Visualisering av endosome Dynamics i Leve nerveterminaler med fire-dimensjonale Fluorescens Imaging

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fire-dimensjonale (4D) avbildning benyttes for å studere oppførselen og interaksjoner mellom to typer av endosomer i levende virveldyr nerveterminaler. Bevegelse av disse små strukturer er preget i tre dimensjoner, tillater bekreftelse av hendelser som endosome fusjon og eksocytose.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stewart, R. S., Kiss, I. M., Wilkinson, R. S. Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51477, doi:10.3791/51477 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fire-dimensjonale (4D) lys imaging har blitt brukt til å studere oppførselen til små strukturer innenfor motoriske nerveterminaler av den tynne transversus abdominis muskel av strømpebånd slange. Rådata omfatter intervall sekvenser av 3D-z-stabler. Hver stabel inneholder 4-20 bilder ervervet med epifluorescence optikk ved fokale fly atskilt med 400-1,500 nm. Steps i oppkjøpet av bildestakker, som for eksempel justering av fokus, bytting av eksitasjonsbølgelengdene, og drift av det digitale kameraet, er automatisert så mye som mulig for å maksimere bildefrekvensen og redusere vevsskade fra lyseksponering. Etter oppkjøpet, er et sett med bildestakker dekonvolvert å forbedre romlig oppløsning, konverteres til ønsket 3D-format, og brukes til å lage en 4D "film" som er egnet for ulike datamaskinbaserte analyser, avhengig av de eksperimentelle data søkt. En søknad er studiet av den dynamiske oppførselen til to klasser av endosomes funnet i nerveterminaler-macroendosomes (MES)og sure endosomer (AES), hvis størrelser (200-800 nm for begge typer) er ved eller nær diffraksjon grensen. Tilgang til 3D-informasjon på hvert tidspunkt gir flere fordeler fremfor konvensjonelle time-lapse avbildning. Særlig kan størrelsen og hastigheten av bevegelsen av strukturer kvantifiseres over tid uten tap av fokus. Eksempler på data fra 4D avbildning viser at mes nærmer plasmamembranen og forsvinne, noe som tyder på at de er exocytosed stedet for bare å bevege seg vertikalt bort fra et enkelt plan av fokus. Også avdekket er antatte fusjon av MES-og ulykkeshendelser, ved visualisering av overlapping mellom de to dye holdige strukturer som vises i hvert tre ortogonale projeksjoner.

Introduction

Time-lapse avbildning av levende vev gir visuell tilgang til dynamiske struktur-funksjon relasjoner som ikke kan bli verdsatt i faste eller levende forberedelser fotografert på ett tidspunkt. Ofte er imidlertid kompromisset for tilgang til tidsmessige reduksjon i optisk oppløsning. Høye numerisk aperture olje-immersion mål er upraktisk i levende vev på grunn av deres smalt spekter av fokus, slik at vann nedsenking eller tørre målsettinger som de eneste alternativene. Videre kan den økte oppløsningen gis av confocal optikk ikke benyttes i noen levende preparater på grunn av fototoksisitet fra de forholdsvis høye nivåer av belysning som kreves 1,2. Til slutt, mens flere real-time eller time-lapse optiske teknikker er tilgjengelige som tilbyr forbedret oppløsning, er deres anvendelighet begrenset til forberedelser der strukturer av interesse kan plasseres innenfor et par hundre nanometer av målet en. Fremgangsmåten som beskrivesgjør bruk av relativt rimelige anlegg, er fleksibel, men likevel gir forbedret oppløsning sammenlignet med vanlig brukte time-lapse teknikker. Den er beregnet for anvendelse i de enkelte laboratorier, så vel som bildebehandlings anlegg.

Metoden benytter konvensjonell epifluorescence mikroskopi, kombinert med en følsom digitalkamera og med maskinvare utviklet for å raskt skaffe seg sett av bilder på litt forskjellige brenn fly (z-stabler). Hver z-stack er digitalt dekonvolvert å øke oppløsningen. Et trekk ved 3D time-lapse (4D) avbildning er presis sporing av bevegelige organeller eller andre strukturer. Når riktig satt opp, trenger fotografert strukturer ikke gå ut av fokus, og bevegelse i alle tre retninger kan observeres og kvantifiseres. Det er derfor umulig for en farget struktur til å forsvinne over ett eller flere tidsintervallrammer bare ved å drive over eller under en smal fokalplan. Metoden fungerer også som et følsomt verktøy for vurdering av interaksjoner og mulig fusjon av små strukturer. Konvensjonell epifluorescence eller confocal bilder av strukturer i nærheten diffraksjon grensen (noen hundre nm) ikke bekrefte fusjon selv om fusjonerte bilder viser overlapping av sine respektive etiketter tre. Fusion er foreslått, men det er fortsatt mulig at objektene er separert horisontalt eller vertikalt ved en avstand som er under diffraksjon grensen. Tre-eller fire-dimensjonale avbildning, i motsetning, gjør det mulig å vise de objektene i hver av tre ortogonale retninger. Utseendet til fusjon i alle tre synspunkter øker nivået av sikkerhet. Og, i noen levende forberedelser, regissert eller Brownske bevegelser putatively smeltet gjenstander gir ytterligere bevis når begge etikettene flytte sammen i tid. Selvfølgelig, når ved diffraksjon grense graden av sikkerhet i kresne strukturer fra bakgrunnen, og som viser at de inneholder to fargestoffer (fusjon), er ikke absolutt. Hvis det er aktuelt, spesialiserte teknikker, for eksempel fluorescens resonans energioverføring (FRET)4, er mer hensiktsmessig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Stain Forberedelse med Supravital Fargestoffer

  1. For strømpe slange disseksjon protokoll se Stewart et al. Fem og Teng et al. 6. krypdyr vev forblir fysiologisk for lengre tid, og med mindre bakteriell forurensning, da holdt ved lav temperatur (se nedenfor). Pattedyrvev blir vanligvis opprettholdt ved romtemperatur eller høyere.
  2. For lysosomal vital fargestoff flekker, løse opp fargestoffet i kalde krypdyr Ringer oppløsning 1:5,000 (0,2 mm). Inkuber ved 4 ° C i 15 min. Vask flere ganger med kald Ringers. Bilde så snart som mulig.
  3. For FM1-43 flekker ved hjelp av KCl stimulering, fortynne fargestoff i high-KCl Ringers 1:500 (7 mm). Inkuber ved 4 ° C i 30-60 sek maksimum. Vask raskt tre ganger med kald Ringers, ~ 1 min / skylling. Bilde så snart som mulig.
  4. For FM1-43 flekker ved hjelp av hyperton (sukrose) stimulering, fortynne fargestoff i 0,5 M sukrose Ringers som ovenfor. Inkuber ved 4 & #176, C for 2-5 min. Vask som i trinn 1.3 ovenfor med kald Ringers. Bilde så snart som mulig.
  5. For FM1-43 farging via elektrisk stimulering, se Teng et al. 6. I korthet blir fremstillingen plasseres en skål inneholdende fysiologisk saltløsning, og fargestoffet. Nerven stimuleres med et forhåndsprogrammert tog av 200 usekunder rektangulære pulser (~ 7 V, 30 Hz, 18 usekunder). Vask som i trinn 1.3 ovenfor med kald Ringers. Bilde så snart som mulig.

2. Konfigurer Forberedelse for Imaging

  1. Orienter preparatet slik at strukturer av interesse er så nær som mulig til mikroskopobjektiv.
  2. Hvis et invertert mikroskop anvendes, benytte et kammer hvis bunn inneholder en tynn runde dekkglass. Vanligvis bør det bildekammeret har en tynn rustfri bunnen med en 25 mm diameter 1 tykkelse glass dekkglass på midten. Dersom en oppreist mikroskop brukes, blir en bunndekk ikke nødvendig, men er nyttigå tillate bildebehandling med overført lys (f.eks differensial interferens kontrast, DIC) for å orientere prøven og finne gjenstander av interesse.
  3. Velge et passende mål å oppnå høyest mulig 3D oppløsning. Det er avveininger mellom numerisk apertur (NA), arbeidsavstand, forstørrelse og type linse (tørr, vann-og olje-immersion). For tynne preparater som vevskulturer, olje mål er best. Ved hjelp av en opprettstående mikroskop, flyte en dekkglass på det vandige bad, og bruke immersjonsolje mellom toppen av dekkglass og målet.
  4. Hvis deconvolution programvaren brukes, kan det hende at leverandøren gi forhåndsbestemte punkt spredt funksjoner (PSFs) for visse mål. Hvis ingen slik informasjon er gitt, eller dersom en uegnet mål er valgt, bestemme PSF av tenkelig fluorescerende microdots eller lignende diffraksjon begrenset gjenstander 7,8.

Tre. Etablere Ønsket av dybdeskarphet og Antall Imatot. Ønsket per Time-lapse Frame

  1. Velg den totale dybde av feltet, slik at glidende eller i samspill strukturer av interesse ikke forsvinner eller gå ut av fokus som de beveger seg i z-retningen. Den z-feltet skal svakt overskrider den loddrette dimensjon av cellen eller celleprosess som avbildes. For virveldyr motorklemmene, er 15-20 mikrometer typisk.
  2. Beregn z-aksen trinn nødvendig for hvert inkrement av fokus. Oppløsning langs z-aksen, varierer avhengig av egenskapene til målet; det er omtrent en fjerdedel av xy-planet oppløsning. Hvis enten konfokalmikroskoper bildebehandling eller deconvolution programvare brukes, er z-aksen oppløsning forbedret. Forbedre endelig vedtak av bevisst oversampling i z-retningen 5, men se også trinn 3.3 nedenfor. En typisk trinn-intervall ligger i størrelsesorden fra 400-1,500 nm for 40-100X mål. Lett bør forskales off mellom hver z-trinns bilde.
  3. Velg antall bilder per z-stack, nemlig ønsket dybdeskarphet deltved trinn-intervall. Tid for å fullføre en typisk z-stack er 1-10 sek. Raske objekter (100 nm / sek) kan vises uskarpt i et 3D-bilde stabel fordi hvert bildeplan tilsvarer en litt annen tidspunkt. Dessuten bidrar hvert bilde til fotobleking og mulig fototoksisitet (se diskusjon). Hvis en situasjon gjelder, velge en større z-skritt å samle inn færre bilder per stabel. Kompensere senere ved hjelp av image interpole programvare (trinn 6.3 nedenfor).

4. Velg Time-lapse Frame Rate

Velg etter eksperimentering en hastighet som er akkurat tilstrekkelig til jevnt løse endres med tiden som bevegelse, interaksjoner eller fusion hendelser ni. Under prøvetaking kan produsere bevegelsesartefakter (sampling feil), mens oversampling unødvendig øker eksponering for lys. Samle enten en enkelt lang sekvens eller flere repeterte sekvenser fra det samme preparat, hver med en relativt liten total tidsintervall (

5. Fullfør Alle Direkte Imaging for en spesiell forberedelse

Reptilian preparater vanligvis forbli robust for ~ 1-2 timer, lenger hvis avkjølt.

6. Analysere data Ifølge Ønsket Bruk

  1. Behold alle rådatafiler. Mens digital lagring er vanligvis ikke et problem, er behandlingstiden betydelig selv med raske personlige datamaskiner eller arbeidsstasjoner. Av denne grunn, beskjære bilder til en region av interesse [ROI]. Sikre at hele regionen av interesse er i det beskårede vinduet under hele tiden kurset.
  2. Deconvolve image stabler ved hjelp av egnet programvare og riktig punktspredefunksjon. Kontroller at oppløsningen er bedre, og at ingen gjenstand har blitt generert avdeconvolution algoritme. Figur 3 viser eksempel bilder.
  3. Bruk en interpole algoritme for å utvide z-aksen tilsynelatende oppløsning. En 6X ekspansjon fra en faktisk 1,5 mikrometer bildeplan separasjon til en tilsynelatende 0,25 mikrometer separasjon er foreslått. Alternativt kan du bruke en kombinasjon av oversampling (trinn 3,2) og interpolering.
  4. Utfør kontrast, lysstyrke, støyfiltrering, fotobleking og andre typiske bildebehandling justeringer hvis det er ønskelig. Image Manipulation standarder tilsier at for de fleste vitenskapelig arbeid, er det hensiktsmessig at de samme korreksjoner brukes på alle bildene, både innenfor en stabel og ved ulike tidspunkt. Konsekvensen av en bestemt justering bør vurderes blant alle bildene ni.
  5. Velg en bestemt visningsmodusen for eksport av data. Den enkleste skjermen er stereo video ved hjelp av enten rød-grønn eller rød-blå anaglyphs (eksempler i figur 3), stereo par, eller vekslende venstre / høt øye rammer med lukkerbriller. Anaglyphs er begrenset til én farge. Forbedre tydelig bildedybde hvis ønskelig å bedre z-aksen visuell oppløsning.
  6. Eksperimentere med ulike filtrering og bildeforbedringsteknikker. For eksempel er Laplacian filtrering nyttig å øke kontrasten av små strukturer over bakgrunnen. Lysstyrken Pikslene i midten av en løpende vindu forsterkes mens lysstyrke av omkringliggende områdene er redusert. Merk at noen filtrering metoder ikke fungerer godt i kombinasjon.
  7. Påfør drift korreksjon hvis det ikke er vesentlig bevegelse av blandingen over tid. Slike bevegelser er vanlig i levende muskler, selv med legemidler legges til undertrykke aksjonspotensialer og synaptiske potensialer. En piksel registrering algoritme (f.eks. IMARIS, Adobe ettervirkninger, TurboReg plugin for ImageJ) justerer tids-lapse bilder og kan redusere, men vanligvis ikke helt eliminere, slik bevegelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dataene som vises er fra slange nevromuskulære terminaler (se lave og høye utsikt forstørrelses i figur 3; endocytic fargestoff (FM1-43) opptak skaper en dis som fyller hver bouton) og, i særdeleshet, macroendosomes (MES) og sure endosomes (AES) innenfor disse terminalene fem. MES er skapt av bulk endocytose under nevral aktivitet 10 og antallet avtar eksponentielt med tiden etter at aktiviteten har opphørt seks. Bruk av 4D direkte avbildning var å finne ut om Mes bevege seg mot plasmamembranen og raskt forsvinne, noe som tyder på at antallet reduseres fordi noen av dem exocytose. Alle slike mes var til stede på ett tidspunkt (og de som før), og helt borte ved neste tidspunkt (og de etter). Således den tid som kreves for forsvinning var mindre enn vår rammeintervall (så kort som 30 sekunder), og i samsvar med exocytose. En alternativ teori, som ikke støttes av 4D-data, er at MES sakte spre via spirende av vesicles før de forsvinner. Vesikkel spirende oppstår seks, men i det minste noen MES er exocytosed enten under eller etter spirende fem. Figur 1 og Movie S1 illustrere forsvinningen av en ME mellom to time-lapse rammer. Mes bestemt til å forsvinne ikke endre form eller lysstyrke over to eller flere rammer (N = 16), som ville ha vært i samsvar med treg ødsling løpet av tidsperioden av filmen (begynner flere minutter etter kort stimulering). ME forsvinning ble observert tidligere i konvensjonelle time-lapse, men det var mulig at konstruksjonene hadde bare igjen planet av fokus. Videre viser fra en rekke perspektiver (Movie S1) bekreftet at ME forsvinningen var plutselig. Med konvensjonell direkte avbildning (ser fra et enkelt perspektiv, f.eks xy bildeplanet) støy gjenstander begrense etterforsker evne til å bekrefte at en struktur var uendret. Slike gjenstander er ofte til stedei én visning, men ikke andre.

Elektronmikroskopi-studier viste at endosomes i motorklemmer er små i størrelse, nær diffraksjon grensen av lys 10. Derfor sammensmelting av disse endosomes kan ikke være helt skilles fra nær romlig forening ved lysnivå. Mes ble merket med FM1-43 (grønn-fluoriserende), og AES med en lysosomal vital fargestoff (rød-fluoriserende). Strukturer som fluoresced i begge farger (vises gult) ble tidvis bemerket i 4D bilde poster. Ved hjelp av passende programvare, ble syn på disse dobbeltmerket og derfor tilsynelatende smeltet endosomer fra en rekke perspektiv generert for å undersøke sammentreff av de to etiketter i voksler i nærheten av og i løpet av den tilsynelatende struktur. Figur 2 viser en antatt smeltet AE-ME sett fra tre ortogonale retninger. Et syn er xy planet; de andre synspunkter er vinkelrett på dette plan og til hverandre. Ved hjelp av denne metoden ble det funnet at voxelenten overlappet, som i dette eksempel, eller at de åpenbart ikke på en eller flere betraktningsplan. film S2 viser samme putative smeltet AE-ME presentert som en interaktiv virtuell virkelighet display (fullt dreibar i tre dimensjoner).

Digital deconvolution er et nyttig verktøy for å øke oppløsningen på 3D samt 4D-bilder, fra både konvensjonelle og confocal mikroskoper 11. Dekonvolusjon er en numerisk, iterativ prosess som kompenserer, til en viss grad, for begrenset romlig oppløsning av formålet anvendes. Denne oppløsningen er karakterisert som målet er punktspredefunksjon-3D-volumet okkupert av bildet av en forsvinnende punkt. I teorien gjen dekonvolusjon bildet som ville resultere dersom målet var perfekt. Figur 3 er et 3D-volum vis av to forskjellige datasett, hver vist som et par av rød-grønn anaglyphs. De riktige bildene viser typisk forbedring i skarphet etter digital dekonvolusjon av bildestabelen.

Figur 1
Figur 1. Macroendosome A (ME) forsvinner etter tilsynelatende kontakt med plasmamembranen. En slange nerve-muskel-preparat ble elektrisk stimulert i nærvær av FM1-43. Data ble samlet inn ved hjelp av 4D bildebehandling som beskrevet i Metoder og vises som "3D-visninger Volume" på seks tidspunkter (60 sek intervall) for å illustrere Z-dybden av en enkelt bouton. En ME kan observeres beveger seg bort fra Y-aksen (rød stiplet linje) over flere rammer før de forsvinner mellom tidspunkter fem og seks. Like før forsvinningen, vises ME til å bli plassert på bouton plasma membran (avgrenset av FM1-43 vesikkel flekker eller "dis," se Figur 3 legende). Den ME ikke dukke opp igjen isenere tidspunkter (data ikke vist, se film S1). Scale bar, 2 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

MOVIE S1:. 4D intervall utsikt ME forsvinningen Klikk her for å se filmen. Den samme rå datasettet vist i figur 1 er vist som en "4D visning volum" til en lavere forstørrelse. Den opprinnelige time-lapse sekvens består av åtte tidspunkter, bare atskilt av 60 sek; avspilling er på 4 bilder / sek. Sekvensen er kort stanset i begynnelsen av hver av 24 3D rotasjons skritt om y-aksen (15 grader / trinn) for å trekke oppmerksomhet til snart å forsvinne ME (rød pil). Vær oppmerksom på at ME er synlig, nærmer seg kanten av Bouton (plasma membran), forsvinner, og kommer ikke tilbake, ialle visnings perspektiver. På grunn av lavere z-aksen oppløsning i forhold til xy-oppløsning, formen på ME ser ut til å forlenge og forkorte avhengig av visnings perspektiv. Bilder ble eksportert som en QuickTime-film, og kommentert ved hjelp av QuickTime Pro. Scale bar, 2 mikrometer.

Fig. 2
Figur 2. Ortogonale utsikt over en antatt smeltet endosome. En nerve muskel forberedelse ble sekvensielt farget med en lysosomal vital fargestoff (rød) til å merke bivirkninger og FM1-43 (grønn) til å merke mes ved hjelp av 0,5 M sukrose stimulering som beskrevet i Metoder. Data fra ett tidspunkt til et 4D-film vises som 3D volum utsikt i tre retninger. På toppen (paneler 1-3) er den konvensjonelle ovenfra (xy-planet). På midten (paneler 4-6) er en visning vinkelrett på xy-planet ogi (vilkårlig) retning av den store rød pil. Ved bunnen (panelene 7-9) er et riss i innbyrdes vinkelrett på begge syn ovenfor, i retning av den store blå pil. En ME (grønn) er markert med en grønn pil; to ulykkeshendelser (rød) er merket med røde piler. En endosome inneholder både fargestoffer (gul) er markert med en gul pil i paneler 3, 6, og 9. Merk at overlapping av rødt og grønt er like komplett i alle tre ortogonale projeksjoner. Scale bar, 2 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

MOVIE S2:. Interaktiv rotasjon av bilde som inneholder MES og sure endosomes AES . Klikk her for å se filmen The datasett av Figur 2 er vist konfigurert som et fullt roterbar 3D-bilde (QuickTime Virtual Reality format; bruke musen til å rotere bildet for visning fra alle retninger). Den antatte smeltet ME / AE forblir gul fra alle perspektiver.

Figur 3
Figur 3. Deconvolution forbedrer 3D romlig oppløsning. To typiske slange nerveterminaler, vist ved lav (øverst) og høy (nederst) forstørrelse henholdsvis og farget under stimulering med FM1-43. FM1-43 bakgrunn "dis", på grunn av merking av enkelt 50 nm vesikler, viser formen på terminal boutons innen hvilke MES er begrenset. Data vises som rød-grønne anaglyphs av 3D-visninger volum (dybde kan visualiseres med rød-grønn eller rød-blå briller, rødt på venstre øye; notat axon øverst til venstre går ned i flyet av terminalen ovenfra). Venstre panel: raw data; Høyre paneler: data etterdeconvolution. Legg merke til betydelig forbedring i oppløsning på mes. Topp paneler: Elektrisk stimulering; Hele terminal vist (~ 30 x 50 mm) (samme rådata som i figur 1 og film S1; skala bar, 10 um). Bunnplater: KCl stimulering; forstørret for å vise fire individuelle boutons (~ 3 x 5 mikrometer, skala bar, 2 mikrometer). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det mest kritiske aspektet av 4D bildebehandling er forvaltning av varigheten og intensiteten av lys eksponering. Fotobleking avtar bilde signal-til-støy-forhold, og kan være problematisk eller ikke, avhengig av ulike faktorer, inkludert valg av fluoroforer. Ikke-spesifikk skade på levende vev (fototoksisitet) er knyttet til fotobleking, og kan noen ganger bli identifisert ved hjelp av fluorescerende prober konstruert for formålet 2,12 eller ved undersøkelse av morfologi med egnede lysfelt optikk, slik som kontrastdifferensialinterferens (DIC).

Det er imidlertid mulig å fremkalle en fysiologisk effekt som oppstår ved lysnivåer godt under omfanget av de som er forbundet med fotobleking og fototoksisitet. For eksempel, i begynnelsen av forsøkene ved hjelp av flere preparater, hver festet på et annet tidspunkt etter stimulering, ble hastigheten som mes forsvant med tiden etter en kort stimulering målt 6.. Som er vanlig praksis to redusere falming, ble forberedelsene holdt i mørket før de ble vist. Når lignende eksperimenter ble utført ved hjelp av 4D direkte avbildning, forble mange flere mes gjennom hele forsøket (~ 20-60 min) og forsvant ikke. Ved å bruke den samme direkte avbildning protokoll, bortsett faktisk ikke opptaket og derved lyseksponering til en enkelt 3D ramme ved begynnelsen og en enkelt ramme ved enden begrensende, gjenopprettet den forventede totale frekvensen av endosome forsvinningen til det av faste preparater.

Ytterligere feilsøking indikerte at frekvensen av forsvinningen var delvis omvendt og monotont relatert til total lyseksponering under et eksperiment. Etter mislykkede forsøk på å redusere eksponering via konvensjonelle og multiphoton confocal optikk, ble problemet endelig løst ved kjøp av en ~ 3x mer følsomt kamera (Tabell 1). Det anbefales at tilsvarende sammenligninger foretas dersom det er mulig, avhengig av brukerens anvendelse. Hvis noen process eller overgang blir dokumentert over tid, bekrefter at det ikke er noen endring skyldes intensitet eller total varighet av belysning. Fototoksisitet og fotobleking er dye-spesifikke. For eksempel, så vi ingen signifikant falming etter gjentatte 4D avbildning av en terminal (350 individuelle lys eksponeringer over 30 min) med FM1-43. Den samme avbildningsprotokoll ved bruk av en tilsvarende fargestoff, SGC5 (tabell 1), imidlertid resulterte i noen fading og antagelig fototoksisitet samt (data ikke vist).

Med unntak av forbedringene som leveres av digital dekonvolusjon (og confocal optikk hvis brukt, ikke vist), den enkle metoden som er beskrevet gir ingen "super"-oppløsning. Imidlertid har fremgangsmåten den fordel at den forbedrer praktisk eller intuitive oppløsning ved visning av levende strukturer, særlig bevegelige de, hvis størrelse er lik eller litt større enn diffraksjon grensen. Muligheten til å se gjenstander fra ulike perspektiver, including presentasjon i hver av tre ortogonale plan, fører undersøkeren om hvorvidt en struktur faktisk eksisterer over støynivået, og om det er merket med en eller flere fluoroforer. For eksempel i forsøk konstruert for å kvantifisere mengden og størrelsen av MES-og bivirkninger, var det mulig å få bekreftet at strukturen var synlig fra forskjellige perspektiver, og at hver dimensjon (og dermed dens tredimensjonale volum) var innenfor området som er typisk for det struktur. Plasseringen av en struktur er også bedre definert, for eksempel i et axon, nerveterminalen etc. snarere enn over eller under den. I kontrast, når synsfeltet ble begrenset enten til et enkelt 2D-bildeplan eller til en enkelt fremvisning av 3D data, antatte strukturer ofte vist seg å være "støy". Tilsvarende putative dobbeltmerket konstruksjoner ofte vist seg å være to strukturer som vist sammenfallende fra en seer perspektiv (eller to), men ikke fra alle. Visualisering fra tre ortogonale retningsjoner gir en standard og rutine kriterium for vurdering av eksistens, størrelse og merking karakteristikker av endosomes eller lignende strukturer til bruk i kvantitative og statistiske analyser.

Metodene som beskrives er praktisk ved at en konvensjonell video-mikroskop av den type som finnes i mange laboratorier kan brukes. Instrumenteringen er allsidig i stedet for spesialiserte, og relativt billige. Mens programvare spesifikke for en bestemt mikroskop ble brukt her, kan åpen-kildekode-programvare for både bildeopptak og dataprosessering produsere lignende resultater 13. Teknikker (inkludert dekonvolusjon) gjelder for single-og multiphoton confocal bildebehandling med tilsvarende fordeler, så lenge lyseksponering er tolerert av den levende preparat brukt. I fremtiden vil forbedringer ytterligere øke nytten 4D direkte avbildning. Disse inkluderer, først og fremst, maskinvare som forbedrer hastigheten på fokusering og eksitasjon / utslipp filter changing, og tilgjengeligheten av enda mer følsom videokameraer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av det amerikanske National Institutes of Health Grant NS-024 572 (til RSW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
SGC5 Biotium, Hayward, CA 70057 Final conc: 10 mM
FM1-43FX Invitrogen, Carlsbad, CA F35335 Final conc: 7 mM
LysoTracker Red Invitrogen, Carlsbad, CA L7528 Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 86 mM
KCl 60 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
Sucrose 0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm  Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA 175W Xenon arc lamp www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA www.sutter.com
Sensicam CCD camera Cooke Instruments, Tonawanda, NY www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera Photometrics, Tucson, AZ www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0 Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2 Bitplane, South Windsor, CT Drift correction; 3D and 4D data presentation www.bitplane.com
AfterEffects CS6 Adobe, San Jose, CA Drift correction www.adobe.com
ImageJ 1.46 National Institutes of Health, Bethesda, MD Multiple plugins available; Stereo pair construction http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY Stereo pair construction www.zeiss.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122, (6), 753-767 (2009).
  2. Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
  3. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
  4. Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
  5. Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
  6. Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
  8. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
  9. Cromey, D. W. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).
  10. Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20, (21), 7986-7993 (2000).
  11. Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19, (12), 4855-4866 (1999).
  12. Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. 1495-1505 (2010).
  13. Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics