To-foton

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yu, X., Zuo, Y. Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation. J. Vis. Exp. (87), e51520, doi:10.3791/51520 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I pattedyr cortex neuroner danner ekstremt komplicerede netværk og udveksle information på synapser. Ændringer i synaptisk styrke, såvel som tilsætning / fjernelse af synapser, forekommer i en oplevelse-afhængig måde, som giver den strukturelle fundament af neuronal plasticitet. Som postsynaptiske komponenter af de mest excitatoriske synapser i hjernebarken, er dendritiske Torner anses for at være en god proxy af synapser. Tager fordelene ved muse genetik og fluorescerende mærkningsteknikker, individuelle neuroner og deres synaptiske strukturer kan mærkes i den intakte hjerne. Her introducerer vi en transkranial billedbehandling protokol ved hjælp af to-foton laser scanning mikroskopi at følge fluorescensmærkede postsynaptiske dendritiske Torner over tid in vivo. Denne protokol udnytter en udtyndede kranium præparat, der holder kraniet intakte og undgår inflammatoriske virkninger forårsaget af udsættelse i hjernehinden og cortex. Derfor kan billederne erhverves umiddelbart efter surgery udføres. Den eksperimentelle fremgangsmåde kan udføres gentagne gange over forskellige tidsintervaller spænder fra timer til år. Anvendelsen af ​​dette præparat kan også udvides til at undersøge forskellige kortikale regioner og lag, samt andre celletyper, under fysiologiske og patologiske tilstande.

Introduction

Pattedyr cortex deltager i mange hjernefunktioner, lige fra sansning og bevægelse kontrol til abstrakte informationsbehandling og kognition. Forskellige kortikale funktioner bygger på forskellige neurale kredsløb, der består af forskellige typer af neuroner meddele og udveksle oplysninger på de enkelte synapser. Struktur og funktion af synapser er konsekvent at blive ændret som reaktion på erfaringer og patologier. I den modne hjernen, synaptisk plasticitet tager form af både styrke ændringer og tillæg / fjernelse af synapser, spiller en vigtig rolle i dannelsen og vedligeholdelsen af ​​en funktionel neurale kredsløb. Dendritiske spidser er de postsynaptiske komponenter i størstedelen af ​​excitatoriske synapser i pattedyrs hjerne. Den konstante omsætning og morfologiske ændringer af pigge menes at tjene som en god indikator for ændringer i synaptiske forbindelser 1-7.

To-foton laser scanning mikroscopy tilbyder dybe indtrængen gennem tykke, uigennemsigtige præparater og lav fototoksicitet, hvilket gør den velegnet til billeddannelse i den intakte hjerne 8. I kombination med fluorescerende mærkning, to-foton billedbehandling giver et kraftfuldt værktøj til at kigge ind i levende hjerne og følg strukturrationalisering på de enkelte synapser med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Forskellige metoder er blevet anvendt til fremstilling af mus for levende billeddannelse 9-13. Her beskriver vi et præparat af in vivo to-foton imaging tyndet-kranium for at undersøge den strukturelle plasticitet postsynaptiske dendritiske Torner i musen cortex. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, har vores seneste undersøgelser afbildet et dynamisk billede af dendritiske rygsøjlen ændringer som reaktion på motorik læring Med stigende tilgængelighed af transgene dyr med fluorescensmærkede neuronale delmængder og hurtig udvikling af in vivo mærkning af teknikker, kan lignende procedurer er beskrevet her også anvendes til undersøgelsete andre celletyper og kortikale regioner, kombineret med andre manipulationer, samt anvendes i sygdomsmodeller 16-23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Godkendelse skal indhentes fra hjeminstitutioner før påbegyndelse af kirurgi og imaging undersøgelse. Eksperimenter er beskrevet i dette manuskript blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og regler fra University of California, Santa Cruz Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1.. Kirurgi

  1. Autoklavér alle kirurgiske instrumenter og sterilisere arbejdsområdet med 70% alkohol grundigt før operation.
  2. Bedøver musen ved intraperitoneal (IP) injektion af KX bedøvelsesmiddel opløsning (200 mg / kg ketamin og 20 mg / kg xylazin) i henhold til musens kropsvægt Bemærk:. KX dosis kan justeres efter den stamme, alder og sundhedstilstand af musene. Veterinær høring for at afgøre den optimale dosis er også anbefales.
  3. Udfør en tå-knivspids test med jævne mellemrum ved at trykke på musens tæerne og kontrol for en refleksiv reaktion at overvåge anæstesi status.Sørg for, at musen er fuldt bedøvet, før du starter operationen Bemærk:. Under langvarig billeddiagnostiske sessioner, kontrollere musens anæstesi status med jævne mellemrum, administrere ekstra KX hvis det er nødvendigt.
  4. Anbring musen på en varmepude til at holde temperaturen kroppen under operationen.
  5. Barbere hovedet på musen ved hjælp af et barberblad for at blotlægge hovedbunden.
  6. Sterilisere barberede område ved at tørre huden med vekslende alkoholservietter og betadine. Fjern eventuelle resterende hår udklip.
  7. Forsigtigt anvende eye salve at smøre begge øjne, derfor forhindre permanente skader forårsaget af dehydrering under eksperimentet.
  8. Foretag en lige snit langs midterlinjen af ​​hovedbunden og flytte huden lateralt mod kanterne af kraniet.
  9. Fjern bindevæv fastgjort til kraniet.

2. Udtyndede kranium Fremstilling

  1. Identificer imaging regionen, baseret på STER. eotaxic koordinater Bemærk: Prøv at undgå store blodkar, som blok lysgennemtrængning og sløre afbildet strukturer. Vasculature observeres bedst, når kraniet er fugtig med sterilt saltvand.
  2. Brug high-speed micro bore at tynde en cirkulær område af kraniet (diameter 0,5-1,0 mm). Flyt boret parallelt med kraniet overflade, snarere end at holde den mod kraniet og trykke ned. Bor indtil både ydre kompakt knogle lag og den midterste svampet knogle lag fjernes Bemærk:. At undgå skader forårsaget af overophedning, undgå langvarig kontakt mellem boret og kraniet.
  3. Fortsæt tyndere indre kompakt knogle lag med en mikrokirurgisk klinge i midten af ​​drill-tyndet region. Hold microsurgical kniv i en vinkel på cirka 45 ° til at skrabe kraniet uden at trykke ned mod kraniet, indtil en jævnt tyndet lille region (200-300 um diameter) med en tykkelse på tilnærmelsesvisly 20-30 um er opnået. På grund af autofluorescens af kraniet, kan måles tykkelsen ved at scanne afstanden mellem øvre og nedre overflade af kraniet under to-foton mikroskop Bemærk:. Selv et kranium tykkelse på mindre end 20 um giver god billedkvalitet, er det ikke anbefales, fordi det gør udtynding proces i efterfølgende re-imaging sessioner vanskelig. For at undgå over-udtynding, skal kontrolleres med jævne mellemrum under operationen (se Diskussion) tykkelsen af kraniet.

3.. Immobilisering

  1. Fjern forsigtigt knogle rester.
  2. Placer en lille dråbe cyanoacrylatlim på hver kant af åbningen i midten af den sterile toppladen, som er blevet autoklaveret (se figur 1). Hold hovedet pladen stramt mod kraniet med den indsnævrede område beliggende i centrum af åbningen Bemærk:. Hvis limen forurener udtyndede rEgion ved et uheld, skal du fjerne det forsigtigt med microsurgical blad.
  3. Træk forsigtigt huden fra siderne af skallen til kanterne af åbningen i midten af ​​hovedet plade.
  4. Vent cirka 10 minutter, indtil hovedet pladen er godt fastgjort til kraniet.
  5. Placer hovedet plade på to laterale blokke af bedriftens pladen og stram derefter skruerne over kanterne af hovedet plade til at immobilisere musen på bedriften pladen (se figur 1) Bemærk:. Sørg for, at der ikke er noget hud eller whiskers mellem hoved plade og blokkene før stramme skruerne. En god immobiliseret præparat skal vise ingen observerbar flytning af kraniet under dissektionsmikroskop, når ryggen af ​​dyret forsigtigt duppet.
  6. Bemærk Skyl det udsatte kraniet med saltvand for at fjerne upolymeriseret lim:. Det er vigtigt at fjerne enhver resterende lim, som upolymeriseret lim udvisker billeder og skader mikroskop mål <./ Li>

4.. Imaging

  1. Tage et billede af vaskulaturen af den eksponerede kraniet med fortyndet regionen som kort 1, som bruges til at flytte den billeddannede region efterfølgende billedoptagelse (se figur 2).
  2. Anbring musen under billeddannelse mikroskop. Find den indsnævrede areal under 10X luft mål ved hjælp af epifluorescens og flytte det tyndeste område til midten af ​​visningen.
  3. Tilføj en dråbe saltvand på toppen af ​​kraniet og skifte til 60X mål, som er blevet skyllet med sterilt vand. Vælg en region, hvor de enkelte dendritiske Torner er tydeligt visualiseret langs dendritter. Identificere og mærke den tilsvarende region på kort 1 ved at sammenligne vaskulatur mellem epifluorescerende udsigt og karrene foto.
  4. Tune to-foton laserbølgelængde ifølge fluoroforer. For eksempel 920 nm for YFP; 890 nm for GFP; 1.000 nm til DsRed og tdTomato 24.
  5. Anskaf billedstakke med 2um trin langs z-aksen ved hjælp af 60X objektiv. Dette billede stack dækker en ca 200 um x 200 um område (512 x 512 pixel) og bruges som kort 2 for flytning under efterfølgende billedbehandling sessioner (se figur 2).
  6. Anskaf ni billedstakke indenfor kort 2 med 3x digital zoom. Hver billedstak dækker et omtrentligt område på 70 um x 70 um (512 x 512 pixels) med 0,7 um trin langs z-aksen Bemærk:. Intensiteten af laseren skal være under 40 mW, når der måles på prøver for at minimere fototoksicitet.

5.. Inddrivelse

  1. Efter billedbehandling, forsigtigt frigøre hovedet pladen fra kraniet.
  2. Renses grundigt kraniet og huden for at fjerne alle de resterende lim Note:. Eventuelle resterende lim på huden vil forårsage irritationer og bremse hud healing mens resterende lim på kraniet vil medføre erosion af kraniet og enngiogenesis i den nyligt vokset knogle lag, hvilket gør efterfølgende flytning og re-imaging vanskelig.
  3. Skyl kraniet og huden med saltvand flere gange.
  4. Suturere hovedbunden med steril kirurgisk sutur.
  5. Hold dyret på en varmepude i et separat bur. Administrere buprenorphin analgetikum (0,1 mg / kg) subkutant at afbøde postoperative smerter. Retur dyret til hjemmet bur efter fuld helbredelse. Overvåg dyret nøje (tjek mindst én gang dagligt), indtil snittet er helet, og suturer fjernes. Indgiv efterfølgende injektioner af buprenorphin smertestillende, hvis nødvendigt.

6.. Reimaging

  1. Gentag trin 1,1-1,8.
  2. Gentag trin 3,1-3,6
  3. Find tidligere afbildet region ved at sammenligne vaskulaturen mønster Kort 1 og dendritiske gren mønster til Kort 2.
  4. Hvis reimaging udføres inden for 1 uge, gentag trin 2.3 for at fjerne det tynde lag af nyligt vokset ben på toppen af ​​den indsnævrede region hjælp af mikrokirurgiske klingen. Hvis reimaging udføres efter mere end 1 uge, skal du gentage trin både 2.2 og 2.3 Bemærk:. Den nyligt vokset knogle lag består af et mindre kondenseret struktur i forhold til den oprindelige kompakte knogle lag, hvilket fører til reduceret billedkvalitet. Derfor, for at opnå samme kvalitet, er det nødvendigt at tynde kraniet lidt mere end den forrige billedbehandling session.
  5. Juster placering og orientering til at opnå billedstakke der matcher tidligere har taget billedstakke under to-foton mikroskop.
  6. Anskaf billeder som i trin 4.6.
  7. Gentag trin 5,1-5,5 efter billeddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I YFP-H linje mus 25, gul fluorescerende protein udtryk i en undergruppe af lag V pyramideneuroner, som rager deres apikale dendritter til de overfladiske lag i cortex. Gennem fremstillingen udtyndede kranium, kan fluorescensmærkede dendritiske segmenter repetitivt afbildet under to-foton mikroskop over forskellige billeddannende intervaller fra timer til måneder. Her viser vi et eksempel på en fire-time scanning af de samme dendritter over 8 dage i motor cortex af en 1 måned gamle mus, hvor individuelle pigge samt filopodia klart kan visualiseres langs dendritceller. Normalt dybde billedstakke er ca 100-200 um fra pial overflade. Forskellige analyser kan udføres på grundlag af disse billeder. For eksempel kan rygsøjlen dannelse, eliminering og omsætningen kvantificeres ved at sammenligne billeder fra forskellige sessioner. Spidsdensitet kan beregnes ved at dividere antallet af pigge ved længden af ​​dendritic segment. Ændringer i rygsøjlen motilitet og morfologi kan også analyseres.

Figur 1
Figur 1.. Custom-made immobiliseringstrin plader af forberedelse tyndet-kranium for to-foton in vivo billeddannelse. (A) Et fotografi af lederen plade, som er lavet af to eller tre barberblade limet sammen, med skarpe kanter er dækket af bånd. (B) Et fotografi af den bedrift plade, som består af 1 rustfri stålplade, 2 rustfrit stål blokke, 2 skruer og 2 afstandsstykker.

Figur 2
Figur 2. Transkranial to-foton billeddannelse gennem et præparat udtyndede kraniet hos mus motor cortex, in vivo billeder blev erhvervet. (B) En lav-forstørrelse maksimal projektion af dendritiske grene i den motoriske hjernebark af en 1 måned gammel mus (kort 2). (C) Gentagne billeder af det samme dendritiske segment afslører nydannede pigge (pilespidser), elimineret pigge (pile) og filopodia (stjerner) på dag 0, 2, 4 og 8. Den venstre panel er en højere forstørrelse billede af dendritiske segment er vist i det indrammede område i (B). Skalapanelerne: 500 m (A), 20 m (B) og 2 m (C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at opnå en succesfuld udtyndede kranium forberedelse, flere trin i denne protokol er afgørende. 1) Tykkelsen af ​​kraniet. Kranieknoglen har en sandwich struktur med to lag af high-density kompakt knogle og et midterlag af lav densitet svampet knogle. Mens høj hastighed mikro boret er velegnet til at fjerne de ydre lag af kompakt knogle og svampet knogle, det mikrokirurgiske bladet er ideel til udtynding det indre lag af kompakt knogle. Som tykkelsen og stivheden af ​​kraniet stiger under udvikling, billeddannelse af voksne mus kræver mere knogle, der skal fjernes for at opnå billeder af god kvalitet. Det indsnævrede område udviser en transparent fast udseende og giver god billedkvalitet, når tykkelsen af ​​kraniet er 20-30 um. Kraniet tykkelse skal kontrolleres regelmæssigt under udtynding proces som over-udtynding gør udtynding proces i efterfølgende reimaging sessioner vanskelig. 2) størrelsen af ​​det tyndet region.Det er vigtigt at etablere et stabilt udtyndede kranium konfiguration, hvor en kegle-lignende hulrum er opnået. Arkitekturen i fortyndet region med en ordentlig størrelse forhindrer forårsager skade på cortex og hjælper udtynding i efterfølgende re-imaging sessioner. Det anbefales at gøre det nederste område (ca. 200-300 um i diameter) af det indsnævrede område er mindre end den øverste åbning (ca. 0,5-1,0 mm i diameter). 3) Stabiliteten af ​​billederne. Et godt immobiliseret præparat hjælper med at forbedre billedkvaliteten ved at reducere luftvejs-induceret bevægelsesartefakter. Det er vigtigt at holde kraniet tør og fri for bindevæv og knogle rester før toppladen er fastgjort på kraniet. Ekstra lim kan også anvendes til at udfylde de resterende huller mellem toppladen og kraniet. Desuden målrettet et område væk fra store vaskulaturen også minimerer bevægelser forårsaget af blod til at pumpe.

Undersøgelse af ændringer i bhi af levende dyr med høj rumlig og tidsmæssig opløsning ved hjælp af to-foton mikroskopi kræver generering af et optisk vindue. Ud over udtyndede kranium forberedelse, kan fluorescens-mærkede strukturer også visualiseres ved at fjerne kraniet og erstatte det med et dækglas (normalt 3-5 mm i diameter), der giver en klar billedbehandling vindue 10, 13. Mens både udtyndede kranie og åbne kraniet imaging protokoller anvendes bredt til in vivo billeddiagnostiske undersøgelser, hver metode har sine egne fordele og er velegnet til forskellige eksperimentelle design. For eksempel forberedelse open kranium er nyttig til undersøgelser, der undersøger relativt store områder i hjernen (fx diameter 5 mm) og kræver mange billeddiagnostiske sessioner med korte intervaller (dvs. dage). Når kranie vinduet er succesfuldt implanteret, er der ingen yderligere kirurgi nødvendig. Dog er en post-kirurgi periode (normalt ca 1 måned), før den første billedbehandlingsession til forbedring potentielle inflammatoriske reaktioner forårsaget af kirurgi. Re-imaging bliver umuligt når kranie vindue er blokeret af genvækst af knogle-og / eller fortykkelse af meninges. I modsætning hertil kan dyr med en udtyndede kranium præparat skal afbildes umiddelbart efter den første operation, hvilket gør det mere egnet til kronisk billeddannelse af yngre dyr (f.eks, 2 uger). Den er velegnet til undersøgelse med lange billeddiagnostiske intervaller (dvs. måneder til år), da knoglen genvækst og dura fortykkelse er ikke problematisk. Dog er re-udtynding af kraniet normalt kræves til efterfølgende re-imaging sessioner (selv med 2 dages mellemrum) på grund af knoglen genvækst. Desuden nyligt vokset ben lag består af et mindre kondenseret struktur i forhold til den oprindelige kompakte knogle, hvilket reducerer gennemsigtigheden af ​​udtyndede kranium region. Derfor, for at opnå samme kvalitet af billeder, er det nødvendigt helt at fjerne den nyligt vokset knogle lag. Og en sådanttempts normalt fører til den endelige tykkelse af kraniet i den efterfølgende billedbehandling tyndere end den tidligere fremstilling. Da kraniet tykkelse var blevet forberedt til 20-30 um i den indledende imaging session, efterlader begrænset rum for re-udtynding, de samlede billeddiagnostiske tider af udtyndede kranium forberedelse er normalt mindre end 5 gange. For nylig en ny eksperimenterende tilgang opkaldt poleret og forstærket tyndet-kranium (porte) er udviklet til at kombinere begge tyndet-og open kranium præparater 11, 26, 27.

Hidtil har de fleste af in vivo-billeddannelse i cortex er blevet udført under anvendelse af transgene mus, der udtrykker EGFP eller YFP under neuronal specifik Thy1 promotor. Disse transgene mus udtrykker fluorescerende proteiner tyndt i en delmængde, men blandet population af corticalneuroner 25. Da mange linjer af beviser tyder på, at erfaring-afhængige strukturel plasticitet sker i selective celletyper veldefinerede kredsløb, er det vigtigt at mærke og billede i en celle-type-specifik måde. Til dato har mange metoder blevet anvendt til at opnå dette mål. For eksempel kan pyramideneuroner i forskellige kortikale lag målrettes ved at udføre i livmoderen elektroporation ved definerede fosterstadiet 28, 29. Tilsvarende kan injektion af virale vektorer gensplejset til at udtrykke et fluorescerende protein, også anvendes til at mærke celler i forskellige områder af hjernen 30. Desuden har mange linjer af transgene mus blevet genereret til at drive ekspressionen af Cre-rekombinase under celletype-specifikke promotorer 31, 32. Injektion af virale vektorer, såsom adeno-associeret virus bærende fluorescerende reporter gen efter en floxet stopkodon i disse mus giver mulighed for at opnå en bestemt klasse af neuroner i et begrænset område 33. Ved at kombinere disse nye mærkning tilgange med vores tyndet-sKull tilberedning kan ændringer i synaptiske forbindelser corticalneuroner undersøges af to-foton in vivo billeddannelse i en celletype-og / eller kredsløb-specifik måde.

Med den stigende tilgængelighed af transgene dyr med kan fluorescensmærkede cellepopulationer og hurtig udvikling af in vivo mærkningsteknikker lignende her beskrevne procedurer også anvendes til at undersøge andre celletyper (gliaceller), og vaskulaturen i den levende hjerne. Kombineret med adfærdsmæssige manipulationer og sygdomsmodeller, to-foton in vivo imaging høj grad vil udvide vores forståelse af de molekylære, cellulære og kredsløb mekanismerne bag hjernens funktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Vi takker James Perna for grafisk illustration. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute of Mental Health til YZ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Bioniche Pharma 67457-034-10 Mixed with xylazine for anesthesia
Xylazine Lloyd laboratories 139-236 Mixed with ketamine for anesthesia
Saline Hospira 0409-7983-09 0.9% NaCl for injection and imaging
Razor blades Electron microscopy sciences 72000 Double-edge stainless steel razor blades
Alcohol pads Fisher Scientific 06-669-62 Sterile alcohol prep pads
Eye ointment Henry Schein 102-9470 Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant
High-speed micro drill Fine Science Tools 18000-17 The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area
Micro drill steel burrs Fine Science Tools 19007-14 1.4 mm diameter
Microsurgical blade Surgistar 6961 The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone
Cyanoacrylate glue Fisher Scientific NC9062131 Fix the head plate onto the skull
Suture Havard Apparatus 510461 Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament
Dissecting microscope Olympus SZ61
CCD camera Infinity
Two-photon microscope Prairie Technologies Ultima IV
10X objective Olympus NA 0.30, air
60X objective Olympus NA 1.1, IR permeable, water immersion
Ti-sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  2. Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
  3. Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
  4. Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
  5. Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
  6. Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
  7. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
  8. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  9. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
  10. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
  11. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
  12. Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. (2012).
  13. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (2008).
  14. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
  15. Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
  16. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
  17. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
  18. Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
  19. Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
  20. Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
  21. Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
  22. Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. (2010).
  23. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. (2010).
  24. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  25. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  26. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. (2012).
  27. Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. (2012).
  28. Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (2012).
  29. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
  30. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (2010).
  31. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  32. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
  33. Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics