Visualisation des Endosome Dynamics dans Vivre terminaisons nerveuses avec quatre dimensions d'imagerie par fluorescence

Neuroscience

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Summary

Quatre dimensions (4D) imagerie est utilisée pour étudier le comportement et les interactions entre les deux types de endosomes dans les terminaisons nerveuses vertébrés vivant. Le mouvement de ces petites structures est caractérisé en trois dimensions, ce qui permet la confirmation des événements tels que la fusion des endosomes et l'exocytose.

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Stewart, R. S., Kiss, I. M., Wilkinson, R. S. Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51477, doi:10.3791/51477 (2014).

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Abstract

Quatre dimensions (4D) Imagerie de la lumière a été utilisé pour étudier le comportement des petites structures au sein terminaisons nerveuses motrices de la transverse de l'abdomen mince muscle de la couleuvre rayée. Les données brutes comprend des séquences de time-lapse de 3D z-piles. Chaque pile contient 4-20 images acquises avec une optique à épifluorescence à plans focaux séparés par 400-1,500 nm. Les étapes de l'acquisition de piles d'images, telles que le réglage de mise au point, la commutation de longueurs d'onde d'excitation, et le fonctionnement de l'appareil photo numérique, sont automatisées autant que possible pour maximiser le taux d'image et de minimiser les dommages aux tissus exposés à la lumière. Après l'acquisition, une série de piles d'images est une déconvolution pour améliorer la résolution spatiale, converties au format 3D désirée, et sert à créer un "film" 4D qui est appropriée pour diverses analyses sur ordinateur, en fonction des données expérimentales recherchées. Une application est l'étude du comportement dynamique de deux classes de endosomes trouvés dans nerveuses bornes-macroendosomes (ME)et endosomes acides (EI)-dont la taille (200-800 nm pour les deux types) sont à ou près de la limite de diffraction. Accès à l'information 3D à chaque point de temps offre plusieurs avantages par rapport à l'imagerie time-lapse classique. En particulier, la taille et la vitesse de déplacement de structures peuvent être quantifiés dans le temps sans perte de netteté. Des exemples de données de l'imagerie 4D montrent que les ME se rapprochent de la membrane plasmique et disparaissent, ce qui suggère qu'ils sont exocytosed plutôt que de déplacer simplement verticalement à une distance à partir d'un seul et même plan de mise au point. Est également révélé fusion putatif de ME et EI, par visualisation de chevauchement entre les deux structures contenant un colorant telles que vues dans chacune des trois projections orthogonales.

Introduction

Imagerie time-lapse de tissu vivant offre un accès visuel à dynamiques des relations structure-fonction qui ne peut être apprécié dans les préparations fixes ou vivant imagées en un seul point dans le temps. Souvent, cependant, l'arbitrage pour l'accès à l'information temporelle est une diminution de la résolution optique. Ouverture numérique des objectifs élevés huile d'immersion ne sont pas pratiques dans les tissus vivants en raison de leur gamme étroite de mise au point, laissant immersion dans l'eau ou les objectifs secs comme les seules alternatives. En outre, la résolution accrue offerte par l'optique confocale ne peut pas être utilisée dans certaines préparations de vie en raison de la phototoxicité des niveaux relativement élevés d'éclairement requis de 1,2. Enfin, alors que plusieurs techniques optiques en temps réel ou en accéléré sont disponibles qui offrent résolution améliorée, leur applicabilité est limitée aux préparations où les structures d'intérêt peuvent être positionnés à quelques centaines de nanomètres de l'objectif 1. La méthode décriterend l'utilisation de l'équipement relativement peu coûteux, est polyvalent, tout en offrant une meilleure résolution par rapport aux techniques time-lapse plus couramment utilisés. Il est destiné à être utilisé dans les laboratoires individuels ainsi que des installations d'imagerie.

Le procédé utilise la microscopie à épifluorescence classique, combiné avec un appareil photo numérique sensible et avec du matériel destiné à acquérir rapidement des ensembles d'images légèrement différentes plans focaux (z-piles). Chaque z-stack est numériquement deconvolved pour augmenter la résolution. Une caractéristique de la 3D time-lapse (4D) imagerie est suivi précis des organites ou d'autres structures en mouvement. Lorsqu'il est correctement mis en place, les structures imagées ne sortent pas de mise au point, et le mouvement dans les trois directions peuvent être observés et quantifiés. Ainsi, il est impossible pour une structure teinté à disparaître sur un ou plusieurs cadres time-lapse seulement par la dérive au-dessus ou en dessous d'un plan focal étroit. La méthode est aussi un outil sensible pour évaluer les interactions et possible fusion de petites structures. Épifluorescence classique ou images confocales de structures proches de la limite de diffraction (quelques centaines de nm) ne confirment pas la fusion même si les images fusionnées montrent chevauchement de leurs étiquettes respectives 3. Fusion est suggéré, mais il reste possible que les objets sont séparés horizontalement et verticalement par une distance qui est inférieure à la limite de diffraction. Trois ou à quatre dimensions imagerie, en revanche, permet la visualisation des objets dans chacune des trois directions orthogonales. L'apparition de la fusion dans les trois vues augmente le niveau de sécurité. Et, dans certaines préparations de vie, la direction ou le mouvement brownien des objets présumément fusionnés fournit une preuve supplémentaire lorsque les deux étiquettes se déplacent ensemble dans le temps. Bien sûr, quand près de la limite de diffraction du niveau de certitude dans les structures les plus exigeants de fond, ou montrant qu'ils contiennent deux colorants (fusion), n'est pas absolue. Le cas échéant, des techniques spécialisées, telles que le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET)4, sont plus appropriées.

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Protocol

1. Colorer la préparation de colorants supravital

  1. Pour le protocole de dissection des couleuvres voir Stewart et al. 5 et Teng et al. 6 tissus reptile reste physiologique pour des durées plus longues, et à la contamination bactérienne moins, lorsqu'il est conservé à basse température (voir ci-dessous). Un tissu de mammifère est généralement maintenu à la température ambiante ou plus élevée.
  2. Pour lysosomale vital coloration de colorant, dissoudre le colorant dans reptiles 1:5000 de solution de Ringer froid (0,2 pm). Incuber à 4 ° C pendant 15 min. Lavez plusieurs fois avec Ringer froid. Image dès que possible.
  3. Pour FM1-43 coloration à l'aide de KCl stimulation, diluer le colorant en haute KCl Ringers 1:500 (7 M). Incuber à 4 ° C pendant 30 à 60 secondes maximum. Laver rapidement trois fois avec Ringer froid, ~ 1 min / rinçage. Image dès que possible.
  4. Pour FM1-43 coloration utilisant hypertonique (saccharose) stimulation, diluer le colorant dans 0,5 M sonneries de saccharose comme ci-dessus. Incuber à 4 & #176; C pendant 2-5 min. Laver comme à l'étape 1.3 ci-dessus avec Ringer froid. Image dès que possible.
  5. Pour FM1-43 coloration par stimulation électrique, voir Teng et al. 6 En bref, la préparation est placé un plat contenant du sérum physiologique et le colorant. Le nerf est stimulé par un train préprogrammée de 200 microsecondes impulsions rectangulaires (~ 7 V, 30 Hz, 18 ps). Laver comme à l'étape 1.3 ci-dessus avec Ringer froid. Image dès que possible.

2. Configurez la préparation pour l'imagerie

  1. Orienter la préparation de telle sorte que les structures d'intérêt sont aussi proches que possible de l'objectif du microscope.
  2. Si un microscope inversé est utilisé, utiliser une chambre dont le fond contient une fine lamelle ronde. En règle générale, la chambre de formation d'image doit avoir un fond en acier inoxydable mince avec un diamètre de 25 mm # 1 en verre d'épaisseur lamelle au centre. Si un microscope droit est utilisée, une lamelle de fond n'est pas nécessaire mais elle est utilepour permettre l'imagerie de la lumière transmise (par exemple de contraste d'interférence différentiel, DIC) pour orienter l'échantillon et de localiser des objets d'intérêt.
  3. Choisissez un objectif approprié pour obtenir la résolution la plus élevée possible 3D. Il ya des compromis entre ouverture numérique (NA), la distance de travail, agrandissement, et le type de lentille (sec, immersion dans l'huile à l'eau et). Pour les préparations minces comme des cultures de tissus, les objectifs de pétrole sont les meilleurs. En utilisant un microscope droit, flotter une lamelle sur le bain aqueux, et utiliser de l'huile d'immersion entre le sommet de la lamelle et l'objectif.
  4. Si le logiciel de déconvolution est utilisé, le vendeur peut fournir des fonctions d'étalement de point prédéterminé (PSF) de certains objectifs. Si cette information n'est pas disponible, ou si un objectif pris en charge est choisie, déterminer la PSF par imagerie micro-pointes fluorescentes ou des objets de diffraction limitée similaires 7,8.

3. Établir la profondeur de champ désirée et le nombre de Images souhaités par Time-lapse cadre

  1. Sélectionnez la profondeur totale du champ de sorte que le déplacement ou l'interaction des structures d'intérêt ne disparaissent pas ou sortir de concentration qui se déplacent dans la direction z. Le champ de z doit légèrement dépasser la dimension verticale de la procédure de cellule ou cellule étant imagée. Pour les bornes du moteur vertébrés, 15-20 um est typique.
  2. Calculer le pas de l'axe z nécessaire pour chaque incrément de mise au point. Résolution le long de l'axe des z varie en fonction des propriétés de l'objectif; il est d'environ un quart de la résolution du plan xy. Si l'imagerie confocale ou un logiciel de déconvolution est utilisé, la résolution de l'axe z est améliorée. Améliorer la résolution finale par suréchantillonnage délibéré dans la direction z 5, mais aussi voir l'étape 3.3 ci-dessous. Un intervalle typique de l'étape est dans la plage de 400-1,500 nm pour les objectifs de 40 100X. La lumière doit être coffré off entre chaque image z-étape.
  3. Sélectionnez le nombre d'images par z-pile, à savoir la profondeur de champ souhaitée diviséepar l'intervalle de l'étape. Temps requis pour remplir un z-stack typique est de 1-10 sec. Objets se déplaçant rapidement (100 nm / s) peuvent apparaître floue dans une pile d'images 3D car chaque plan image correspond à un point de temps légèrement différente. En outre, chaque image supplémentaire contribue à photoblanchiment et de phototoxicité possible (voir Discussion). Si les deux cas concerne, choisir un z-étape plus grande pour recueillir moins d'images par pile. Compenser plus tard en utilisant un logiciel d'interpolation d'image (étape 6.3 ci-dessous).

4. Sélectionnez le Frame Rate Time-lapse

Choisissez par l'expérimentation un taux qui est juste suffisant pour résoudre en douceur les changements avec le temps comme le mouvement, les interactions ou les événements de fusion 9. Sous échantillonnage peut produire des artefacts de mouvement (erreurs d'échantillonnage), tandis que le suréchantillonnage augmente inutilement l'exposition à la lumière. Collecte, soit une longue séquence unique ou plusieurs séquences répétées de la même préparation, chacun avec un relativement faible intervalle de temps totale (

5. Remplissez tous Imaging Live pour une préparation particulière

Préparations reptiles restent généralement robuste pour ~ 1-2 heures, plus si on le refroidit.

6. Analyser les données après utilisation désiré

  1. Conservez tous les fichiers de données brutes. Tandis que le stockage numérique n'est généralement pas un problème, le temps de traitement est important, même avec des ordinateurs ou postes de travail personnels rapides. Pour cette raison, les images des cultures dans une région d'intérêt [ROI]. Assurez-vous que l'ensemble de la région d'intérêt est dans la fenêtre recadrée au cours du temps ensemble.
  2. Deconvolve piles d'images en utilisant la fonction correcte propagation point un logiciel approprié et. Assurez-vous que la résolution est améliorée et qu'aucun artefact a été générée par lealgorithme de déconvolution. Figure 3 montre des exemples d'images.
  3. Utiliser un algorithme d'interpolation d'étendre la résolution apparente de l'axe z. Une expansion 6X à partir d'un plan réel séparation d'image de 1,5 um à une apparente 0,25 um séparation est suggéré. Vous pouvez également utiliser une combinaison de suréchantillonnage (étape 3.2) et l'interpolation.
  4. Effectuer le contraste, la luminosité, le filtrage de bruit, photoblanchiment et autres ajustements typiques de traitement d'image, si désiré. normes de manipulation de l'image dictent que pour la plupart des travaux scientifiques, il convient que les mêmes corrections être appliquées à toutes les images, à la fois dans une pile et à différents moments. La conséquence d'un réglage particulier devrait être évaluée chez toutes les images 9.
  5. Sélectionnez un mode d'affichage particulier pour l'exportation de données. L'affichage est plus simple vidéo stéréo en utilisant soit des anaglyphes rouge-vert ou rouge-bleu (exemples de la figure 3), des paires stéréo, ou en alternance gauche / droit œil cadres avec des lunettes à obturateur. Anaglyphes sont limités à une seule couleur. Améliorer la profondeur apparente de l'image si l'on souhaite améliorer la résolution visuelle de l'axe z.
  6. Expérimenter diverses techniques d'amélioration de filtrage et de l'image. Par exemple, le filtrage de Laplace est utile pour augmenter le contraste des petites structures ci-dessus fond. La luminosité des pixels au centre de la fenêtre courante est améliorée tandis que la luminosité des zones environnantes est réduite. Notez que certaines méthodes de filtrage ne fonctionnent pas bien en combinaison.
  7. Appliquer la correction de dérive si il ya un mouvement important de la préparation au fil du temps. Un tel mouvement est commun dans la vie muscle, même avec des médicaments ajoutés à supprimer des potentiels d'action et potentiels synaptiques. Un algorithme d'enregistrement de pixels (par exemple. D'Imaris, Adobe After Effects, le plugin pour ImageJ TurboReg) aligne les images en accéléré et peut réduire, mais généralement pas éliminer complètement, telle motion.

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Representative Results

Les données présentées sont des terminaux serpent neuromusculaires (voir vues basses et hautes grossissement de la figure 3, le colorant d'endocytose (FM1-43) adoption crée une brume qui remplit chaque bouton) et, en particulier, macroendosomes (ME) et les endosomes acides (EI) à l'intérieur de ces bornes 5. ME sont créés par endocytose vrac au cours de l'activité neuronale 10 et leur nombre diminue de façon exponentielle avec le temps après une activité a cessé 6. L'utilisation de l'imagerie 4D en direct était de déterminer si les ME se déplacent vers la membrane plasmique et disparaître rapidement, ce qui suggère que leur nombre diminue parce que certains d'entre eux exocytose. Tous ces ME étaient présents à un point de temps (et ceux d'avant) et complètement disparu au prochain point de temps (et celles après). Ainsi, le temps nécessaire à la disparition était moins élevé que l'intervalle de trame (aussi courte que 30 secondes) et en accord avec l'exocytose. Une autre théorie, pas étayée par des données 4D, est que les ME se dissipe lentement par bourgeonnement de vesicles jusqu'à ce qu'ils disparaissent. Bourgeonnement des vésicules se produit 6, mais au moins certains ME sont exocytosed pendant ou après le bourgeonnement 5. Figure 1 et Film S1 illustrer la disparition d'un ME entre deux trames time-lapse. ME destinés à disparaître n'ont pas changé de forme ou de luminosité sur deux ou plusieurs cadres (N = 16), ce qui aurait été conforme à la dissipation lente au cours de la période du film (à partir de plusieurs minutes après une brève stimulation). ME disparition a été observé précédemment en time-lapse classique, mais il est possible que les structures ont tout simplement quitté le plan de mise au point. De plus, la visualisation d'une variété de points de vue (Film S1) a confirmé que la disparition ME a été soudaine. Grâce à l'imagerie en direct classique (recherche d'un point de vue unique, par exemple le plan de l'image xy) des artefacts de bruit limitent la capacité de l'enquêteur à confirmer que la structure n'a pas changé. Ces objets sont souvent présentsdans un point de vue mais pas d'autres.

Des études au microscope électronique ont montré que les endosomes dans les bornes du moteur sont de petite taille, à proximité de la limite de diffraction de la lumière 10. Ainsi fusion de ces endosomes ne peut pas être absolument distinguée de l'association spatiale étroite au niveau de la lumière. ME ont été marquées avec FM1-43 (vert fluorescent), et EI avec un colorant vital lysosomale (rouge fluorescent). Ouvrages d'art qui fluoresce dans les deux couleurs (apparaissant en jaune) ont parfois été notées dans 4D images disques. Utilisant un logiciel approprié, vues de ces endosomes doubles marqués et donc apparemment fusionnés d'une variété de perspectives ont été générés afin d'examiner la coïncidence des deux étiquettes en voxels proches et au sein de la structure apparente. Figure 2 montre un condensé AE-ME putatif comme on le voit à partir de trois directions orthogonales. Un point de vue est le plan xy; les autres vues sont orthogonales à ce plan et à l'autre. En utilisant cette méthode, il a été constaté que les voxelssoit se chevauchent, comme dans cet exemple, ou qu'ils n'ont clairement pas dans un ou plusieurs plans de visualisation. S2 film montre la même putatif fusionné AE-ME présenté comme un écran de réalité virtuelle interactive (entièrement rotatif en 3 dimensions).

Déconvolution numérique est un outil utile pour améliorer la résolution de la 3D ainsi que des images 4D, de microscopes conventionnels et confocale 11. La déconvolution est un processus itératif qui compense numérique, dans une certaine mesure, de la résolution spatiale limitée de l'objectif utilisé. Cette résolution est caractérisé comme point de fonction d'étalement-le volume 3D de l'objectif occupée par l'image d'un point infinitésimal. En théorie, déconvolution restaure l'image qui en résulterait si l'objectif était parfait. Figure 3 est une vue de volume 3D de deux ensembles de données différents, chacun affiché comme une paire de anaglyphes rouge-vert. Les images de droite montrent une amélioration typique de netteté après de numériqueconvolution de la pile d'images.

Figure 1
Figure 1. Un macroendosome (ME) disparaît après contact apparent avec la membrane plasmique. Un serpent préparation nerf-muscle a été stimulée électriquement en présence de FM1-43. Les données ont été recueillies à l'aide d'imagerie 4D comme décrit dans Méthodes et sont affichés comme "des vues 3D de volume" à six points dans le temps (60 s d'intervalle) pour illustrer la profondeur Z d'un seul bouton. Une ME peut être observée en s'éloignant de l'axe Y (ligne rouge pointillée) sur plusieurs trames avant de disparaître entre les points de temps 5 et 6. Juste avant la disparition, le ME semble être situé à la membrane plasmique de la bouton (délimitée par FM1-43 vésicule coloration ou «brume»; voir la figure 3 la légende). Le ME ne pas réapparaître dansdes périodes subséquentes (données non présentées; voir Film S1). La barre d'échelle, 2 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

FILM S1:. Vues time-lapse 4D de ME disparition Cliquez ici pour voir le film. Le même ensemble de données brutes affichées dans la figure 1 est représenté comme un «point de vue du volume 4D" à un faible grossissement. La séquence time-lapse originale comprend 8 points de temps, séparées par 60 secondes; la lecture est à 4 images / sec. La séquence est brièvement interrompue au début de chacune des 24 étapes 3D rotation autour de l'axe des y (15 degrés / étape) pour attirer l'attention sur le bientôt-à-être disparaître ME (flèche rouge). Attention, le ME est visible, se rapproche du bord du bouton (la membrane plasmique), disparaît, et ne revient pas, entoutes les perspectives d'affichage. En raison de résolution inférieure de l'axe z par rapport à la résolution xy, la forme de la ME semble allonger et raccourcir en fonction de visualisation perspective. Les images ont été exportés sous forme de film QuickTime, et annotés avec QuickTime Pro. La barre d'échelle, 2 pm.

Figure 2
Figure 2. Vues orthogonales d'un endosome condensé putatif. Préparation nerf du muscle a été séquentiellement colorée avec un colorant vital lysosomale (rouge) pour étiqueter EI et FM1-43 (vert) pour étiqueter les ME en utilisant 0,5 M de stimulation de saccharose comme décrit dans Méthodes. Données d'un point d'un film 4D de temps sont affichés sous forme de vues de volume 3D en trois orientations. Au début (panneaux 1-3) est le point de vue classique de dessus (plan xy). Au moyen des panneaux (4-6) est une vue perpendiculaire au plan xy etdans la (arbitraire) en direction de la grande flèche rouge. Au fond (panneaux 7-9) est une vue perpendiculaires à deux points de vue ci-dessus, dans le sens de la grande flèche bleue. Un ME (vert) est marquée par une flèche verte; deux EI (rouges) sont marqués par des flèches rouges. Un endosome contenant deux colorants (jaune) est marquée par une flèche jaune dans les panneaux 3, 6 et 9. Notez que le chevauchement de rouge et de vert est tout aussi complet dans les trois projections orthogonales. La barre d'échelle, 2 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

FILM S2:. Rotation interactive de l'image contenant ME et endosomes acides EI . Cliquez ici pour voir le film Le jeu de données de la figure 2 est représenté configuré comme une image 3D entièrement rotatif (QuickTime Virtual Realité le format; utiliser la souris pour faire pivoter l'image pour visionner de n'importe quelle direction). Les putatif ME fusionnés / AE reste jaune sous tous les angles.

Figure 3
Figure 3. Déconvolution améliore la résolution spatiale en 3D. Deux types de terminaux serpent nerveuses, montré au bas (haut) et haut (bas) grossissement respectivement et souillé pendant la stimulation par FM1-43. FM1-43 fond "brume", en raison de l'étiquetage des vésicules individuelles 50 nm, montre la forme de boutons terminaux dans lequel les ME sont confinés. Les données sont affichées sous forme de anaglyphes rouge-vert de vues 3D de volume (profondeur peut être visualisé avec des lunettes rouge-vert ou rouge-bleu, le rouge sur l'oeil gauche; la note axone en haut à gauche descend dans le plan de la borne d'en haut). Panneaux de gauche: données brutes; Panneaux de droite: données aprèsdéconvolution. Notez l'amélioration significative dans la résolution de ME. Top panneaux: stimulation électrique; ensemble du terminal montré (~ 30 x 50 um) (mêmes données brutes que dans la figure 1 et Film S1; barre d'échelle, 10 pm). Panneaux de fond: KCl stimulation; agrandie pour montrer quatre boutons individuels (~ 3 x 5 um; barre d'échelle, 2 um). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'aspect le plus critique de l'imagerie 4D est la gestion de la durée et de l'intensité de l'exposition de la lumière. Photoblanchiment d'image diminue le rapport signal-sur-bruit et peut être problématique ou non en fonction de divers facteurs, y compris le choix des fluorophores. Non spécifique des dommages aux tissus vivants (de phototoxicité) est liée au photoblanchiment, et peut parfois être identifiée en utilisant des sondes fluorescentes conçus à cet effet ou 2,12 par examen de la morphologie en fond clair avec des optiques adaptées, telles que le contraste interférentiel différentiel (DIC).

Il est possible, cependant, d'induire un effet physiologique qui se produit à des niveaux de lumière très inférieures à celles de la grandeur associée à photoblanchiment et de phototoxicité. Par exemple, au début des expériences utilisant des préparations multiples, chacun fixé à un autre moment après la stimulation, la vitesse à laquelle les ME ont disparu avec le temps après une brève stimulation a été mesurée à 6. Comme c'est pratique courante to minimiser la décoloration, les préparatifs ont été maintenus dans l'obscurité jusqu'à ce qu'ils ont été consultés. Lorsque des expériences similaires ont été effectuées en utilisant l'imagerie en direct 4D, beaucoup plus de ME sont restés tout au long de l'expérience (~ 20-60 min) et ne disparaissent pas. L'utilisation de la même protocole d'imagerie en temps réel, à l'exception pas réellement d'enregistrement et de ce fait de limiter l'exposition de la lumière à une trame 3D unique au début et à une seule image, à la fin, a rétabli le taux global attendu de disparition endosome à celle de préparations fixées.

En outre dépannage indiqué que le taux de disparition est en partie, à l'inverse et de façon monotone liée à l'exposition totale de lumière pendant une expérience. Après des tentatives infructueuses pour réduire l'exposition via une optique confocale classiques et multiphotoniques, le problème a finalement été résolu par l'achat d'un appareil plus sensible ~ 3x (tableau 1). Il est recommandé que les comparaisons semblables soient prises, si possible, en fonction de la demande de l'utilisateur. Si certains process ou de transition est documenté au fil du temps, de confirmer qu'il n'y a aucune modification attribuable à l'intensité ou la durée totale de l'éclairage. Phototoxicité et photoblanchiment sont spécifiques à colorant. Par exemple, nous n'avons vu aucune décoloration significative après plusieurs imagerie 4D d'une borne (350 individuels des expositions de lumière plus de 30 min) à l'aide FM1-43. Le même protocole d'imagerie en utilisant un colorant similaire, SGC5 (tableau 1), cependant, a conduit à une certaine décoloration et, vraisemblablement, la phototoxicité et (données non présentées).

À l'exception des améliorations apportées par déconvolution numérique (optique et confocale s'il est utilisé; non représentés), la méthode simple décrite fournit pas de résolution "super". Cependant, la méthode a l'avantage d'améliorer la résolution pratique ou intuitive lors de la visualisation des structures de vie, en particulier les mobiles, dont la taille est égale ou légèrement supérieure à la limite de diffraction. La possibilité de visualiser des objets à partir de différents points de vue, includiprésentation ng dans chacun des trois plans orthogonaux, l'investigateur comme guide pour savoir si il existe en fait une structure au-dessus du niveau de bruit et si elle est marquée par un ou plusieurs fluorophores. Par exemple, dans des expériences visant à quantifier le nombre et la taille des ME et EI, il a été possible de confirmer que la structure était visible à partir de divers points de vue et que chaque dimension (et donc son volume en trois dimensions) est dans la gamme typique de cette structure. L'emplacement d'une structure est également mieux définie, par exemple, dans un axone, nerf borne etc. plutôt qu'au-dessus ou au-dessous. En revanche, lorsque le champ de vue a été confiné soit à un seul plan d'image en 2D ou à une seule saillie de données 3D, les structures putatives souvent avérées «bruit». De même, les structures doublement marquées putatifs souvent avérées deux structures qui sont apparus à partir d'un point de vue qui coïncide de visualisation (ou deux), mais pas de toutes. Visualisation de trois direction orthogonaletions constitue une norme et le critère de routine pour évaluer les caractéristiques existence, la taille et l'étiquetage des endosomes ou des structures similaires, pour usage à des analyses quantitatives et statistiques.

La méthodologie décrite est pratique en ce que le microscope vidéo classique du type trouvé dans de nombreux laboratoires peut être utilisé. L'instrumentation est polyvalent plutôt que spécialisée, et relativement peu coûteux. Alors que les logiciels spécifiques à un microscope particulier a été utilisé ici, le logiciel open-source à la fois l'acquisition d'image et de traitement de données peut produire des résultats similaires 13. (Y compris les techniques de déconvolution) sont applicables à l'imagerie confocale multiphotonique simple et avec des avantages analogues, aussi longtemps que l'exposition de lumière est tolérée par la préparation de vie utilisé. Dans l'avenir, des améliorations de conception permettront d'améliorer encore l'utilitaire 4D imagerie en temps réel. Il s'agit, principalement, du matériel qui améliore la vitesse de mise au point et le filtre d'excitation / émission de changing, et la disponibilité de caméras vidéo encore plus sensible.

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Disclosures

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les US National Institutes of Health Grant NS-024572 (à RSW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
SGC5 Biotium, Hayward, CA 70057 Final conc: 10 mM
FM1-43FX Invitrogen, Carlsbad, CA F35335 Final conc: 7 mM
LysoTracker Red Invitrogen, Carlsbad, CA L7528 Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 86 mM
KCl 60 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
Sucrose 0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm  Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA 175W Xenon arc lamp www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA www.sutter.com
Sensicam CCD camera Cooke Instruments, Tonawanda, NY www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera Photometrics, Tucson, AZ www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0 Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2 Bitplane, South Windsor, CT Drift correction; 3D and 4D data presentation www.bitplane.com
AfterEffects CS6 Adobe, San Jose, CA Drift correction www.adobe.com
ImageJ 1.46 National Institutes of Health, Bethesda, MD Multiple plugins available; Stereo pair construction http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY Stereo pair construction www.zeiss.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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