aralık doku yaşayan pratik değildir. Ayrıca, konfokal optik tarafından sağlanan artan çözünürlük aydınlatma nispeten yüksek seviyelerde 1,2 gereken ikinci fototoksisite nedeniyle bazı oturma terkiplerde kullanılabilir olamaz. Birkaç gerçek zamanlı ya da time-lapse optik teknikleri sunan gelişmiş çözünürlük mevcut iken son olarak, onların uygulanabilirliği ilgi yapıları hedefi 1 birkaç yüz nanometre içine yerleştirilmiş olabilir hazırlıklarına sınırlıdır. Tarif edilen yöntem,, nispeten düşük maliyetli ekipman kullanan çok yönlü, henüz daha yaygın kullanılan time-lapse teknikleri ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş çözünürlük sunuyor. Bu, her laboratuvar hem de görüntüleme tesislerde kullanım için tasarlanmıştır.

Yöntem, bir hassas dijital kamera ile ve hızlı bir şekilde biraz farklı odak düzlemleri (z-yığınları) de görüntülerin setleri elde etmek için tasarlanmış donanım ile birlikte, geleneksel epifloresans mikroskobu kullanır. Her z-yığın dijital çözünürlüğü artırmak için deconvolved edilir. 3D time-lapse (4D) görüntüleme bir özelliği organellere veya diğer yapıların hareketli hassas takip olduğunu. Düzgün kurduğunuzda, görüntülü yapılar odak dışarı çıkmayın ve her üç yönde hareketi gözlenen ve sayısal olabilir. Lekeli bir yapı sadece dar bir odak düzlemi üzerinde veya altında sürüklenen bir veya daha fazla zaman atlamalı çerçeveleri içinde kaybolur için Böylece imkansızdır. Yöntem, aynı zamanda olası etkileşimleri ve fu değerlendirmek için hassas bir araç olarak hizmet vermektedirKüçük yapılarda sion. Konvansiyonel epifluorışıma veya kırınım sınırı (birkaç yüz nm) yakın yapıların konfokal görüntüleri birleştirilmiş görüntüleri kendi etiketleri 3 çakışmasını göstermek bile füzyon onaylamak değildir. Füzyon önerilen, ancak bu nesnelerin kırınım sınırın altında olan bir mesafe ile yatay veya dikey olarak ayrılır mümkün kalır. Üç ya da dört-boyutlu görüntüleme, aksine, üç ortogonal yönün her birindeki nesnelerin görüntüleme izin verir. Üç görüş füzyon görünümü kesinlik düzeyini arttırır. Ve bazı yaşam hazırlıklar, yönettiği ya da her iki etiket zaman birlikte hareket zaman varsayımsal kaynaşmış nesnelerin Brown hareketi başka kanıtı sağlar. Tabii ki, zaman kırılma sınırına yakın kökenli seçici yapılarda kesinlik veya iki boyalar (füzyon) içerdiğini gösteren düzeyi, mutlak değildir. Eğer böyle bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) uygulanabilir, özel teknikler,4, daha uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Supravital Boyaları ile Hazırlama Leke

  1. Jartiyer yılan diseksiyon protokolü için Stewart et al. 5 ve Teng et al. 6 Sürüngen doku daha uzun süre için fizyolojik kalır ve daha az bakteriyel kirlenme ile, (aşağıya bakınız), düşük sıcaklıklarda saklandığında. Memeli doku genellikle oda sıcaklığında ya da daha yüksek tutulur.
  2. Lızozomal vital boya boyama için, soğuk bir sürüngen Ringers çözeltisi 1:5,000 (0.2 uM) 'de boya çözülür. 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Soğuk Zil sesleri ile birkaç kez yıkayın. Kısa sürede görüntü.
  3. KCl stimulasyonla FM1-43 boyanması için, yüksek KCl Ringers 1:500 (7 uM) 'de boya seyreltin. 30-60 saniye maksimum boyunca 4 ° C'de inkübe edin. ~ 1 dak / durulama, soğuk Zil sesleri hızlı bir şekilde üç kez yıkayın. Kısa sürede görüntü.
  4. Hipertonik (sakaroz) stimülasyon FM1 kullanılarak 43-boyama için, yukarıdaki gibi 0.5 M sukroz Ringers 'de boya seyreltin. 4 & # inkübe176, 2-5 dakika boyunca C. Soğuk Ringers yukarıda aşama 1.3 'de olduğu gibi yıkayın. Kısa sürede görüntü.
  5. FM1-43 boyanması için elektriksel uyarım yoluyla, Teng et al. 6 Kısaca bakınız, preparasyon, fizyolojik tuzlu su solüsyonu ve boya içeren bir yemek verilmiştir. Sinir 200 mikro saniye olduğu dikdörtgen darbeler (~ 7 V, 30 Hz, 18 mikro-saniye) önceden programlanmış tren ile uyarılır. Soğuk Ringers yukarıda aşama 1.3 'de olduğu gibi yıkayın. Kısa sürede görüntü.

2.. Görüntüleme Hazırlık yapılandırma

  1. Ilgi yapıları mikroskop objektif mümkün olduğunca yakın olacak şekilde hazırlık yönlendirin.
  2. Bir ters mikroskop kullanılırsa, bunun taban ince yuvarlak kapak kayma içeren bir bölmeyi kullanmaktadır. Tipik olarak görüntüleme odası merkezde bir 25 mm çaplı 1. kalınlığında cam kapak kayma ile bir ince paslanmaz çelik alt olmalıdır. Dik bir mikroskop kullanılırsa, bir alt lamel gereken ancak yararlı değildiriletilen ışık görüntüleme izin vermek (örneğin diferansiyel girişim kontrast, DIC) numune yönlendirmek ve ilgi nesneleri bulmak için.
  3. Mümkün olan en yüksek 3D çözünürlüğünü elde etmek için uygun bir hedefi seçin. Makasına sayısal diyafram lens (na), çalışma mesafesi, büyütme ve tip arasında bulunmaktadır (kuru, su ve yağ daldırma). Doku kültürleri gibi ince hazırlıkları için, petrol hedefleri en iyisidir. Dik bir mikroskop kullanılarak, sulu banyo üzerinde bir kapak kayma şamandıra ve kapak kayma üst ve hedefi arasında daldırma yağı kullanın.
  4. Dekonvolüsyon yazılım kullanılırsa, satıcı belirli amaçlar için önceden belirlenmiş nokta yayılım fonksiyonu (PSFs) sağlayabilir. Böyle bir bilgi verilmedi, ya da desteklenmeyen bir objektif seçilirse, floresan mikro noktalar veya benzer kırılma sınırlı nesneleri 7,8 görüntüleme ile PSF tespit edilir ise.

3.. İstenilen Alan derinliği ve Ima sayısı KurmakTime-lapse Frame başına İstenilen ges

  1. Alan toplam derinliğini seçin, böylece hareketli veya ilgi yapılar kaybolur ya da z-doğrultusunda hareket olarak odak dışına çıkmayın etkileşim. Z-alan biraz görüntüsü alınan hücre veya hücre işleminin dikey boyut aşmalıdır. Omurgalı, motor terminalleri için, 15-20 mikron tipiktir.
  2. Odak lik her bir fazlalık için gerekli olan z ekseni adım hesaplayın. Z ekseni boyunca ebatları amacın özelliklerine bağlı olarak değişir; xy düzlemi çözünürlük yaklaşık dörtte biri. Konfokal görüntüleme veya dekonvolüsyona tabi tutulması, yazılım ya da kullanılırsa, z ekseni çözünürlüğü artar. Z-yönünde 5 kasıtlı Oversampling tarafından nihai çözümünü geliştirmek, aynı zamanda aşağıya 3.3 adıma bakın. Tipik bir adım aralığı: 40-100X amaçları için 400-1,500 nm aralığındadır. Işık her z-adım görüntü arasındaki kapalı kepenkli edilmelidir.
  3. Z-yığını başına görüntü sayısını seçin, yani alan istenen derinliği bölünmüşadım arayla. Tipik bir z-yığını tamamlamak için zamanı 1-10 sn. Her resim düzlemi biraz farklı bir zaman noktasına karşılık çünkü hızlı hareket eden nesneleri (100 nm / sn) bir 3D görüntü yığını bulanık görünebilir. Ayrıca, her bir ek görüntü ağartmanın ve olası fototoksisite (Tartışma) katkıda bulunur. Her iki durum ilgiliyse, yığının başına daha az görüntüleri toplamak için büyük bir z-adım seçmek. Görüntü interpolasyon yazılımı (aşağıda adım 6.3) kullanılarak daha sonra dengeleyin.

4.. Time-lapse Frame Rate seçin

Sorunsuz böyle bir hareket, etkileşim ya da füzyon olayları 9 gibi zamanla değişiklikleri gidermek için sadece yeterli bir oran Deneyden tarafından seçin. Örnekleme gereksiz ışığa maruz artırırken örnekleme altında hareket eserler (örnekleme hataları) üretebilir. Tek bir uzun dizi veya aynı hazırlanması, nispeten küçük bir toplam zaman aralığı her bir (birkaç tekrar dizileri ya da toplamak

5.. Belirli Hazırlama Tüm Canlı Görüntüleme tamamlayın

Sürüngen preparatları tipik soğutmalı uzun değilse, ~ 1-2 saat için sağlam kalır.

6.. İstenilen Kullanım göre Veri Analiz

  1. Tüm ham veri dosyaları saklayın. Dijital depolama genellikle bir sorun değil iken, işlem süresi daha hızlı kişisel bilgisayar veya iş istasyonu ile önemlidir. Bu nedenle, faiz [ROI] bir bölgeye kırpma görüntüleri. Ilgi tüm bölgenin tüm zamanı sırasında kırpılan pencerenin olduğunu temin ederim.
  2. Deconvolve görüntü uygun yazılım ve doğru nokta dağılım fonksiyonu kullanılarak yığınlar. Bu çözünürlüğü artar onaylayın ve hiçbir dışlayıcı tarafından oluşturuldudekonvolüsyon algoritma. Şekil 3. örnek görüntüleri gösterir.
  3. Z-ekseni belirgin çözünürlük genişletmek için bir enterpolasyon algoritması kullanın. Belirgin bir 0.25 mikron ayırma gerçek bir 1.5 mikron görüntü düzlemi ayrılık bir 6X genişleme önerilmektedir. Alternatif olarak, örneklemedir bazı kombinasyonu (adım 3.2) ve interpolasyon kullanın.
  4. Istenirse kontrast, parlaklık, gürültü filtreleme, photobleaching ve diğer tipik görüntü işleme ayarlamaları gerçekleştirin. Görüntü işleme standartları en bilimsel çalışma için, aynı düzeltmeler bir yığın içinde ve farklı zaman noktalarında hem de tüm görüntülere uygulanacak olması uygun olduğunu dikte. Belirli bir ayarlama sonucu tüm görüntülerin 9 arasında değerlendirilmelidir.
  5. Veri ihracat için özel bir ekran modu seçmek. En basit göstergesi yeşil-kırmızı veya kırmızı-mavi anaglyphs (Şekil 3 örnekleri), stereo çiftleri, ya da alternatif ile stereo video righ / solt göz shutter gözlük çerçeveleri. Anaglyphs tek bir renk ile sınırlıdır. Z-ekseni görsel çözünürlüğünü artırmak için istenirse belirgin görüntü derinliği geliştirin.
  6. Çeşitli filtreleme ve görüntü geliştirme teknikleri deneme. Örneğin, Laplasyen filtreleme arka plan üzerinde küçük yapılar kontrast arttırmak için yararlıdır. Çevresinde parlaklık azalır çalışan bir pencerenin merkezi piksellerin parlaklık geliştirilmiştir. Bazı filtreleme yöntemleri birlikte iyi çalışmaz unutmayın.
  7. Zamanla hazırlanması önemli bir hareket varsa sürüklenme düzeltme uygulayın. Bu tür bir hareket uyuşturucu eylem potansiyelleri, sinaptik potansiyellerin bastırmak için ilave bile, canlı kas yaygındır. Bir piksel kayıt algoritma (örneğin. IMARIS, Adobe AfterEffects, ImageJ için TurboReg plugin) time-lapse görüntüleri hizalar ve azaltabilir, ancak genellikle tamamen böyle bir hareketi ortadan kaldırmak değil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gösterilen veriler (Şekil 3 düşük ve yüksek büyütme manzaralarını görmek; endositik boya (FM1-43) alımının her bouton doldurur bir pus oluşturur) yılan nöromüsküler terminalleri ve özellikle macroendosomes (MES) ve asidik endozomlar (AE) Bu terminallerde 5 içinde. ME'ler sinirsel aktivite 10 sırasında toplu endositoz tarafından oluşturulan ve etkinlik 6 bittikten sonra bunların sayısı zamanla katlanarak azalır edilmektedir. 4D canlı görüntüleme Kullanım bazıları exocytose çünkü sayıları azalır düşündüren, ME'ler plazma zarı doğru hareket olmadığını belirlemek ve hızlı bir şekilde yok oldu. Tüm bu ME'ler bir zaman noktasında mevcut olan (ve daha önce o) alınmakta ve bir sonraki zaman noktasında gitti (ve sonra o) idi. Bu nedenle ortadan kalkması için gerekli olan zaman süresi eden çerçeve aralığının (30 saniye kadar kısa) ve Ekzositoz ile tutarlı daha az oldu. 4D verilerle desteklenmeyen bir alternatif teori, ME'ler yavaş yavaş v tomurcuklanan yoluyla yaymak olduğunuOnlar kaybolur kadar esicles. Vesikül tomurcuklanma 6 oluşur, ancak en azından bazı ME'ler sırasında veya 5 tomurcuklanma sonra ya ekzositozlanmış edilmektedir. Şekil 1 ve Film S1 iki time-lapse kareler arasında bir ME kaybolması göstermektedir. Kaybolmaya yazgılı ME'ler (kısa uyarıldıktan sonra birkaç dakika başlayan) filmin dönemde yavaş dağılımını tutarlı olurdu, iki veya daha fazla kare (N = 16) üzerinde şekil veya parlaklığı değiştirmek vermedi. ME ortadan kalkması geleneksel time-lapse önceden gözlemlenmiş, ancak bu yapıların sadece odak düzlemini bıraktığı mümkün oldu. Ayrıca, bakış açıları (Film S1) çeşitli görüntüleme ME kaybolması ani olduğunu doğruladı. Geleneksel canlı görüntüleme ile (tek bir perspektiften bakarak, örneğin xy görüntü düzlemi) gürültü eserler bir yapısı değişmeden olduğunu onaylamak için araştırmacının yeteneğini sınırlayabilir. Bu tür eserler genellikle mevcutama diğerleri bir görünümde.

Elektron mikroskobu çalışmaları, motor terminallerinde endozomlar ışık 10 kırılma sınırına yakın, boyutları küçük olduğunu gösterdi. Bu endozomların dolayısıyla füzyon kesinlikle ışık seviyesinde yakın mekansal örgütlenme ayırt edilemez. ME'ler bir lizozomal vital boya (kırmızı floresan) ile FM1-43 (yeşil florasan) ve AO ile etiketlenmiş. (Sarı görünen) her iki renk fluoresced yapılar bazen 4D görüntü kayıtları kaydedildi. Uygun yazılımı kullanarak, perspektif çeşitli bu çift etiketli ve bu nedenle görünüşte erimiş endozomların manzarası yakın ve belirgin yapısı içinde voksellerdeki iki etiket tesadüf incelemek amacıyla oluşturulmuştur. Şekil 2 farazi bir sigortalı AE-ME gösterir Üç dikey yönde bakıldığı zaman. Bir görüşe xy düzlemi olduğunu; Diğer incelemeler bu düzleme ve birbirlerine ortogonal olan. Bu yöntemi kullanarak, bulunmuştur ki, vokselleronlar açıkça bir veya daha fazla görüntüleme düzlemde değil mi bu örnekte olduğu gibi, ya da, üst üste ya. Movie S2 AE-ME (3 boyutta tam dönebilen) bir interaktif sanal gerçeklik ekran olarak sunulan kaynaşmış aynı varsayımsal gösterir.

Dijital dekonvolüsyon konvansiyonel ve konfokal mikroskoplar hem 11, 3D çözünürlük yanı sıra 4D görüntüleri geliştirmek için yararlı bir araçtır. Dekonvolüsyon kullanılan hedefin sınırlı uzaysal çözünürlüğü için, bir dereceye kadar, dengeler bir sayısal, tekrarlanan bir süreçtir. Bu karar, bir sonsuz noktasının görüntü tarafından işgal objektif bakış açısından yayılma fonksiyonu-3D hacim olarak karakterize edilir. Teoride, deconvolution objektif mükemmel olsaydı neden olacaktır imajını düzeltir. 3 kırmızı-yeşil anaglyphs bir çift olarak görüntülenen iki farklı veri seti, her bir 3D ses görünümüdür. Sağ görüntüler dijital de sonra netlik tipik ilerleme gösteriyorgörüntü yığını dilimi.

Şekil 1
Şekil 1. Bir macroendosome (ME), plazma zarı ile temas ettikten sonra belirgin kaybolur. Bir yılan sinir-kas hazırlama elektrik FM1-43 varlığında uyarıldı. Veri Yöntemleri açıklanan ve tek Bouton Z-derinliğini göstermek için altı zaman noktalarında (60 sn aralığı) "3D Ses manzaralı" olarak görüntülenir olarak 4D görüntüleme kullanılarak toplanmıştır. Bir ME zaman noktalarında 5 ve 6 arasında kaybolmadan önce birkaç kare üzerinde uzakta Y ekseni (kırmızı kesikli çizgi) hareket görülebilir. Sadece kaybolması önce, ME FM1-43 vesikülde tarafından tarif BOUTON plazma zarı (yer gibi görünüyor boyama ya da "pus;") Şekil 3. efsane bkz. ME yeniden ortaya çıkmadığıDaha sonra zaman noktaları (veriler gösterilmemiştir; Film S1 bakınız). Ölçek çubuğu, 2 mikron. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

FİLM S1:. ME 4D time-lapse bakıldı kaybolması filmi görmek için buraya tıklayın. Şekil 1'de gösterilen aynı ham veri seti düşük büyütmede bir "4D ses görüntüsü" olarak gösterilir. Orijinal time-lapse dizisi 8-time puan, 60 saniye ayırarak her içerir; oynatma / sn 4 kare yer almaktadır. Dizisi kısaca dikkat çekmek için y ekseni (15 derece / adım) yaklaşık 24 3D döndürme adımları her başında duraklatıldı yakında-to-be ME (kırmızı ok) yok. ME görünür olduğunu unutmayın, bouton (plazma zarı) kenar kaybolmasını, yaklaşımları, ve, dönmezTüm inceleyen perspektifler. Çünkü alt z-ekseni çözünürlük xy çözünürlüğü ile karşılaştırıldığında, ME şekli uzatmak ve perspektif görüntüleme bağlı kısaltmak için görünür. Görüntüler bir QuickTime filmi olarak ihraç ve Pro QuickTime kullanarak açıklamalı edildi. Ölçek çubuğu, 2 mikron.

Şekil 2,
Şekil 2. Farazi bir kaynaşmış endozomun Dik manzarası. Bir sinir kas hazırlık sırayla Yöntemleri açıklandığı gibi 0.5 M sükroz uyarımı kullanılarak mes etiketlemek için AES ve FM1-43 (yeşil) etiketlemek için bir lizozomal hayati boya (kırmızı) ile boyandı. 4D film bir zaman noktasında veri üç yönelimleri 3D ses görünümleri olarak görüntülenir. Üst (paneller 1-3) At (xy düzlemi) Yukarıdaki geleneksel görünümüdür. Orta (panel 4-6) de xy düzlemine dikey bir görünüşüdür vebüyük kırmızı ok (rasgele) doğru ilerler. Alt (paneller 7-9) yukarıdaki iki görüşlere karşılıklı dik bir görünüm büyük mavi ok yönünde olduğunu. Bir ME (yeşil) yeşil bir okla işaretlenir; iki AE (kırmızı) kırmızı oklarla işaretlenmiştir. (Sarı) iki boyayı içeren bir endozom paneller 3, 6 sarı bir okla işaretlenir ve 9., Kırmızı ve yeşil üç ortogonal projeksiyonlar eşit tamamlandığında bu örtüşme dikkat edilir. Ölçek çubuğu, 2 mikron. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

FİLM S2:. MES ve asidik endozomları AO'lar içeren görüntünün İnteraktif dönme . filmi görmek için buraya tıklayın Şekil 2'nin veri seti tam dönebilen 3D görüntü (QuickTime Virtual Reali olarak yapılandırılmış gösterilirbiçimi ty; ) herhangi bir yönden görüntülemek için görüntüyü döndürmek için fareyi kullanın. Varsayılan ME erimiş / AE tüm açılardan sarı kalır.

Şekil 3,
Şekil 3.. Dekonvolüsyon 3D uzaysal çözünürlüğü arttırır. İki düşük (üstte) de gösterilen tipik yılan sinir terminallerine ve yüksek (alt) büyütme sırasıyla ve FM1-43 ile uyarılma sırasında boyandı. FM1-43 arka plan "pus" nedeniyle bireysel 50 nm kesecikler etiketlenmesine, ME'ler sınırlı olduğu içinde terminal boutons şeklini gösterir. Veri (; solda kırmızı; sol üst nota akson yukarıdan terminal düzlem içine iner derinliği yeşil-kırmızı veya kırmızı-mavi gözlük ile görüntülendi olabilir) 3D ses görünümleri Kırmızı-Yeşil anaglyphs olarak görüntülenir. Sol paneller: ham veriler; Sağ paneller: veri sonradekonvolüsyon. ME'lerin çözünürlüğünde anlamlı bir gelişme dikkat edin. Üst paneller: Elektrik stimülasyonu; tüm terminal (~ 30 x 50 mikron) (, ölçek çubuğu, 10 mm Şekil 1 ve Movie S1 ile aynı ham veriler gösterilmemiştir). Alt paneller: KCl uyarım; dört ayrı BOUTONS (~ 3 x 5 um; ölçek çubuğu, 2 mikron) göstermek için büyütülmüş. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

4D görüntüleme en kritik yönü, ışığa maruziyet süresi ve yoğunluğu yönetimi. Photobleaching görüntü sinyal-gürültü oranı azalır ve Flüoroforlann seçimi dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlı olarak sorunlu olabilir ya da olmayabilir. Canlı doku (fototoksisite) için spesifik olmayan zarar ışıkla ağartma ile ilgilidir, ve bazen amaç için 2,12 ya da diferansiyel girişim kontrast (DIC) gibi uygun optik aydınlık ile morfolojisinin incelenmesi ile tasarlanmış fluoresan problar kullanılarak belirlenebilir.

Bu, iyi ışıkla ağartma ve fototoksisite ile ilişkili büyüklüğü altında ışık seviyelerinde meydana gelen bir fizyolojik etki yaratmak için, ancak, mümkündür. Örneğin, birden çok erken preparatları kullanılarak yapılan deneylerde, her bir stimülasyon sonrasında, farklı bir zamanda sabittir, ME'ler kısa bir stimülasyon sonrasında zamanla yok edildiği oran da 6 ölçülmüştür. Standart bir uygulama t gibionlar görüntülendi kadar o solmasını en aza hazırlıklar karanlıkta tutuldu. Benzer deneyler 4D canlı görüntüleme kullanılarak yapıldı, birçok daha ME'ler deney (~ 20-60 dk) boyunca kaldı ve yok olmadı. Aslında kayıt ve böylece başında tek bir 3D çerçeve ve sonunda tek bir çerçeveye ışık maruz sınırlayıcı değil dışında aynı canlı görüntüleme protokolü, kullanımı, sabit hazırlıklar buna endozom kaybolma beklenen genel oranı restore.

Ek sorun giderme kaybolma oranının ters, bir parçası oldu ve tekdüze bir deney sırasında toplam ışık maruziyeti ile ilgili olduğunu belirtti. Geleneksel ve multiphoton konfokal optik yoluyla maruziyeti azaltmak için başarısız denemeden sonra, sorun nihayet bir ~ 3x daha duyarlı kamera (Tablo 1) satın alma ile çözüldü. Bu mümkünse benzer karşılaştırmalar, kullanıcının, uygulamaya bağlı olarak yapılmış olması önerilir. Eğer bazı process veya geçiş yoğunluğu veya aydınlatma toplam süresi atfedilebilecek hiçbir değişiklik olmadığını teyit, zamanla belgelenmiştir ediliyor. Fototoksisite ve ışıkla ağartma boya özgüdür. Örneğin, bir terminal anlamlı solma sonra tekrarlanan 4D görüntüleme FM1-43 kullanılarak (30 dakika boyunca 350 bireysel ışık pozlama) gördüm. Benzer bir boya, SGC5 (Tablo 1) ile aynı görüntüleme protokol, ancak bazı solma sonuçlandı ve, muhtemelen, fototoksisite de (veriler gösterilmemiştir).

(Kullanıldığı takdirde ve konfokal optik, gösterilmemiş olan) bir dijital deconvolution tarafından sağlanan iyileştirmeler hariç, tarif edilen basit bir yöntem "üst" çözünürlüğü sağlar. Bununla birlikte, yöntem, boyutu en olduğu veya kırılma limitli biraz daha büyük bir oturma yapısı, özellikle de hareket eden olanlar, görüntülerken pratik ve kolay çözünürlüğü geliştirmek avantajına sahiptir. Çeşitli açılardan includi nesneleri görüntülemek için yeteneği, üç ortogonal düzlemde her ng sunumu, bir yapı, gerçekte gürültü seviyesinden ve bir ya da daha fazla florofor ile işaretlenmiş olup olmadığım için araştırmacı yönlendirir. Örneğin, MES ve AO sayısını ve boyutunu ölçmek için tasarlanan deneylerde, bu yapı, çeşitli açılardan görülebilir olduğunu teyit etmek ve her bir boyut (ve bu nedenle üç boyutlu hacim) aralığında olduğu için tipik olduğu mümkündü yapısı. Bir yapının konumu da daha iyi bir akson, sinir terminalinde, vb içinde, örneğin, tanımlanır. daha çok bunun üstünde ya da altında daha. Görüş alanı bir tek 2D görüntü düzlemine veya 3D veri tek bir projeksiyon ya sınırlı iken aksine, varsayılan yapılar genellikle kanıtladı "gürültü." Benzer şekilde, kabul edilen çift etiketli yapılar genellikle bir perspektif görüntüleme (veya iki) için değil, tüm tesadüf ortaya iki yapı olduğunu kanıtladı. Üç ortogonal Direc dan GörselleştirmeTIONS kantitatif ve istatistiksel analizler kullanım için endozomlar ya da benzeri yapıların varlığı, boyutu ve etiketleme özelliklerinin belirlenmesi için bir standart ve rutin kriterini içerir.

Çok laboratuvarda bulunan tipte geleneksel bir video mikroskop kullanılabilir olmasıyla tanımlanan metodoloji pratiktir. Enstrümantasyon yönlü yerine özel ve nispeten ucuzdur. Belirli bir mikroskop için özel yazılım burada kullanılan iken, görüntü elde etme ve veri işleme hem de açık kaynak yazılım benzer sonuçlar 13 üretebilir. (Deconvolution dahil) teknikleri sürece ışığa maruz kullanılan oturma hazırlanması tarafından tolere olduğu gibi, benzer avantajlar tek ve multiphoton konfokal görüntüleme için de geçerlidir. Gelecekte, tasarım gelişmeler daha yarar 4D canlı görüntüleme artıracaktır. Bunlar, odaklama hızı ve uyarma / emisyon filtre cha artırır öncelikle, donanım,donanımının değiştirilmesi, ve hatta daha hassas video kameralar durumu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Acknowledgments

Bu çalışma Sağlık Hibe NS-024572 (RSW için) ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
SGC5 Biotium, Hayward, CA 70057 Final conc: 10 mM
FM1-43FX Invitrogen, Carlsbad, CA F35335 Final conc: 7 mM
LysoTracker Red Invitrogen, Carlsbad, CA L7528 Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 86 mM
KCl 60 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
Sucrose 0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm  Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA 175W Xenon arc lamp www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA www.sutter.com
Sensicam CCD camera Cooke Instruments, Tonawanda, NY www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera Photometrics, Tucson, AZ www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0 Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2 Bitplane, South Windsor, CT Drift correction; 3D and 4D data presentation www.bitplane.com
AfterEffects CS6 Adobe, San Jose, CA Drift correction www.adobe.com
ImageJ 1.46 National Institutes of Health, Bethesda, MD Multiple plugins available; Stereo pair construction http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY Stereo pair construction www.zeiss.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122, (6), 753-767 (2009).
  2. Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
  3. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
  4. Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
  5. Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
  6. Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
  8. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
  9. Cromey, D. W. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).
  10. Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20, (21), 7986-7993 (2000).
  11. Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19, (12), 4855-4866 (1999).
  12. Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. 1495-1505 (2010).
  13. Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics