Two-Photon
1Department of Molecular Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

Neuroscience

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Yu, X., Zuo, Y. Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation. J. Vis. Exp. (87), e51520, doi:10.3791/51520 (2014).

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Abstract

Nella corteccia dei mammiferi, i neuroni formano reti estremamente complicate e scambiare informazioni a livello delle sinapsi. I cambiamenti della concentrazione sinaptica, nonché aggiunta / rimozione di sinapsi, si verificano in modo dipendente dall'esperienza, fornendo la base strutturale di plasticità neuronale. Come componenti postsinaptici delle sinapsi più eccitatori nella corteccia, spine dendritiche sono considerati un buon indicatore di sinapsi. Prendendo vantaggi della genetica del topo e tecniche di etichettatura fluorescenti, i singoli neuroni e le loro strutture sinaptiche possono essere etichettati nel cervello intatto. Qui vi presentiamo un protocollo di imaging transcranica con due fotoni microscopia a scansione laser per seguire fluorescente post-sinaptici spine dendritiche nel tempo in vivo. Questo protocollo utilizza un preparato assottigliato-teschio, che mantiene il cranio intatto ed evita effetti infiammatori provocati dall'esposizione delle meningi e la corteccia. Pertanto, le immagini possono essere acquisite subito dopo suviene eseguita rgery. La procedura sperimentale può essere eseguita ripetutamente su vari intervalli temporali da ore ad anni. L'applicazione di questa preparazione può anche essere esteso per indagare diverse regioni corticali e strati, così come altri tipi di cellule, in condizioni fisiologiche e patologiche.

Introduction

La corteccia dei mammiferi partecipa a molte funzioni cerebrali, dalla percezione e il controllo del movimento per l'elaborazione delle informazioni sensoriali astratta e cognizione. Varie funzioni corticali si basano sui diversi circuiti neurali, che sono costituiti da diversi tipi di neuroni che comunicano e scambiano informazioni su singole sinapsi. La struttura e la funzione delle sinapsi sono costantemente in corso di modifica in risposta alle esperienze e patologie. Nel cervello maturo, la plasticità sinaptica assume la forma di entrambe le modifiche di forza e l'aggiunta / rimozione di sinapsi, che giocano un ruolo importante nella formazione e il mantenimento di un circuito neurale funzionale. Spine dendritiche sono le componenti postsinaptici della maggioranza delle sinapsi eccitatorie nel cervello dei mammiferi. Il fatturato costante e le variazioni morfologiche delle spine si crede per servire come un buon indicatore di modifiche nelle connessioni sinaptiche 1-7.

Due fotoni scansione laser microscopia offre penetrazione profonda attraverso fitti, preparati opachi e bassa fototossicità, che lo rende adatto per l'imaging dal vivo nel cervello intatto 8. In combinazione con marcatura fluorescente, imaging a due fotoni fornisce un potente strumento per sbirciare nel cervello vivente e seguire riorganizzazione strutturale a livello delle sinapsi individuali con alta risoluzione temporale e spaziale. Vari metodi sono stati utilizzati per preparare topi per l'imaging dal vivo 9-13. Qui, descriviamo un preparato assottigliato-teschio in vivo di due fotoni imaging per studiare la plasticità strutturale postsinaptici spine dendritiche nella corteccia mouse. Usando questo approccio, i nostri studi recenti hanno rappresentato un quadro dinamico di cambiamenti spine dendritiche in risposta alle abilità motoria imparando Con la crescente disponibilità di animali transgenici con sottoinsiemi di neuroni fluorescente e rapido sviluppo di vivo tecniche in materia di etichettatura, procedure analoghe qui descritti possono essere applicati anche di indaginete altri tipi cellulari e regioni corticali, in combinazione con altre manipolazioni, così come utilizzato in modelli di malattia 16-23.

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Protocol

Approvazione deve essere ottenuto da istituti d'origine prima dell'inizio della chirurgia e studio di imaging. Esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti della University of California, Santa Cruz Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa.

1. Chirurgia

  1. Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e sterilizzare l'area di lavoro con il 70% di alcol accuratamente prima di un intervento chirurgico.
  2. Anestetizzare il mouse intraperitoneale (IP) iniezione di soluzione anestetica KX (200 mg / ketamina kg e 20 mg / kg xilazina) in base al peso corporeo del topo. Nota: KX dosaggio può essere regolato a seconda del ceppo, età e lo stato di salute dei topi. Si raccomanda inoltre la consultazione veterinario per determinare la dose ottimale.
  3. Eseguire un test toe-pinch periodicamente premendo le dita dei piedi del topo e di controllo per una risposta riflessiva per monitorare lo stato di anestesia.Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato prima di iniziare l'intervento. Nota: Durante le sessioni di imaging prolungati, controllare lo stato di anestesia del topo periodicamente, amministrare ulteriore KX, se necessario.
  4. Posizionare il mouse su una piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico.
  5. Radere la testa del mouse usando una lama di rasoio per esporre il cuoio capelluto.
  6. Sterilizzare l'area rasata pulendo la pelle con alternanza di tamponi imbevuti di alcool e Betadine. Rimuovere eventuali ritagli di capelli residui.
  7. Applicare delicatamente unguento occhio per lubrificare entrambi gli occhi, impedendo quindi danni permanenti causati dalla disidratazione durante l'esperimento.
  8. Effettuare una incisione retta lungo la linea mediana del cuoio capelluto, e spostare la pelle lateralmente verso i bordi del cranio.
  9. Rimuovere il tessuto connettivo attaccato al cranio.

2. Diluito cranio-Preparazione

  1. Identificare la regione di imaging basato su ster. coordinate eotaxic Nota: Cercate di evitare grandi vasi sanguigni, che la penetrazione della luce di blocco e sfocare le strutture imaged. Vascolare è meglio osservata quando il cranio è umido con soluzione salina sterile.
  2. Utilizzare il micro drill ad alta velocità per assottigliare una regione circolare del cranio (diametro 0,5-1,0 mm). Spostare il trapano parallelo alla superficie del cranio, piuttosto che tenendolo contro il cranio e premendo verso il basso. Drill fino a quando sia lo strato di osso compatto esterno e lo strato di osso spugnoso centrale vengono rimossi. Nota: Per prevenire i danni causati da surriscaldamento, evitare il contatto prolungato tra la punta e il cranio.
  3. Continua assottigliamento dello strato di osso compatto interno con una lama microchirurgico nel centro della regione drill-assottigliato. Tenere la lama microchirurgico ad un angolo di circa 45 ° per raschiare il cranio senza premere contro il cranio finché un uniformemente diluiti piccola regione (200-300 micron di diametro) con uno spessore di approssimativaly 20-30 micron si ottiene. A causa della auto-fluorescenza del cranio, lo spessore può essere misurata attraverso la scansione la distanza tra la superficie superiore e inferiore del cranio sotto il microscopio a due fotoni. Nota: sebbene uno spessore cranio di meno di 20 micron fornisce una buona qualità delle immagini, non è consigliabile perché rende il processo di diradamento in sessioni di re-imaging successive difficile. Per evitare un eccessivo diradamento, lo spessore del cranio deve essere controllata periodicamente durante l'intervento chirurgico (vedi Discussione).

3. Immobilizzazione

  1. Rimuovere con cautela detriti ossei.
  2. Mettere una piccola goccia di colla cianoacrilato su ciascun bordo dell'apertura centro della piastra di testa sterile, che è stato autoclavato (vedi Figura 1). Tenere la piastra di testa saldamente contro il cranio con la regione assottigliata situato nel centro dell'apertura. Nota: Se la colla contamina il r assottigliataEgion per caso, rimuoverlo delicatamente con la lama microchirurgico.
  3. Estrarre delicatamente la pelle dai lati del cranio ai bordi dell'apertura centro della piastra di testa.
  4. Attendere circa 10 minuti finché la piastra di testa è ben attaccato al cranio.
  5. Posizionare la piastra di testa su due blocchi laterali della piastra di supporto e poi stringere le viti sui bordi della piastra di testa per immobilizzare il mouse sulla piastra di supporto (vedi Figura 1). Nota: Assicurarsi che non ci sia pelle o baffi tra la piastra di testa e blocchi prima di stringere le viti. Una buona preparazione immobilizzato dovrebbe mostrare alcun movimento osservabile del cranio al microscopio da dissezione quando la parte posteriore dell'animale viene accarezzò delicatamente.
  6. . Sciacquare il cranio esposto con soluzione fisiologica per rimuovere la colla non polimerizzato Nota: è importante per rimuovere eventuali residui di colla, come collante non polimerizzato offusca le immagini ei danni microscopio obiettivi <./ Li>

4. Imaging

  1. Prendere una foto del sistema vascolare del cranio esposta con la regione diluito mappa 1, che viene utilizzato per spostare la regione ripreso in sessioni di imaging successive (vedi Figura 2).
  2. Posizionare il mouse sotto il microscopio imaging. Individuare la zona assottigliata sotto un obiettivo 10X aria usando epifluorescenza e spostare l'area più sottile al centro della vista.
  3. Aggiungere una goccia di soluzione salina sulla sommità del cranio e passare alla obiettivo 60X, sciacquato con acqua sterile. Seleziona una regione in cui le singole spine dendritiche sono chiaramente visualizzate lungo dendriti. Identificare ed etichettare la regione corrispondente Mappa 1 confrontando vascolare tra la vista epifluorescente e la foto vascolare.
  4. Sintonizzare la lunghezza d'onda del laser a due fotoni secondo i fluorofori. Per esempio, 920 nm per YFP; 890 nm per GFP; 1.000 nm per DsRed e tdTomato 24.
  5. Acquisire pile di immagine con 2passi micron lungo l'asse z usando l'obiettivo 60X. Questo stack immagine copre circa 200 micron x 200 micron zona (512 x 512 pixel) e viene utilizzato come cartina 2 per trasferimento durante sessioni di imaging successive (vedi Figura 2).
  6. Acquisire nove stack di immagini all'interno Map 2 utilizzando lo zoom digitale 3X. Ogni stack immagine copre una superficie di circa 70 micron x 70 micron (512 x 512 pixel), con 0,7 micron passi lungo l'asse z. Nota: L'intensità del laser deve essere inferiore a 40 mW quando misurato a campioni di minimizzare fototossicità.

5. Recovery

  1. A seguito di imaging, staccare delicatamente la piastra di testa dal cranio.
  2. Pulire accuratamente il cranio e la pelle per rimuovere tutti i residui di colla. Nota: Qualsiasi residuo di colla sulla pelle provoca irritazioni e rallentare la guarigione della pelle mentre l'eventuale residuo di colla sul cranio causerà l'erosione del cranio e di unngiogenesis nello strato osso appena cresciuti, rendendo il successivo riposizionamento e re-imaging difficile.
  3. Sciacquare il cranio e la pelle con saline diverse volte.
  4. Suturare il cuoio capelluto con sterile sutura chirurgica.
  5. Tenere l'animale su una piastra elettrica in una gabbia separata. Somministrare buprenorfina analgesico (0,1 mg / kg) per via sottocutanea per attenuare il dolore post-operatorio. Rispedire l'animale verso la gabbia a casa dopo il pieno recupero. Monitorare l'animale da vicino (controllare almeno una volta al giorno) fino a quando l'incisione è guarita e punti di sutura vengono rimossi. Somministrare successive iniezioni di buprenorfina analgesico, se necessario.

6. Re-imaging

  1. Ripetere i passaggi 1,1-1,8.
  2. Ripetere i passaggi 3,1-3,6
  3. Individuare regione già ripreso confrontando il pattern vascolare di Mappa 1 e il ramo modello dendritiche a Mappa 2.
  4. Se reimaging viene effettuata entro 1 settimana, ripetere il passo 2.3 per rimuovere lo strato sottile di osso appena cresciuti in cima al re assottigliataregione con la lama microchirurgico. Se reimaging viene eseguita dopo più di 1 settimana, ripetere i passaggi sia 2.2 e 2.3. Nota: Lo strato osseo appena cresciuti costituito da una struttura meno condensata rispetto al livello originale osso compatto, con conseguente riduzione della qualità dell'immagine. Pertanto, per acquisire la stessa qualità, è necessario sottile cranio leggermente superiore alla precedente sessione di imaging.
  5. Regolare la posizione e l'orientamento di ottenere pile di immagini con parametro precedentemente presi stack di immagini al microscopio a due fotoni.
  6. Acquisire le immagini come al punto 4.6.
  7. Ripetere i passaggi 5,1-5,5 dopo imaging.

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Representative Results

In YFP-H topi linea 25, proteina fluorescente gialla esprime in un sottoinsieme di neuroni piramidali strato V, che proiettano loro dendriti apicali agli strati superficiali della corteccia. Attraverso la preparazione assottigliato-teschio, i segmenti dendritiche fluorescente possono essere ripetutamente ripreso sotto il microscopio a due fotoni su vari intervalli di imaging, che vanno da ore a mesi. Qui mostriamo un esempio di rappresentazione quattro volte le stesse dendriti oltre 8 giorni in corteccia motoria di un mouse 1 mesi di età, dove spine individuali così come filopodi possono essere visualizzati chiaramente lungo il dendrite. Di solito, la profondità di stack di immagini è di circa 100-200 micron dalla superficie piale. Varie analisi possono essere effettuate sulla base di queste immagini. Per esempio, la formazione delle spine, eliminazione e fatturato possono essere quantificati confrontando immagini da diverse sessioni. Densità delle spine può essere calcolato dividendo il numero di spine per la lunghezza del Dendritsegmento ic. Modifiche di colonna vertebrale motilità e morfologia possono anche essere analizzati.

Figura 1
Figura 1. Lastre di immobilizzazione su misura di preparazione diluito-skull per due fotoni imaging in vivo. (A) Una fotografia della piastra della testa, che è fatta di due o tre lame di rasoio incollati insieme, con spigoli vivi coperti da nastri. (B) Una fotografia della piastra di supporto, che si compone di 1 piastra in acciaio inox, blocchi di 2 in acciaio inox, 2 viti e 2 distanziali.

Figura 2
Figura 2. Transcranial due fotoni di imaging mediante una preparazione assottigliato-teschio nella corteccia motoria del mouse, in vivo sono stati acquisiti. (B) A basso ingrandimento massimo proiezione di rami dendritici nella corteccia motoria di un 1 mese di età mouse (Mappa 2). (C) immagini ripetitive dello stesso segmento dendritiche rivelano spine di recente formazione (frecce), spine eliminate (frecce), e filopodia (stelle) il giorno 0, 2, 4 e 8. Il pannello di sinistra è una vista più alto ingrandimento il segmento dendritica mostrato nella regione inscatolato in (B). Barre di scala: 500 micron (A), 20 micron (B), e 2 micron (C).

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Discussion

Per ottenere un successo preparato assottigliato-teschio, diversi passaggi in questo protocollo sono cruciali. 1) Lo spessore del cranio. L'osso cranico ha una struttura a sandwich, con due strati di alta densità dell'osso compatto e uno strato intermedio di bassa densità dell'osso spugnoso. Mentre il micro trapano ad alta velocità è adatto per rimuovere gli strati esterni di osso compatto e osso spugnoso, la lama microchirurgico è ideale per diluire lo strato interno di osso compatto. Poiché lo spessore e la rigidità del cranio aumenta durante lo sviluppo, l'imaging di topi adulti richiede più osso da rimuovere per ottenere immagini di buona qualità. La zona assottigliata presenta un aspetto solido trasparente e garantisce una buona qualità delle immagini quando lo spessore del cranio è di circa 20-30 micron. Lo spessore del cranio deve essere controllato periodicamente durante il processo di assottigliamento come over-assottigliamento rende il processo di assottigliamento nelle successive sessioni di re-imaging difficile. 2) La dimensione della regione assottigliata.È importante stabilire una configurazione assottigliato-teschio stabile, in cui si ottiene una cavità a forma di cono. L'architettura della regione diluito con una dimensione adeguata impedisce causando danni alla corteccia e aiuta diradamento nelle sessioni di re-imaging successive. Si raccomanda di rendere la zona inferiore (circa 200-300 micron di diametro) della regione assottigliata più piccolo dell'apertura superiore (circa 0,5-1,0 mm di diametro). 3) La stabilità delle immagini. Una preparazione ben immobilizzato, contribuisce a migliorare la qualità dell'immagine riducendo artefatti da movimento respiratorio indotto. È importante mantenere il cranio asciutto e privo di tessuto connettivo e detriti ossei prima della piastra di testa è attaccata al cranio. Colla supplementare può essere applicato anche per colmare le rimanenti lacune tra la piastra di testa e il cranio. Inoltre, l'obiettivo di una zona fuori dal grande vascolare riduce al minimo i movimenti causati dal pompaggio del sangue.

Studio dei cambiamenti del reggisenoin animali con elevata risoluzione spaziale e temporale utilizzando la microscopia a due fotoni vivente richiede la generazione di una finestra ottica. Oltre alla preparazione assottigliato-teschio, strutture fluorescente possono anche essere visualizzati rimuovendo il cranio e la sua sostituzione con un vetro di copertura (solitamente 3-5 mm di diametro) che fornisce una finestra di imaging chiara 10, 13. Mentre sia assottigliato-teschio e protocolli di imaging open-cranio vengono applicati ampiamente per studi di imaging in vivo in, ogni metodo ha i suoi vantaggi ed è adatto per diversi modelli sperimentali. Per esempio, la preparazione open-cranio è utile per gli studi che investigano relativamente grandi aree cerebrali (ad esempio, 5 mm di diametro) e richiedono molte sessioni di imaging con brevi intervalli (cioè, giorni). Una volta che la finestra cranica è impiantato con successo, non è necessario alcun ulteriore intervento chirurgico. Tuttavia, un periodo post-operatorio (di solito circa 1 mese) è necessario prima della prima rappresentazionesessione di migliorare le risposte potenziali infiammatorie causate da un intervento chirurgico. Re-imaging diventa impossibile quando la finestra cranica è bloccato da ricrescita dell'osso e / o ispessimento delle meningi. Al contrario, gli animali con una preparazione assottigliato-teschio può essere ripreso immediatamente dopo l'intervento iniziale, rendendolo più adatto per l'imaging cronica di animali giovani (ad esempio, 2 settimane). E 'adatto per le indagini di imaging con intervalli lunghi (ossia mesi a anni), come la ricrescita dell'osso e dura ispessimento non è problematica. Tuttavia, ri-assottigliamento del cranio è di solito richiesto per le sessioni di re-imaging successive (anche con intervalli di 2 al giorno) a causa della ricrescita ossea. Inoltre, lo strato osso appena cresciuti costituito da una struttura condensata meno rispetto all'osso compatto originale, riducendo notevolmente la trasparenza della regione assottigliata-cranio. Pertanto, per acquisire la stessa qualità di immagini, è necessario rimuovere completamente lo strato osso appena cresciuti. E talettempts solito portano allo spessore finale del cranio nella successiva rappresentazione più sottile della preparazione precedente. Dal momento che lo spessore del cranio era stato preparato a 20-30 micron nella sessione di imaging iniziale, lasciando spazio limitato per la ri-diradamento, i tempi di imaging totali di preparazione assottigliato-teschio è di solito meno di 5 volte. Recentemente, un nuovo approccio sperimentale denominato lucido e rinforzato assottigliato-teschio (porte) è stato sviluppato per combinare entrambi preparati diluiti e open-cranio 11, 26, 27.

Finora, la maggioranza di imaging in vivo nella corteccia è stata eseguita utilizzando linee di topi transgenici esprimenti EGFP o YFP sotto neuronale specifico promotore Thy1. Questi topi transgenici esprimono proteine ​​fluorescenti scarsamente in un sottoinsieme, ma popolazione mista di neuroni corticali 25. Dal momento che molte linee di evidenza indicano che l'esperienza-dipendente plasticità strutturale accade in seletipi cellulari ctive di circuiti ben definite, è importante etichettare e immagine in modo specifico tipo cellulare. Ad oggi, molti approcci sono stati applicati per raggiungere questo obiettivo. Ad esempio, i neuroni piramidali in diversi strati corticali possono essere bersaglio di esibendosi in utero elettroporazione nelle fasi embrionali definiti 28, 29. Allo stesso modo, l'iniezione di vettori virali ingegnerizzati per esprimere una proteina fluorescente può anche essere usato per marcare cellule in differenti regioni cerebrali 30. Inoltre, molte linee di topi transgenici sono stati generati per guidare l'espressione della ricombinasi Cre sotto tipo di cellula promotori specifici 31, 32. Iniezione di vettori virali come il virus adeno-associato trasportano fluorescente gene reporter a seguito di un codone di stop floxed in questi topi offre la possibilità di indirizzare una classe specifica di neuroni in una regione ristretta 33. Combinando questi nuovi etichettatura approcci con il nostro diluito-spreparazione kull, cambiamenti nelle connessioni sinaptiche dei neuroni corticali può essere indagato da due fotoni imaging in vivo in un tipo di cellule e / o modo specifico circuito.

Con la crescente disponibilità di animali transgenici con popolazioni cellulari fluorescente e rapido sviluppo di tecniche di marcatura in vivo, procedure analoghe qui descritti possono essere applicati anche per studiare altri tipi di cellule (cellule gliali) e vascolare nel cervello vivente. Combinato con manipolazioni comportamentali e modelli di malattia, a due fotoni imaging in vivo espandere notevolmente la nostra comprensione dei meccanismi molecolari, cellulari e circuiti sottostanti funzioni cerebrali.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgements

Ringraziamo James Perna per l'illustrazione grafica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Mental Health a YZ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Bioniche Pharma 67457-034-10 Mixed with xylazine for anesthesia
Xylazine Lloyd laboratories 139-236 Mixed with ketamine for anesthesia
Saline Hospira 0409-7983-09 0.9% NaCl for injection and imaging
Razor blades Electron microscopy sciences 72000 Double-edge stainless steel razor blades
Alcohol pads Fisher Scientific 06-669-62 Sterile alcohol prep pads
Eye ointment Henry Schein 102-9470 Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant
High-speed micro drill Fine Science Tools 18000-17 The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area
Micro drill steel burrs Fine Science Tools 19007-14 1.4 mm diameter
Microsurgical blade Surgistar 6961 The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone
Cyanoacrylate glue Fisher Scientific NC9062131 Fix the head plate onto the skull
Suture Havard Apparatus 510461 Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament
Dissecting microscope Olympus SZ61
CCD camera Infinity
Two-photon microscope Prairie Technologies Ultima IV
10X objective Olympus NA 0.30, air
60X objective Olympus NA 1.1, IR permeable, water immersion
Ti-sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP

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References

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