腎摘出後のマウスにおける自発転移性腎細胞癌(MRCC)をモデル化する

Medicine

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Summary

自発的な転移性腎細胞癌(RCC)、疾患進行のモデルは、臨床的に関連する設定で治療を評価するために使用することができる。このプロトコルは、同所腎臓腫瘍細胞移植、適切な腎摘出のためのさまざまな手順を示していて、最終的には転移性の負担とローカリゼーションの視覚的および生物発光採点のための剖検ガイドの概要を説明します。

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Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy. J. Vis. Exp. (86), e51485, doi:10.3791/51485 (2014).

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Abstract

腎細胞癌(RCC)の新実験治療の改善されたテストの重要な課題の一つは、忠実に早期及び後期転移性疾患の進行を再現モデルの開発である。典型的な腫瘍移植モデルは、異所性または同所原発腫瘍移植を利用しますが、いくつかは、臨床設定を模倣全身自発転移性疾患が含まれる。このプロトコルは、患者さんに似腎細胞癌疾患の進行段階を開発するための重要な手順について説明します。まず、同所性腫瘍細胞移植を示すために同系モデルにおいて、高転移性マウス腫瘍細胞株を使用する。方法は、漏れや、早期の広がりを防ぐために、マトリゲルと組み合わせた細胞のサブ莢膜空間に表面的で、内部の移植が含まれています。その横には、重要な前と手術後のマウスの注意を払って、腫瘍を有する腎臓(腎摘出)の切除のための手順について説明します。最後に、監視し、評価するために必要な手順の概要を説明生物発光イメージングなどのミクロおよびマクロ転移性疾患の進行は、同様に全身性疾患の分布を獲得するための詳細な視覚的剖検ガイドを提供します。このプロトコル記述の目標は、将来の治療試験の予測値を改善するために臨床的に関連する転移性RCCモデルの普及を促進することである。

Introduction

腎細胞癌(RCC)を有する患者における死亡の主な原因は、典型的には、腎臓中で増殖する原発腫瘍の外科的切除後に生じる全身性の転移性疾患である。しかし、マウスでは実験的な治療法を評価する非常に少数の前臨床腫瘍モデルは、転移性疾患が含まれており、少数の、まだ忠実にローカライズされた成長、手術、および自発的なマイクロ転移開始および進行1-3の臨床病期を再現。テスト中のこのギャップは時々 、動物モデルで見られる顕著な抗腫瘍効果は、常に患者4の同様に治療の成功に翻訳されていない新しい治療法の評価においてますます重要になってきた。結果におけるこのような差異は、ローカライズされた異所性または同所原発腫瘍モデルと後期転移性疾患5-7間の差動薬効に由来する。 RCCの場合には、少数の研究のみが確立採用している一般的に、腫瘍を有する腎臓を受けた患者は全体的または部分的に2,3を削除模倣自発的再発が含まニマルプロトコル。マウスモデルのテストで、この不足の理由は様々である。まず、高コスト動物および腫瘍細胞の選択および転移能の固有の変動性が存在する。 (例えば、ヒト細胞株導出8-10の説明を参照)、例えば、ヒト腎細胞株はめったに転移していない傾向があり、一貫し普及および遠隔病変を形成する変異体を導出するために同所一次注入及び転移複数回の選択にわたって選択されなければならない。逆に、免疫応答性モデルでマウスの細胞では積極的に行動する傾向があり、低細胞数はすぐに全身スプレッド3を減らすためにマトリゲルを注入しなければならない。第二に、技術的な適切な注入、外科的切除(摘出術)を実施し、追跡の困難(かつ定量)自発metastatiCの成長は挑戦することができますし、(詳細については説明を参照)、この手法を採用する場合、いくつかの重要な変数は、検討が必要です。このプロトコルの目的は、同所移植、切除(腎摘出)、および自発的な転移性腎細胞癌疾患のモニタリングの重要なステップ(および潜在的な落とし穴)を記述するために、標準化され(そしてより広範な)のための指針を提供するために科学的な研究室の中で使用しているそれは、実験的治療法の有効性を評価する。

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Protocol

1。同所腎臓腫瘍移植

  1. 細胞培養
    1. 同所移植の前に、75%コンフルエントに単層としてマウスRENCA LUC細胞を成長させる。
    2. 5%FBS含有培地1,000 rpmで遠心分離細胞、5分間、4℃、PBS中で洗浄することを3回繰り返すことで、トリプシン処理および再懸濁以下。その後、5×10 4個のRENCA LUC / 5μlの無血清培地の濃度に無血清培地で細胞を懸濁します。
      注:使用される変異体または細胞株に依存して、細胞が移植後に非常に攻撃的なマウス細胞増殖及び播種を遅らせる1:1マトリゲルとの比を無血清培地に再懸濁することができる。
  2. 手術と細胞移植
    注:すべての動物実験は、施設内動物管理使用委員会(IACUC)Pに従って行った、実験的なエンドポイントの維持決定を含む、そこに記載されているロズウェルパークがん研究所によって承認rotocol。
    1. イソフルランを用いたもののBalb / Cマウス(2-3%)で麻酔。足をつまんで、十分な麻酔を確保するために、反射的に確認。乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。右横臥位にマウスを置き、前後と後肢の間で左側を剃る。無菌的に切開するための領域を準備するために背側腰部領域に沿ってアルコールとヨウ素を適用します。
    2. 最後の肋骨と股関節の間の縦方向に1cmの皮膚切開を開始するために、外科はさみを使用してください。鈍的切開のハサミを用いて皮膚の下に結合組織を緩めます。腹壁内の長手方向に0.5センチの切開を作るために、外科はさみを使用してください。そっと開いた傷口の周りにプッシュダウンする湾曲したピンセットを使用する - これは、腎臓を体外にし、注射前に臓器の穏やかな固定化を可能にする。
    3. 調製した細胞混合物μlの5でハミルトンシリンジをロードします。サブ莢膜implan用tationsは、2つの埋め込み方法を用いることができる。
      1. 浅:縦方向に向い腎臓に平行して走り、、斜めの縁を上にして腎臓​​被膜下(しかし、実質上の)針を挿入します。針が配置されると、小さな白い泡が形成されるまで細胞の全てを注入する。ゆっくりとカプセルから針を外し、すぐに漏れを吸収し、細胞播種を防止するために、滅菌綿棒で注射にわたってブロット。
      2. 傾斜端を上にして、腎臓の反対側から、最終的な移植部位に始まり、針は(パンクチャリングではなく)表示されるまで、腎臓の内部を通って針を挿入し、サブ莢スペース:内部。任意の漏れを防ぐために白い気泡フォームおよびスワブ注射部位まで、細胞の全てを注入する。
    4. 優しく体腔への腎臓を戻す。吸収性5-0ビクリル縫合糸を使用して腹部の体壁を閉じます。完了したら、一緒にスキン層を引き、wは2-3を配置クリップをound。クリップがしっかりと均等に全く傷の露出を確保しないように間隔をあけていることを確認してください。リカバリ前の0.9%NaCl500μlの皮下25 Gの針を用いてブプレノルフィン(0.01 mg / ml)を100μlの管理。日常のクリップの配置と安定性を監視し、10日後に削除します。

2。腎摘出/原発腫瘍の除去

  1. のセクション1.2.1と1.2.2で説明したように(上)マウス麻酔、固定化、切開し、腎臓の露出のための同一のプロトコールに従ってください。
  2. 優しく尾方端から接続して脂肪組織、腎臓の頭側端から副腎を除去することによって、腎臓を分離するために鉗子の第二の対を使用してください。優しく腎臓を把握しながら、尿管、腎動脈、静脈を二重結び目を作るために、吸収性5-0ビクリル縫合糸を使用しています。ゆっくり確保してから腎臓を取り除くために、結び目の上にカット。すぐに血液の損失の兆候あれば、あるいは不十分なホールドの危険性がある尿管、動脈、静脈に縫合糸は、結び目の上にカットする代わりに、はさみを焼灼器を使用しています。
  3. 腎臓が除去されると、慎重に縛ら動脈から出血を確認し、必要に応じて焼灼器を使用しています。 5-0ビクリルを使用して腹部の体壁を閉じます。一緒にスキン層を引き、1.2.4で説明したのと同様の注意事項を次の2〜3創傷クリップを配置します。密接に出血苦痛の徴候、あるいは限られた移動性のための手術後、毎日動物を監視します。安全に動物のための施設のガイドラインに従ってください。

エンドポイントで3。のモニタリング転移進行とローカリゼーション

  1. 転移性疾患の定量化:生物発光モニタリング
    1. 方法論は、以前にルシフェラーゼをトランスフェクトした細胞を用いて、転移をモニタリングするためJOVEに記載のゼノジェンIVISイメージングシステム11,12を用いて定量見る。
  2. 転移性分布の比較評価のための視覚的剖検ガイドのTiON
    1. 犠牲の動物の苦痛の兆候、呼吸困難、体重減少などを含めたエンドポイントを使用して施設のガイドラインに従っ
      注:自発的な転移性の進行が非常に変化し、急速なように、動物のクローズ監視は重要です。
    2. 下顎骨に胸腔を続けて尿道上記切開を開始するために、外科はさみを使用してください。腹壁の筋肉から皮膚を分離するために、平滑末端はさみを使用してください。
    3. 腕と脚に沿って切開を開始します。皮の皮離れて。密接に結節のための皮膚筋膜と腹壁を調べ、その後、表在リンパ節:鼠径、上腕、腋窩および表面的な子宮頸。
    4. 腹壁の切開を行い、横隔膜までの左右の側面に沿って切断。 1水平カットと内臓を露出するために腹壁の前部を削除します。
    5. 内臓fの邪魔されずに外観を調べまたは著しく顕著な腫瘍が。また、胃や腸の内容に注意してください。彼らが空の場合、マウスは食べることができなかった可能性があります。コンテンツが暗い場合、これは、上部/下部胃腸出血の証拠を示すことができる。
    6. 視覚的に各マウス群の合計スコアを割り当てること、腫瘍の有無を各臓器のスコア(各群4匹の動物が図1D-iの中で例として使用される)。
      注:1)リンパ節の拡大が必ずしもそれが腫瘍の成長であることを意味するものではありません。それは、大幅にサイズの非常にしっかりと、白っぽい色であれば、それは可能性が高い転移性結節である。 2)腹部の過剰な乳白色や曇り液体が腹水を示します。腹水は、特に肝臓と胃のローブ間腹部臓器に固体の蓄積を含むことができる。 3)肺などの器官のために、多数の小結節(例えば13を参照)に存在し、個々の動物間の比較にカウントすることができる。
    7. 慎重に取り外し、噴出ボトルから、PBSで洗浄することにより、肝臓、脾臓、腎臓、膵臓:個々の腹部臓器の肉眼的腫瘍や異常を特定します。
    8. 腹部臓器を除去した後、腰椎、仙骨、腎臓、および腸間膜リンパ節を含む腹部のリンパ節を検査する。
    9. 転移拡散の証拠ダイアフラムを評価します。
      注:ダイヤフラムに関する広範な普及はこじつけや呼吸の喪失につながる、それはその収縮性を失う可能性があります。
    10. ダイアフラムを外し、胸腔内に2の横切開を行い、肺と心臓を露出させ、正面部分を除去する。
    11. そっとつかんで持ち上げ、食道を、心臓の上に気管を切断することにより、肺と心臓を取り出します。結節のための組織を評価する。心を絞る。弾力の一貫性の欠如は、腫瘍の存在を示すことがあります。
    12. 頭蓋骨を通して直線的にカットする外科はさみを使用してください。優しくトンまで頭蓋の小片を取り除く彼は、全脳を露出させる。目に見える結節や異常変色のために脳全体に見て。

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Representative Results

図1Aは、このプロトコルの概要で説明する手順を概説する回路図を示します。いくつかの重要な要因は、各ステップのために考慮されなければならない。たとえば、ステップ1で、それは、腎臓へのサブ莢腫瘍細胞移植のための二つの方法を示しています。腫瘍細胞は、針の慎重な除去と拭き取り過剰エスケープ流体( 図1B-I)により防止漏れ細胞の局所的な配置を確認した小さな白い泡のサブ莢の空間に移植することができる。漏れを防止するために、細胞は、サブ莢空間( 図1B-II)に到達するために内部第移植し、血流中に腫瘍細胞の初期分布を防止するために、マトリゲルと組み合わせることができる。腎臓の外科的除去のために、正確なタイミングは、使用される細胞株の成長および転移の可能性に依存する。最適な腎摘出の練習は、マウスの苦痛と回復を最小限に抑えるために高速だが、制御、外科的手順が含まれています。 T尿管、腎動脈と静脈を閉鎖するビクリルのIGHTで安全な結節( 図1C参照 )出血を避けるための鍵となります。焼灼を使用する必要がありますが、過剰出血の可能性が介入を必要とする場合に限られます。最後に、非侵襲的な生物発光性評価による自発的な疾患の追跡は、( 図1D参照 )エンドポイントで継続的なオカルト病変と成長のモニタリングだけでなく、定量を可能にする。しかしながら、自然転移モデルにおけるルシフェラーゼ標識細胞を使用することはトランスフェクトされた遺伝子を発現しないことがあり、したがって、常に選択または長期腫瘍増殖の複数のラウンド後に表示されないことがあり変異体のクローン性腫瘍細胞の選択をもたらすことができる。この場合において、臨床的に関連する組織学的分析は、微小転移巣を同定することができ、または、しない技術的に(金銭的に)可能な場合、視覚的なマクロ転移性疾患を評価するための視覚的スコアリング方法はpresaの複数形の表面的な尺度として使用することができる臓器組織の病変のNCE /不在( 図1D-Iおよび1D-II)。

図1
図1移植を含む外科的処置A)の回路図(工程1)、外科的切除/腎摘出(工程2)、及び(i)を含むサブ莢移植手術後の転移性疾患の評価(工程3)。B)実施例外科腎摘出の手順(i)と移植した腫瘍手術後の自発的な転移性疾患を用いて、iの(II)。D)アセスメント)評価するための視覚的なスコアリングシステムで切り出し腎臓の代表画像の表面と、(ii)内部技術。C)の例QUの直前犠牲前後の病気の分布(4匹の5グループからの代表的な結果)、及びii)生物発光データantitativelyミクロおよびマクロ転移病変を評価します。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルの目的は、注入/切除技法を説明するために同系腫瘍マウスモデルを用いて、臨床的に関連する自発的な転移性疾患を評価することである。現在、新たな実験的な治療法を評価する前臨床試験の大半は、転移性疾患の研究が含まれていないと、わずか数は、原発腫瘍の増殖、外科的切除、および最終的な自発的な転移拡散の段階を再現。現在までに、遺伝子操作したマウスモデル(GEMMs)は自発性腎細胞疾患の進行を引き出すために生成された(概要については14を参照)後期転移および外科的介入戦略は、これまで報告されていない含まれていません。したがって、自発的な転移性腎細胞癌の研究は現在、同所腫瘍細胞移植のモデルに限定されている。これらのモデルは、以前2,3開発されてきたが、このプロトコルは広く、特ににおいて、新しい治療法の評価に使用されていないそれは、ほとんどの予測値を有することがあり、周術期の設定。このプロトコルは、細部への治療評価においてより広範な利用を容易にすることができる必要な手続きのステップバイステップガイドを目指しています。記載された技術を実行する際に潜在的な落とし穴の面では、アウトカムに影響を与える可能性があるいくつかの重要な考慮事項があります。まず、移植後の腫瘍細胞の漏れは、腹膜疾患普及につながる可能性があるため、最初のローカライズされた主要な成長を表しているわけではありません。第二に、最適な切除時間は、使用される各細胞株のために確立されなければならない。早すぎる腫瘍を有する腎臓の外科的摘出術が遅すぎる手術を行う、非限局性疾患と(通常は脾臓への)臓器溶融につながる可能性があり、疾患の普及( すなわち 、それは治癒することができる)、そして手術のために許可しない可能性があるため、これは重要です実行可​​能でないと、最初のマウスの回復。最後に、生物発光と自発的な転移性疾患をモニタリングすることは、Sと同時でなければならない病気などの動物の罹患率の機関のガイドライン監視看板にtrictの付着はローカライゼーションと全体的な影響の両面で非常に可変することができます。動物実験の適切な統計的電力供給はすべて変動が含まれることが可能になり、より忠実な臨床疾患の進行および治療応答を再現するであろう。一緒になって、この記事では、成功して前臨床腫瘍モデルにおいて臨床的関連性の向上を目的としたローカライズされた同所RCCや手術後の再発を再現するために使用される技術を実証している

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

我々は、この手順の開発で技術的なヘルプと専門知識のためのロバートS.カーベル(トロント大学、サニーブルック研究所、トロント、カナダ)の研究室に感謝しています。また、博士はサンドラ·セクストンや実験動物資源のロズウェルパークがん研究所部門に感謝したいと思います。この作品は、(JMLEへ)ロズウェルパークアライアンス財団から賞によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine Corning 10-013-CV
FBS Invitrogen 10437-028
0.25% Trypsin EDTA Corning 25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium Corning 21-031-CV
Matrigel BD Biosciences 354234 must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment Akorn Animal Health 17478-162-35
Pocket pro pet trimmer Braintree scientific CLP9931B
Alcohol swab VWR 326895
Betadine solution swab VWR 67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5"  Southpointe surgical RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long Kent scientific INS15915 need two of these
10 µl Hamilton syringe Hamilton 7635-01
30 G, 45 degree, RN needle Hamilton 7803-07
Sterile cotton tipped appicator VWR 10805-144
High temperature cautery kit Kent scientific INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle  Ethicon J834
Reflex clip applier for 7 mm clips Kent scientific INS500343
Reflex clips, 7 mm, non-sterile Kent scientific INS500344
Removing forceps, 12 cm long Kent scientific INS500347
0.9% Sodium Chloride Baxter Healthcare 2B1322
Buprenorphine 0.01 mg/ml
25 G 5/8" needle VWR BD305122
1 ml syringe w/out needle VWR BD309659
D-Luciferin Gold Bio technology LUCK-1G

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References

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