Visualisering av endosome Dynamics i Living nervterminaler med Fyrdimensionell fluorescens avbildning

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fyrdimensionell (4D) avbildning används för att studera beteende och samspel mellan två typer av endosomes i levande ryggradsdjur nervterminaler. Förflyttning av dessa små strukturer kännetecknas av tre dimensioner, som medger bekräftelse av händelser såsom endosome fusion och exocytos.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stewart, R. S., Kiss, I. M., Wilkinson, R. S. Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51477, doi:10.3791/51477 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fyrdimensionell (4D) ljus bildbehandling har använts för att studera beteendet hos små strukturer inom motoriska nervterminaler i den tunna transversus abdominis muskeln i garterorm. Rådata består av tidsförlopp sekvenser av 3D-z-stackar. Varje bunt innehåller 4-20 bilder som förvärvats med epifluorescence optik vid fokalplan åtskilda av 400-1,500 nm. Stegen i förvärvet av bildstaplar, såsom justering av fokus, omkoppling av excitationsvåglängder, och drift av den digitala kameran, är automatiserade så mycket som möjligt för att maximera bildhastighet och minimera vävnadsskador från ljusexponering. Efter förvärvet, har en uppsättning av bildstaplar dekonvolvering att förbättra rumslig upplösning, omvandlas till önskat 3D-format, och används för att skapa en 4D "film" som är lämplig för olika datorbaserade analyser, beroende på de experimentella data som eftersträvas. En tillämpning är studiet av det dynamiska beteendet hos två klasser av endosomes som finns i nervterminaler-macroendosomes (MES)och sura endosomer (AES)-vars storlek (200-800 nm för båda typerna) är vid eller nära diffraktionsgränsen. Tillgång till 3D-information vid varje tidpunkt ger flera fördelar jämfört med konventionell time-lapse avbildning. I synnerhet kan storleken och hastigheten hos rörelsen hos strukturerna kvantifieras över tid utan förlust av skärpa. Exempel på data från 4D avbildning avslöjar att ME närma plasmamembranet och försvinna, vilket tyder på att de är exocytosed snarare än att helt enkelt flytta sig vertikalt bort från ett enda plan i fokus. Dessutom avslöjas är förmodade fusion av MES och biverkningar, genom visualisering av överlappning mellan de två färgämnesinnehållande strukturer som visade i vardera tre ortogonala projektioner.

Introduction

Time-lapse avbildning av levande vävnad ger visuell tillgång till dynamiska struktur-funktions relationer som inte kan uppskattas i fasta eller levande förberedelser avbildas vid en enda tidpunkt. Ofta är dock den avvägning för tillträde till temporal information som en minskning i optisk upplösning. Höga olje-nedsänkning mål numerisk bländare är opraktiska i levande vävnad på grund av deras smalt fokus, lämnar nedsänkning i vatten eller torra mål som de enda alternativen. Dessutom kan den ökade upplösningen ges genom konfokala optiken inte utnyttjas i vissa levande preparat på grund av fototoxicitet från de relativt höga nivåer av belysning som krävs 1,2. Slutligen, medan flera realtid eller time-lapse optiska tekniker finns tillgängliga som erbjuder förbättrad upplösning, är deras användbarhet begränsad till förberedelser där strukturer av intresse kan placeras inom ett par hundra nanometer i mål 1. Den beskrivna metodenanvänder sig av förhållandevis billig utrustning, är mångsidig, men ändå erbjuder förbättrad upplösning jämfört med mer ofta använda tidsförlopp tekniker. Den är avsedd att användas i enskilda laboratorier samt avbildningsfaciliteter.

Metoden utnyttjar konventionell epifluorescensmikroskopi, i kombination med en känslig digitalkamera och med hårdvara som designats för att snabbt erhålla uppsättningar av bilder med något olika fokalplan (z-stackar). Varje z-stack är digitalt dekonvolvering för att öka upplösningen. Ett inslag i 3D tidsförlopp (4D) imaging är exakt spårning av rörliga organeller eller andra strukturer. När rätt inställd behöver avbildade strukturer inte gå ur fokus, och rörelse i alla tre riktningar kan observeras och kvantifieras. Därför är det omöjligt för en färgade struktur att försvinna över en eller flera tidsförlopp ramar enbart genom drifting över eller under en smal fokalplan. Metoden fungerar också som ett känsligt verktyg för att bedöma samspelet och eventuella fusion av små strukturer. Konventionell epifluorescence eller konfokala bilder av strukturer nära diffraktionsgränsen (några hundra nm) inte bekräfta fusion även om sammanslagna bilder visar överlappning av deras respektive etiketter 3. Fusion föreslås, men det är fortfarande möjligt att föremålen är åtskilda horisontellt eller vertikalt med ett avstånd som är mindre än diffraktionsgränsen. Tre eller fyra-dimensionell avbildning, i motsats härtill medger visning av objekt i var och en av tre ortogonala riktningar. Uppträdandet av fusion i alla tre vyer ökar nivån av säkerhet. Och i vissa levande preparat, riktade eller Brownsk rörelse förment smält föremål ger ytterligare bevis när båda etiketterna flyttar ihop i tid. Naturligtvis, när nära diffraktionsgränsen nivån av säkerhet i krävande strukturer från bakgrunden, eller visar att de innehåller två färgämnen (fusion), är inte absolut. I tillämpliga fall, specialiserade tekniker, såsom fluorescensresonansenergiöverföring (FRET)4, är lämpligare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Färga Förberedelser med Supravital Dyes

  1. För garterorm dissektion protokoll se Stewart et al. 5 och Teng et al. 6 Reptil vävnad förblir fysiologiskt under längre tider, och med mindre bakteriell förorening, när de lagras vid låga temperaturer (se nedan). Däggdjursvävnad är vanligtvis hålles vid rumstemperatur eller högre.
  2. För lysosomala vitala färgämnet färgning, lösa upp färgen i kalla reptil Ringers lösning 1:5000 (0,2 mikrometer). Inkubera vid 4 ° C under 15 min. Skölj flera gånger med kallt Ringers. Bild som fort som möjligt.
  3. För FM1-43 färgning med hjälp av KCl-stimulering, späd färgen i hög KCl Ringers 1:500 (7 M). Inkubera vid 4 ° C under 30 till 60 sek maximum. Tvätta snabbt tre gånger med kall Ringers, ~ 1 min / sköljning. Bild som fort som möjligt.
  4. För FM1-43 färgning med hjälp av hypertona (sackaros) stimulering, späd färgen i 0,5 M sackaros Ringers som ovan. Inkubera vid 4 & #176; C under 2-5 min. Tvätta som i steg 1.3 ovan med kall Ringers. Bild som fort som möjligt.
  5. För FM1-43 färgning via elektrisk stimulering, se Teng et al. 6 I korthet är preparatet placerades en skål innehållande fysiologisk saltlösning och färgämnet. Nerven stimuleras med ett förprogrammerat tåg av 200 ^ sek rektangulära pulser (~ 7 V, 30 Hz, 18 ^ sek). Tvätta som i steg 1.3 ovan med kall Ringers. Bild som fort som möjligt.

2. Konfigurera Förberedelse för Imaging

  1. Rikta beredningen så att strukturerna av intresse är så nära som möjligt till mikroskopobjektivet.
  2. Om ett inverterat mikroskop används, använda en kammare vars botten innehåller en tunn rund täckglas. Normalt bör den avbildning kammare har en tunn rostfri botten med en 25 mm diameter # 1 tjocklek glas täckglas i centrum. Om en upprättstående mikroskop användes, en bottentäckglas inte nödvändigt men är användbaratt tillåta avbildning med genomlysning (t.ex. differential interferens kontrast, DIC) att orientera preparatet och lokalisera objekt av intresse.
  3. Välj ett lämpligt mål att uppnå högsta möjliga 3D-upplösning. Det finns kompromisser mellan numeriska bländaröppningen (NA), arbetsavstånd, förstoring, och typ av lins (torr, vatten-och olje-nedsänkning). För tunna preparat som vävnadskulturer, olje målen är bäst. Med användning av en upprätt mikroskop, flyter ett täckglas på det vattenhaltiga badet, och använda immersionsolja mellan toppen av locket glida och målet.
  4. Om avfaltning programvara används, kan säljaren ge förutbestämda punkten spridningsfunktioner (vävda) för vissa mål. Om ingen sådan information ges, eller om ett stöds mål väljs, bestämmer PSF genom avbildning fluorescerande mikropunkter eller liknande diffraktion-begränsad föremål 7,8.

3. Fastställa önskade skärpedjupet och Antal ImaGES Önskade per Time-lapse Frame

  1. Välj total skärpedjup så att flytta eller samverkande strukturer av intresse, inte försvinner eller går ut ur fokus när de rör sig i z-riktningen. Z-område bör vara något större än den vertikala dimensionen av cellen eller cellprocessen som avbildas. För ryggradsdjur motorplintarna, är 15-20 um typiskt.
  2. Beräkna z-axelsteg som behövs för varje inkrement av fokus. Upplösning längs z-axeln varierar beroende på egenskaper hos målet; Det är ungefär en fjärdedel av xy-planet upplösning. Om endera konfokal avbildning eller avfaltning programvara används är z-axeln upplösning förbättras. Förbättra slutliga beslut avsiktlig översampling i z-riktningen 5, men se även steg 3.3 nedan. En typisk steg intervallet är i intervallet från 400-1,500 nm för 40-100X mål. Ljus bör slutare off mellan varje z-steg bilden.
  3. Välj antal bilder per z-stack, nämligen önskat skärpedjup delatmed stegintervallet. Tiden för att slutföra en typisk z-stack är 1-10 sek. Snabbrörliga objekt (100 nm / sek) kan visas suddig i en 3D-bild stack eftersom varje bildplan motsvarar en något annan tidpunkt. Dessutom bidrar varje ytterligare bild till fotoblekning och eventuell fototoxicitet (se diskussion). Om någon situation avser, välj en större z-steg för att samla in färre bilder per stack. Kompensera senare med bildinterpole programvara (steg 6.3 nedan).

4. Välj Time-lapse Frame Rate

Välj genom experiment en takt som är precis tillräckligt för att smidigt lösa förändras med tiden, såsom rörelse, interaktioner eller fusionshändelser 9. Under provtagningen kan producera rörelseartefakter (urvalsfel), medan översampling i onödan ökar exponering för ljus. Samla antingen en enda lång sekvens eller flera upprepade sekvenser från samma beredning, var och en med en relativt liten total tidsintervallet (

5. Slutför alla Live avbildning för ett visst preparat

Reptil förberedelser förblir vanligtvis robusta för ~ 1-2 timmar, längre om kyld.

6. Analysera data Enligt Önskad användning

  1. Behåll alla rå datafiler. Medan digital lagring är oftast inte ett problem, är handläggningstiden betydande även med snabba persondatorer eller arbetsstationer. Av denna anledning, beskära bilder till en region av intresse [ROI]. Se till att hela regionen av intresse är den beskurna fönstret under hela tidsförloppet.
  2. Deconvolve bild stackar använder lämplig programvara och rätt punktspridningsfunktion. Kontrollera att upplösningen förbättras och att ingen artefakt har genererats avdeconvolution algoritm. Figur 3 visar exempel bilder.
  3. Använd en interpolation algoritm för att expandera z-axel skenbar upplösning. En 6X expansion från en faktisk 1,5 fim bildplanet separation till en skenbar 0,25 um separation föreslås. Alternativt kan du använda en kombination av översampling (steg 3.2) och interpolation.
  4. Utför kontrast, ljusstyrka, brusfiltrering, fotoblekning och andra typiska justeringar bildbehandlings om så önskas. Bildmanipulering standarder dikterar att för de flesta vetenskapliga arbetet, är det lämpligt att samma korrigeringar tillämpas på alla bilder, både inom en stack och vid olika tidpunkter. Bör bedömas bland alla bilder 9 Konsekvensen av en särskild anpassning.
  5. Välj en särskild visningsläge för export av data. Det enklaste displayen är stereo video med antingen röd-grön eller röd-blå anaglyphs (exempel i figur 3), stereopar, eller alternerande vänster / right öga ramar med shutter glasögon. Anaglyphs är begränsade till enfärgade. Förbättra skenbar bilddjup om så önskas för att förbättra z-axeln och videoupplösning.
  6. Experimentera med olika filtrering och bildförbättringstekniker. Till exempel är Laplace filtrering användbara för att öka kontrasten hos små strukturer över bakgrunden. Ljusstyrkan på bildpunkter i centrum av ett rinnande fönster förstärks medan ljusstyrkan i omgivande områden minskas. Observera att vissa filtreringsmetoder inte fungerar bra i kombination.
  7. Applicera driftkorrigering om det finns väsentlig rörelse av beredningen över tiden. Sådan rörelse är vanlig i levande muskel, även med läkemedel tillsatt för att undertrycka aktionspotentialer och synaptiska potentialer. En pixel registreringsalgoritm (t.ex.. Imaris, Adobe Aftereffects, TurboReg plugin för ImageJ) justerar tidsförlopp bilder och kan minska, men oftast inte helt eliminera, sådan rörelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Data som visas är från orm neuromuskulära terminaler (se låga och höga vyer förstoring i Figur 3; den endocytiska färgämne (FM1-43) upptag skapar en dimma, som fyller varje bouton) och, i synnerhet, macroendosomes (MES) och sura endosomer (AES) inom dessa terminaler 5. ME skapas av bulk endocytos under neural aktivitet 10 och deras antal avtar exponentiellt med tiden efter att verksamheten har upphört 6. Användning av 4D Bildproduktion var att avgöra om ME gå mot plasmamembranet och snabbt försvinner, vilket tyder på att deras antal minskar eftersom vissa av dem exocytose. Alla sådana ME var närvarande vid en tidpunkt (och de som tidigare) och helt borta vid nästa tidpunkt (och de som efter). Sålunda den tid som krävs för försvinnandet var mindre än vår ramintervall (så kort som 30 sek) och överensstämmer med exocytos. En alternativ teori, som inte stöds av 4D-data, är att ME sakta försvinna genom knoppning av vesicles tills de försvinner. Vesikler spirande inträffar 6, men åtminstone en del marknadsekonomisk status exocytosed antingen under eller efter knopp 5. Figur 1 och Film S1 visar försvinnandet av en ME mellan två time-lapse ramar. ME avsedda att försvinna inte ändra form eller ljusstyrka över två eller flera ramar (N = 16), vilket skulle ha varit i linje med långsamma försvinnande under tidsperioden av filmen (som börjar flera minuter efter kort stimulering). ME försvinnande observerades tidigare i konventionell tidsförlopp, men det var möjligt att de strukturer som helt enkelt hade lämnat plan fokus. Dessutom tittar från en mängd olika perspektiv (Film S1) bekräftade att ME försvinnande var plötsligt. Med konventionella live-imaging (sett från ett enda perspektiv, till exempel xy bildplanet) brusartefakter begränsa utredarens möjligheter att bekräfta att en struktur var oförändrad. Dessa artefakter är ofta närvarandei en vy, men inte andra.

Elektronmikroskopi studier visade att endosomes i motorplintarna är små, nära diffraktionsgränsen av ljus 10. Därför fusion av dessa endosomes kan inte helt skiljas från nära rumslig förening på ljusnivå. ME var märkta med FM1-43 (grön-fluorescerande), och biverkningar med en lysosomala vital färgämne (röd-fluorescerande). Strukturer som fluorescerade i båda färgerna (visas gul) var ibland noteras i 4D bild register. Med hjälp av lämplig programvara, har utsikt över de dubbelmärkta och därför tydligen smält endosomes från en mängd olika perspektiv som genereras i syfte att undersöka sammanfaller de båda etiketterna i voxlar nära och i den skenbara strukturen. Figur 2 visar en förmodad smält AE-ME betraktad från tre ortogonala riktningar. En uppfattning är xy-planet; de andra vyerna är ortogonala mot detta plan och mot varandra. Med användning av denna metod fann man att voxlarantingen överlappade, som i detta exempel, eller att de gjorde uppenbarligen inte i en eller flera visningsplan. Movie S2 visar samma förmodade smält AE-ME presenteras som en interaktiv virtuell visning verklighet (fullt vridbar i tre dimensioner).

Digital deconvolution är ett användbart verktyg för att öka upplösningen i 3D och 4D-bilder, både konventionella och konfokala mikroskop 11. Deconvolution är en numerisk, iterativ process som kompenserar, i viss mån, för begränsad rumslig upplösning av det mål som används. Denna resolution karaktäriseras som målet är punktspridningsfunktionen-3D-volymen upptas av bilden av en oändligt liten punkt. I teorin deconvolution återställer bilden som skulle uppstå om målet var perfekt. Figur 3 är en 3D-volym av två olika datamängder, var och visas som ett par röda-gröna anaglyphs. De rätta bilderna visar typiska förbättrad skärpa efter digital defaltning av bilden stacken.

Figur 1
Figur 1. En macroendosome (ME) försvinner efter en till synes kontakt med plasmamembranet. En orm nerv-muskelberedningen elektriskt stimulerade i närvaro av FM1-43. Data samlades in med hjälp av 4D avbildning som beskrivs i Metoder och visas som "3D Volym views" vid sex tidpunkter (60 sek intervall) för att illustrera Z-djupet på en enda Bouton. En ME kan observeras på väg bort från Y-axeln (röd streckad linje) över flera ramar innan försvinner mellan tidpunkter 5 och 6. Strax före försvinnandet, förefaller det mig att vara placerad vid Bouton s plasmamembran (avgränsas av FM1-43 vesikler färgning eller "haze," se figur 3 legend). ME har inte återkommer isenare tidpunkter (data visas ej, se film S1). Skala bar, 2 ìm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

FILM S1:. 4D time-lapse vyer av MIG försvinnande Klicka här för att se filmen. Samma rådatauppsättning som visas i Figur 1 visas som en "4D volym view" på en lägre förstoring. Den ursprungliga tidsförlopp sekvens omfattar 8 tidpunkter, varje separerade med 60 sek; uppspelningen är på 4 bilder / sek. Sekvensen är kort paus i början av var och en av 24 3D-rotationssteg om y-axeln (15 grader / steg) för att uppmärksamma den snart kommer att försvinna MIG (röd pil). Observera att ME är synlig, närmar sig kanten på Bouton (plasmamembran), försvinner, och inte återvänder, ialla tittar perspektiv. På grund av lägre z-axeln upplösning jämfört med xy upplösning, visas formen hos ME för att förlänga och förkorta beroende på visningsplanen. Bilder exporterades som en QuickTime-film, och kommenterad med QuickTime Pro. Skala bar, 2 ìm.

Figur 2
Figur 2. Ortogonala vyer av en förmodad smält endosome. En nerv muskel preparat sekventiellt färgas med en lysosomala vital färgämne (röd) för att märka biverkningar och FM1-43 (grön) för att märka ME med hjälp av 0,5 M sackaros stimulans som beskrivs i Methods. Data från en tidpunkt av en 4D-film visas som 3D-volym utsikt i tre riktningar. På topp (panelerna 1-3) är det konventionella vy från ovan (xy-planet). Vid mitten (panelerna 4-6) är en vy vinkelrät mot xy-planet ochi (godtycklig) riktning av den stora röda pilen. Nedtill (paneler 7-9) är en vy som ömsesidigt vinkelrät mot båda vyerna ovan, i riktningen för den stora blå pil. En ME (grön) är markerad med en grön pil; två AES (röd) är markerade med röda pilar. En endosome innehåller både färgämnen (gul) är markerad med en gul pil i paneler 3, 6 och 9. Observera att överlappning av rött och grönt är lika komplett i alla tre ortogonala projektioner. Skala bar, 2 ìm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

FILM S2:. Interaktiv rotation av bilden som innehåller MES och sura endosomer AEs . Klicka här för att se filmen Datamängden i figur 2 visas konfigurerad som en fullt vridbar 3D-bild (QuickTime Virtual Reality format; Använd musen för att rotera bilden för visning från alla håll). De förmodade smält ME / AE är fortfarande gult från alla perspektiv.

Figur 3
Figur 3. Deconvolution förbättrar 3D rumslig upplösning. Två typiska orm nervterminaler, vilka visas vid låg (överst) och hög (botten) förstoring respektive och färgades under stimulering med FM1-43. FM1-43 bakgrund "dimma", på grund av märkning av enskilda 50 nm vesiklar, visar formen på terminal boutons där ME är begränsade. Data visas som röd-gröna anaglyphs av 3D-vyer volym (djup kan visualiseras med röd-grön eller röd-blå glasögon, röd på vänster öga, notera axon vid övre vänstra sänker sig in i planet för terminalen från ovan). Vänster paneler: rådata; Höger sida: data efteravfaltning. Notera den betydande förbättring i upplösning på ME. Top paneler: Elektrisk stimulering; Hela terminalen visas (~ 30 x 50 mikrometer) (samma rådata som i figur 1 och Film S1, skalstock, 10 mikrometer). Botten paneler: KCl stimulering; förstoras för att visa fyra olika boutons (~ 3 x 5 ìm, skala bar, 2 um). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest kritiska aspekten av 4D avbildning är hanteringen av varaktighet och intensitet ljusexponering. Fotoblekning minskar bild signal-till-brus-förhållande och kan vara problematiskt eller inte beroende på olika faktorer, bland annat val av fluoroforer. Icke-specifik skada på levande vävnad (fototoxicitet) är relaterad till fotoblekning, och kan ibland identifieras med hjälp av fluorescerande prober som utformats för ändamålet 2,12 eller genom undersökning av morfologi med lämpliga bright optik, såsom differential interferens kontrast (DIC).

Det är dock möjligt att framkalla en fysiologisk effekt som uppstår vid ljusnivåer långt under storleken av de som förknippas med fotoblekning och fototoxicitet. Till exempel i tidiga experiment med flera preparat, varje fast vid en annan tidpunkt efter stimulering, var i vilken takt ME försvann med tiden efter en kort stimulering mätt 6. Som praxis to minimera blekning, förbereddes förvaras i mörker tills de ses. När liknande experiment utfördes med hjälp av 4D Bildproduktion, förblev många fler ME under hela experimentet (~ 20-60 min) och försvann inte. Användning av samma live-imaging-protokoll, utom faktiskt inte spelar in och därmed begränsa ljusexponering till en enda 3D-ram i början och en enskild bildruta i slutet, återställt den förväntade totala andelen endosome försvinnande den för fasta preparat.

Ytterligare felsökning visade att graden av försvinnandet var delvis omvänt och monotont relaterad till total ljusexponering under ett experiment. Efter misslyckade försök att minska exponeringen via konventionella och multi konfokala optik, var problemet slutligen lösas genom köp av en ~ 3x känsligare kamera (Tabell 1). Det rekommenderas att liknande jämförelser göras om det är möjligt, beroende på användarens ansökan. Om några process eller övergång dokumenteras över tid, bekräftar att det inte finns någon förändring hänförlig till intensitet eller sammanlagt minst belysning. Fototoxicitet och fotoblekning är dye-specifika. Till exempel såg vi ingen signifikant bleknar efter upprepad 4D avbildning av en terminal (350 individuella ljusexponeringar över 30 min) med hjälp av FM1-43. Samma bildprotokoll med användning av ett liknande färgämne, SGC5 (tabell 1) resulterade emellertid i viss blekning och, förmodligen, fototoxicitet samt (data ej visade).

Med undantag av förbättringarna som tillhandahålls av digital deconvolution (och konfokala optik om de används, visas inte), den enkla metod som beskrivs ger ingen "super" upplösning. Däremot har metoden den fördelen att förbättra praktiskt eller intuitivt upplösning när du tittar på levande strukturer, särskilt rörliga sådana, vars storlek är lika med eller något större än diffraktionsgränsen. Förmågan att se föremål från olika perspektiv, including presentation i var och en av tre rätvinkliga plan, leder utredaren om huruvida en struktur som faktiskt existerar över ljudnivån och om den är märkt med en eller flera fluoroforer. Till exempel, i experiment utformade för att kvantifiera antalet och storleken av MES och AEs, var det möjligt att bekräfta att strukturen var synlig från olika perspektiv och att varje dimension (och därmed dess tredimensionella volym) låg inom området typiskt för att struktur. Vid lokalisering av en struktur är också bättre definierade, t ex inom ett axon, nervterminalen osv. snarare än över eller under den. Däremot när synfältet var begränsad antingen till en enda 2D-bild plan eller till en enda projektion av 3D-data, förmodade strukturer ofta visat sig vara "brus". Likaså förmodade dubbelmärkta strukturer ofta visat sig vara två strukturer som dök upp i samband från en tittarperspektiv (eller två), men inte från alla. Visualisering från tre ortogonala riktningningar ger en standard och rutin kriterium för bedömning av existens, storlek och märkning egenskaper endosomes eller liknande strukturer som kan användas i kvantitativa och statistiska analyser.

Den metod som beskrivs är praktisk i det att en konventionell videomikroskop av den typ som finns i många laboratorier kan användas. Instrumenteringen är mångsidig snarare än specialiserade, och relativt billiga. Medan program specifika för en viss mikroskop användes här, kan öppen källkod för både bild förvärv och databehandling ge liknande resultat 13. Tekniker (inklusive deconvolution) gäller för singel-och multi konfokala avbildning med liknande fördelar, så länge som ljusexponering tolereras av den levande preparatet används. I framtiden kommer konstruktionsförbättringar ytterligare öka nyttan 4D Bildproduktion. Hit hör i första hand, hårdvara som ökar hastigheten för att fokusera och excitation / emission filter changing, och tillgången på ännu känsligare videokameror.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant NS-024.572 (till RSW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
SGC5 Biotium, Hayward, CA 70057 Final conc: 10 mM
FM1-43FX Invitrogen, Carlsbad, CA F35335 Final conc: 7 mM
LysoTracker Red Invitrogen, Carlsbad, CA L7528 Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 86 mM
KCl 60 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
Sucrose 0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm  Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA 175W Xenon arc lamp www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA www.sutter.com
Sensicam CCD camera Cooke Instruments, Tonawanda, NY www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera Photometrics, Tucson, AZ www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0 Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2 Bitplane, South Windsor, CT Drift correction; 3D and 4D data presentation www.bitplane.com
AfterEffects CS6 Adobe, San Jose, CA Drift correction www.adobe.com
ImageJ 1.46 National Institutes of Health, Bethesda, MD Multiple plugins available; Stereo pair construction http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY Stereo pair construction www.zeiss.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122, (6), 753-767 (2009).
  2. Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
  3. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
  4. Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
  5. Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
  6. Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
  8. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
  9. Cromey, D. W. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).
  10. Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20, (21), 7986-7993 (2000).
  11. Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19, (12), 4855-4866 (1999).
  12. Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. 1495-1505 (2010).
  13. Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics