To-Photon
1Department of Molecular Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yu, X., Zuo, Y. Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation. J. Vis. Exp. (87), e51520, doi:10.3791/51520 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I pattedyr cortex, nevroner danner ekstremt kompliserte nettverk og utveksle informasjon ved synapser. Endringer i synaptisk styrke, samt addisjon / fjerning av synapser, forekommer i en opplevelse avhengig måte, og gir den strukturelle grunnlag av nevronal plastisitet. Som postsynaptiske komponenter av de eksitatoriske synapser i cortex, er dendrittutløperne anses å være en god proxy av synapser. Tar fordelene med mus genetikk og fluorescerende merking teknikker, enkelte nerveceller og deres synaptiske strukturer kan merkes i den intakte hjerne. Her introduserer vi en transkranial avbildning protokollen ved hjelp av to-foton laserskanning mikros å følge fluorescensmerkede postsynaptiske dendrittutløperne over tid i vivo. Denne protokoll benytter en tynnet-skallen preparat, som holder hodeskallen intakt og unngår inflammatoriske effekter forårsaket av eksponering i hjernehinnene, og cortex. Derfor kan bildene bli utført umiddelbart etter s.rgery utføres. Den eksperimentelle fremgangsmåten kan utføres gjentatte ganger over forskjellige tidsintervaller som spenner fra timer til år. Anvendelsen av dette preparatet kan også utvides til å undersøke ulike kortikale regioner og lag, så vel som andre celletyper, under fysiologiske og patologiske tilstander.

Introduction

Pattedyr cortex deltar i mange hjernefunksjoner, fra sanseinntrykk og bevegelseskontroll til abstrakt informasjonsbehandling og kognisjon. Ulike kortikale funksjoner bygger på ulike nevrale kretser, som er laget av forskjellige typer nevroner som kommuniserer og utveksler informasjon på enkelte synapser. Struktur og funksjon av synapser er konsekvent blir endret som følge av erfaringer og patologi. I den modne hjernen, tar synaptisk plastisitet form av både styrke endringer og tillegg / fjerning av synapser, som spiller en viktig rolle i dannelsen og opprettholdelsen av en funksjonell nevrale kretser. Dendrittutløperne er de postsynaptiske komponenter i de fleste eksitatoriske synapser i hjernen hos pattedyr. Den konstante omsetning og morfologiske endringer av pigger er antatt å fungere som en god indikator for endringer i synaptiske forbindelser 1-7.

To-foton laserskanning microscopy tilbyr dyp penetrasjon gjennom tykk, ugjennomsiktig forberedelser og lav fototoksisitet, noe som gjør den egnet for live bildebehandling i den intakte hjerne åtte. I kombinasjon med fluorescerende merking, gir to-foton bildebehandling et kraftig verktøy for å kikke inn den levende hjernen og følg strukturell omorganisering ved enkelte synapser med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Ulike metoder har blitt brukt til å forberede mus for live bildebehandling 9-13. Her beskriver vi en tynnet-skalle utarbeidelse av in vivo to-foton imaging å undersøke strukturelle plastisitet av postsynaptiske dendrittutløperne i muse cortex. Ved hjelp av denne tilnærmingen, har våre nyere studier avbildet et dynamisk bilde av dendrittiske ryggraden endringer i respons til motoriske læring Med økende tilgjengelighet av transgene dyr med fluorescensmerkede nevronale undergrupper og rask utvikling av in vivo merking teknikker, kan lignende prosedyrer som er beskrevet her også brukes til etterforskningte andre celletyper og kortikale regioner, kombinert med andre manipulasjoner, så vel som benyttes ved sykdomsmodeller 16-23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Godkjenning må hentes fra hjemmeinstitusjoner før oppstart av kirurgi og avbildning studie. Eksperimenter er beskrevet i dette manuskriptet ble utført i samsvar med de retningslinjer og forskrifter fra University of California, Santa Cruz Institutional Animal Care og bruk komité.

En. Kirurgi

  1. Autoklaver alle kirurgiske instrumenter og sterilisere arbeidsområdet med 70% alkohol grundig før operasjonen.
  2. Anesthetize mus ved intraperitoneal (IP) injeksjon av KX anestesi-løsning (200 mg / kg ketamin og 20 mg / kg xylazin) i henhold til musekroppsvekt. Merknad: KX dosen kan justeres i forhold til belastningen, alder og helsetilstand på mus. Veterinær konsultasjon for å fastslå den optimale dosen er også anbefalt.
  3. Utfør en tå-pinch test med jevne mellomrom ved å trykke på musens tær og sjekker for en refleksiv reaksjon å overvåke anestesi status.Kontroller at musen er fullt bedøvet før operasjonen. Merk: Under langvarig bildebehandling økter, sjekk musens anestesi status med jevne mellomrom, administrere ekstra KX om nødvendig.
  4. Plasser musen på en varmepute for å opprettholde kroppstemperaturen i løpet av operasjonen.
  5. Barbere hodet av musen med et barberblad for å utsette hodebunnen.
  6. Steril det barberte området ved å tørke huden med vekslende alkohol pads og betadine. Fjern eventuelle gjenværende hår gresset.
  7. Anvende forsiktig øyesalve å smøre begge øyne, således hindre permanent skade forårsaket av dehydrering under forsøket.
  8. Foreta en rett snitt langs midtlinjen av hodebunnen, og flytte huden sideveis mot kantene av skallen.
  9. Fjern bindevev festet til skallen.

2. Tynnet-skalle Forberedelse

  1. Identifiser bildebehandling regionen basert på ster. eotaxic koordinater Merk: Prøv å unngå store blodkar, som blokk lys penetrasjon og visker ut fotografert strukturer. Blodkar er best observert når skallen er fuktig med sterilt saltvann.
  2. Bruk høy hastighet mikro drill til tynn en sirkulær region av skallen (mm diameter 0.5-1.0). Beveg bore parallelt til skallen overflaten, i stedet for å holde den mot hodeskallen og trykker ned. Drill til både det ytre kompakt bein lag og midt svampaktig bein lag er fjernet. Merk: For å unngå skader som følge av overoppheting, unngå langvarig kontakt mellom borekronen og skallen.
  3. Fortsett tynning den indre kompakte benet lag med en mikrokirurgisk kniv i sentrum av bore-tynnet region. Hold mikro bladet i en vinkel på omtrent 45 ° for å skrape skallen uten å trykke ned mot hodeskallen til en jevnt tynnet liten region (200 til 300 mikrometer i diameter) med en tykkelse på tilnærmetly 20-30 mikrometer er oppnådd. På grunn av den auto-fluorescens av skallen, kan tykkelsen måles ved scanning av avstanden mellom øvre og nedre flate av hodeskallen i henhold til to-foton mikroskop. Merk: selv om en hodeskalle tykkelse på mindre enn 20 mikrometer gir god bildekvalitet, det anbefales ikke fordi det gjør tynning prosessen i påfølgende re-imaging-økter vanskelig. For å unngå over-tynning, må tykkelsen til skallen for å bli kontrollert regelmessig under operasjonen (se diskusjon).

Tre. Immobilization

  1. Fjern forsiktig ben rusk.
  2. Plasser en liten dråpe av cyanoakrylat-lim på hver kant av midtåpningen i den sterile hodeplate, som har blitt autoklavert (se figur 1). Hold hodeplaten tett mot hodeskallen med tynnet region plassert i midten av åpningen. Merk: Hvis limet forurenser tynnet region ved et uhell, fjerner du det forsiktig med mikrokirurgisk blad.
  3. Trekk forsiktig huden fra sidene av skallen til kantene av midtåpningen av hodeplaten.
  4. Vent i ca 10 minutter inntil hodeplaten er godt festet til skallen.
  5. Plasser hodet plate på to laterale blokker av holdeplaten og stram skruene over kanten av hodet plate å immobilisere musen på holdeplaten (se figur 1). Merk: Pass på at det ikke er hud eller værhår mellom hodet plate og blokkene før du strammer skruene. Et godt immobilisert preparat bør vise noen observerbar bevegelse av hodet under disseksjonsmikroskop når ryggen av dyret blir forsiktig klappet.
  6. . Skyll eksponert skallen med saltvann for å fjerne upolymerisert lim Merk: Det er viktig å fjerne eventuelle gjenværende lim, som upolymerisert lim tåkelegger bilder og skader mikroskop mål <./ Li>

4. Imaging

  1. Ta et bilde av blodkar av den eksponerte skallen med tynnet region som kart 1, som brukes til å flytte avbildes regionen i senere bildebehandling økter (se figur 2).
  2. Plasser musen under bildebehandling mikroskop. Finn tynnet området under en 10X luft objektiv bruker epifluorescence og flytte den tynneste området til sentrum av visningen.
  3. Tilsett en dråpe saltvann på toppen av skallen og bytte til 60X objektiv, som er blitt skylt med sterilt vann. Velg en region der enkelt dendrittutløperne er tydelig visualisert sammen dendritter. Identifisere og merke den tilsvarende regionen i kart en ved å sammenligne blodkar mellom epifluorescent utsikt og blodkar bilde.
  4. Tune i to-foton laserbølgelengden i henhold til fluoroforer. For eksempel, 920 nm for YFP; 890 nm for GFP; 1000 nm for DsRed og tdTomato 24.
  5. Acquire bildestakker med 2mikrometer skritt langs z-aksen ved å bruke 60X objektiv. Denne bildestabelen dekker et tilnærmet 200 um x 200 um-området (512 x 512 piksler) og blir brukt som kart 2 for flytting under påfølgende avbildning sesjoner (se figur 2).
  6. Erverve ni bildestakker innenfor kart 2 bruker 3x digital zoom. Hvert bildestabelen dekker et tilnærmet område på 70 um x 70 um (512 x 512 piksler), med 0,7 mikrometer skritt langs z-aksen. Merknad: Intensiteten av laseren bør være under 40 mW når målt ved prøver å minimalisere fototoksisitet.

5. Recovery

  1. Etter bildebehandling, forsiktig løsne hodet plate fra skallen.
  2. Rense skallen og huden for å fjerne all gjenværende lim grundig Obs. Eventuelle gjenværende lim på huden vil føre til irritasjoner og tregere hud healing mens eventuelle gjenværende lim på hodeskallen vil føre til erosjon av skallen og enngiogenesis i den nylig vokst bein lag, noe som gjør senere flytting og re-imaging vanskelig.
  3. Skyll skallen og huden med saltvann flere ganger.
  4. Sutur hodebunnen med steril kirurgisk sutur.
  5. Hold dyret på en varmepute i et eget bur. Administrere buprenorfin analgetisk (0,1 mg / kg) subkutant for å redusere postoperativ smerte. Returner dyret til hjemmet buret etter full gjenoppretting. Overvåk dyret nøye (sjekk minst en gang daglig) til snittet er helbredet og Stingene fjernes. Administrer påfølgende injeksjoner av buprenorfin analgetikum ved behov.

6. Reimaging

  1. Gjenta trinn 01.01 til 01.08.
  2. Gjenta trinn 03.01 til 03.06
  3. Finn tidligere fotografert regionen ved å sammenligne blodkar mønster til Kart 1 og dendrittiske grenen mønster til Kart to.
  4. Hvis reimaging utføres innen en uke, gjenta trinn 2.3 for å fjerne det tynne laget av nylig dyrket ben på toppen av fortynnet region bruker mikro bladet. Hvis reimaging utføres etter mer enn en uke, gjenta trinn både 2,2 og 2,3. Merk: Den nylig vokst bein laget består av en mindre kondensert struktur i forhold til den opprinnelige kompakt bein lag, som fører til redusert bildekvalitet. Derfor, for å tilegne seg den samme kvalitet, er det nødvendig å tynne skallen litt mer enn den forrige bildebehandling økten.
  5. Juster posisjonen og retningen for å få bildestakker som matche tidligere tatt bildestakker under to-foton mikroskop.
  6. Hente bilder som i trinn 4.6.
  7. Gjenta trinn 5,1-5,5 etter bildebehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I YFP-H linjen mus 25, uttrykker gul fluoriserende protein i en undergruppe av lag V pyramidale nevroner, som stikker sine apikale dendritter til de overfladiske lag i cortex. Gjennom tynnet-skallen preparat, kan de fluorescensmerkede dendrittiske segmenter bli gjentatte ganger avbildes i henhold til to-foton mikroskop over forskjellige bildeintervaller, alt fra timer til måneder. Her viser vi et eksempel på en firetids avbildning av de samme dendritter mer enn 8 dager i motor cortex av en 1 måned gamle mus, hvor de enkelte pigger samt filopodia klart kan visualiseres langs dendrite. Vanligvis, er dybden av bildestakker omtrent 100-200 mikrometer fra pial overflate. Ulike analyser kan bli utført på grunnlag av disse bildene. For eksempel, kan ryggraden formasjon, eliminering og omsetning kvantifiseres ved å sammenligne bilder fra ulike øktene. Spine densitet kan beregnes ved å dele antall pigger av lengden av dendritic segmentet. Endringer av ryggraden motilitet og morfologi kan også bli analysert.

Figur 1
Figur 1. Skreddersydde immobilisering plater av tynnet-skallen forberedelse til to-foton in vivo avbildning. (A) Et fotografi av hodeplaten, som består av to eller tre barberblad limt sammen, med skarpe kanter er dekket av bånd. (B) Et fotografi av holdeplaten, som består av en rustfri plate, to rustfrie blokker, to skruer og to avstandsstykker.

Fig. 2
Figur 2. Transkranial to-foton bildebehandling gjennom en tynnet-skallen forberedelse i musen motor cortex, in vivo bildene ble anskaffet. (B) En lav forstørrelse maksimal projeksjon av dendrittiske grener i motor cortex av en 1 måned gamle mus (Kort 2). (C) Gjentatte bilder av samme dendrittiske segment avsløre nydannede pigger (pilspisser), elimineres pigger (piler), og filopodia (stjerner) på dag 0, 2, 4 og 8. Den venstre panel er en høyere forstørrelse utsikt dendrittiske segmentet vist i eske-regionen i (B). Skalalinjer: 500 mikrometer (A), 20 mikrometer (B) og 2 mikrometer (C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å få et vellykket tynnet-skallen forberedelse, flere trinn i denne protokollen er avgjørende. 1) Tykkelsen av skallen. Den kraniebenet har en sandwichkonstruksjon, med to lag av høy tetthet kompakt ben og et midtre lag av lav-densitet svampaktig ben. Mens høyhastighets mikrobore er egnet for å fjerne de ytre lag av kompakt ben og svampaktig ben, er den mikroblad ideell for tynning det indre laget av kompakt ben. Etter hvert som tykkelsen og stivheten av skallen øker under utvikling, avbildning av voksne mus trenger flere ben som skal fjernes for å oppnå bilder av god kvalitet. Den tynnet område oppviser et transparent fast utseende og gir god bildekvalitet når tykkelsen av skallen er omtrent 20 til 30 mikrometer. Skallen tykkelse bør sjekkes med jevne mellomrom i løpet av tynning prosessen som over-tynning gjør tynning prosessen i senere reimaging økter vanskelig. 2) Størrelsen av tynnet regionen.Det er viktig å etablere en stabil tynnet-skallen konfigurasjon, hvor en kjegle-lignende hulrom er oppnådd. Arkitekturen av tynnet regionen med en skikkelig størrelse hindrer forårsaker skade på cortex og hjelper tynning i påfølgende re-imaging-økter. Det anbefales å foreta bunnområdet (ca. 200 til 300 mikrometer i diameter) av den tynnet område som er mindre enn toppåpningen (ca. 0,5 til 1,0 mm i diameter). 3) Stabiliteten av bildene. En godt immobilisert forberedelser bidrar til å forbedre bildekvaliteten ved å redusere luftveis-indusert bevegelse gjenstander. Det er viktig å holde skallen tørr og fri for bindevev og ben avfall før hodeplaten er festet til skallen. Ekstra lim kan også anvendes for å fylle de gjenværende åpninger mellom hodeplaten og hodeskallen. I tillegg rettet mot et område vekk fra store blodkar minimerer også bevegelser forårsaket av blodet pumpe.

Gransking av endringene i BHi av levende dyr med høy romlig og tidsmessig oppløsning ved hjelp av to-foton mikroskopi krever generasjon av en optisk vindu. I tillegg til tynnet-skallen preparat, kan fluorescensmerkede strukturer også visualiseres ved å fjerne skallen og erstatte det med et dekkglass (vanligvis 3-5 mm i diameter), som gir en klar avbildning vindu 10, 13. Mens både tynnet-skallen og open-skallen bildebehandling regimer kan benyttes bredt for in vivo imaging studier, har hver metode sine egne fordeler og er egnet for ulike eksperimentelle design. For eksempel er det åpen-skallen forberedelse nyttig for studier som undersøker relativt store hjerneområder (f.eks, 5 mm diameter), og krever mange bildebehandlings økter med korte intervaller (dvs. dager). Når kranie vinduet er vellykket implantert, er ingen ytterligere kirurgi er nødvendig. Imidlertid er en post-kirurgi periode (vanligvis omtrent 1 måned) kreves før det første bildedannendesesjon for å bøte potensielle inflammatoriske responser forårsaket av kirurgi. Re-imaging blir umulig når kranie vindu er blokkert av gjenvekst av bein og / eller fortykkelse av hjernehinnene. I kontrast, kan dyr med en tynnet-skallen forberedelse bli fotografert umiddelbart etter den første operasjonen, noe som gjør den mer egnet for kronisk avbildning av yngre dyr (for eksempel to uker gamle). Den er egnet for undersøkelse med lange bilde intervaller (dvs. måneder til år), som bein gjenvekst og dura jevning er ikke problematisk. Imidlertid er re-tynning av skallen vanligvis nødvendig for etterfølgende re-avbildnings sesjoner (selv med 2 dagers intervaller) på grunn av benet gjenvekst. Videre består den nylig vokst bein laget av en mindre kondensert struktur i forhold til den opprinnelige kompakt bein, noe som reduserer gjennomsiktigheten av tynnet-skallen regionen. Derfor, for å skaffe den samme kvaliteten av bilder, er det nødvendig å fjerne den nylig dyrket benet lag. Og en slikttempts vanligvis føre til den endelige tykkelse av hodeskallen i den etterfølgende bildebehandling tynnere enn den foregående preparat. Siden skallen tykkelse hadde blitt forberedt til 20-30 mikrometer i den innledende bildebehandling økten, slik begrenset rom for re-tynning, er de totale bildebehandlings tider med tynnet-skallen forberedelse vanligvis mindre enn 5 ganger. Nylig, en ny eksperimentell tilnærming heter polert og forsterket tynnet-skalle (porter) er utviklet for å kombinere både tynnet-og open-skallen forberedelser 11, 26, 27.

Så langt har de fleste av in vivo avbildning i cortex blitt utført ved hjelp av transgene mus linjer uttrykker EGFP eller YFP henhold neuronal spesifikke thy1 promoter. Disse transgene mus uttrykke fluorescerende proteiner tynt i en undergruppe, men blandet befolkning av kortikale nevroner 25. Siden mange linjer av bevis tyder på at erfaring avhengige strukturell plastisitet skjer i Selective celletyper av veldefinerte kretser, er det viktig å merke og bilde i en celle-typespesifikk måte. Hittil har mange tilnærminger blitt brukt for å oppnå dette målet. For eksempel kan pyramidale nevroner i ulike kortikale lag være målrettet ved å utføre in utero electroporation ved definerte embryonale stadier 28, 29. På samme måte kan injeksjon av virale vektorer konstruert for å uttrykke et fluorescerende protein også bli brukt til å merke celler i forskjellige områder av hjernen 30. I tillegg har mange linjer av transgene mus som er generert for å drive ekspresjonen av Cre rekombinase henhold celletypespesifikke promotorer 31, 32.. Injeksjon av virale vektorer som adeno-assosiert virus bærer fluorescerende reporter-genet etter en floxed stoppkodon inn i disse musene tilbyr muligheten for å oppnå en spesifisert klasse av neuroner i et begrenset område 33.. Ved å kombinere disse nye merkingen tilnærminger med vår tynnet-skull preparat, kan endringer i synaptiske forbindelser i kortikale neuroner bli undersøkt av to-foton in vivo avbildning i en celletype-og / eller krets-spesifikk måte.

Med den økende tilgjengelighet av transgene dyr med fluorescensmerkede cellepopulasjoner og rask utvikling av in vivo merkingsteknikker, lignende fremgangsmåter som er beskrevet her kan også anvendes for å undersøke andre celletyper (glial-celler) og blodkar i levende hjerne. Kombinert med atferds manipulasjoner og sykdomsmodeller, to-foton in vivo avbildning vil i stor grad utvide vår forståelse av de molekylære, cellulære, og krets mekanismene bak hjernens funksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Vi takker James Perna for den grafiske illustrasjonen. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institute of Mental Health til YZ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Bioniche Pharma 67457-034-10 Mixed with xylazine for anesthesia
Xylazine Lloyd laboratories 139-236 Mixed with ketamine for anesthesia
Saline Hospira 0409-7983-09 0.9% NaCl for injection and imaging
Razor blades Electron microscopy sciences 72000 Double-edge stainless steel razor blades
Alcohol pads Fisher Scientific 06-669-62 Sterile alcohol prep pads
Eye ointment Henry Schein 102-9470 Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant
High-speed micro drill Fine Science Tools 18000-17 The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area
Micro drill steel burrs Fine Science Tools 19007-14 1.4 mm diameter
Microsurgical blade Surgistar 6961 The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone
Cyanoacrylate glue Fisher Scientific NC9062131 Fix the head plate onto the skull
Suture Havard Apparatus 510461 Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament
Dissecting microscope Olympus SZ61
CCD camera Infinity
Two-photon microscope Prairie Technologies Ultima IV
10X objective Olympus NA 0.30, air
60X objective Olympus NA 1.1, IR permeable, water immersion
Ti-sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  2. Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
  3. Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
  4. Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
  5. Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
  6. Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
  7. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
  8. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  9. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
  10. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
  11. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
  12. Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. (2012).
  13. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (2008).
  14. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
  15. Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
  16. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
  17. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
  18. Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
  19. Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
  20. Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
  21. Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
  22. Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. (2010).
  23. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. (2010).
  24. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  25. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  26. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. (2012).
  27. Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. (2012).
  28. Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (2012).
  29. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
  30. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (2010).
  31. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  32. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
  33. Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics