Author Produced

Een stap Zuivering van Twin-Strep-gelabeld eiwitten en hun complexen op Strep-Tactin Resin Cross-linked met bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Een werkwijze wordt beschreven voor een efficiënte zuivering van twin-Strep-gemerkte fusie-eiwitten en hun specifieke complexen van gemodificeerde streptavidine (Strep-Tactin) hars covalent verknoopt met Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3). De methode heeft de voordelen van hoge snelheid, goede doeleiwit terugwinning en hoge zuiverheid, en is compatibel met daaropvolgende analyse door massaspectrometrie.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ivanov, K. I., Bašić, M., Varjosalo, M., Mäkinen, K. One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3). J. Vis. Exp. (86), e51536, doi:10.3791/51536 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Affiniteitszuivering van Strep-gemerkte fusie-eiwitten op harsen dragen een aangelegde streptavidine (Strep-Tactin) is uitgegroeid tot een veel gebruikte methode voor de isolatie van eiwitcomplexen onder fysiologische omstandigheden. Fusie-eiwitten die twee kopieën van Strep-tag II, aangeduid twin-Strep-tag of SIII-tag, hebben het voordeel van hogere affiniteit voor Strep-Tactin in vergelijking met degenen die slechts een enkele Strep-tag, waardoor efficiënter eiwitreiniging. Echter dit voordeel gecompenseerd doordat elutie twin-Strep-gemerkte eiwitten met biotine onvolledig zijn, leidt tot lage eiwit herstel. Het herstel kan drastisch worden verbeterd door denaturerende elutie met natriumdodecylsulfaat (SDS), maar dit leidt tot verontreiniging met Strep-Tactin afgegeven uit de hars monster, waardoor de bepaling onverenigbaar met downstream proteoomanalyse. Om deze beperking te overwinnen, hebben wij een methode waarbij hars gekoppeld tetrameer van Strep-Tactin ontwikkeldwordt eerste gestabiliseerd door covalente verknoping met Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3) en het verkregen verknoopte hars wordt vervolgens gebruikt om doeleiwit complexen te zuiveren in een enkele batch zuiveringsstap. Efficiënte elutie met SDS zorgt voor een goede eiwit herstel, terwijl de afwezigheid van verontreinigende Strep-Tactin laat stroomafwaarts eiwit analyse door massaspectrometrie. Als een proof of concept, beschrijven we hier een protocol voor de zuivering van SIII-getagde viraal eiwit VPG-Pro van kernen van virus-geïnfecteerde N. benthamiana installaties die het Strep-Tactin polymethacrylaathars verknoopt met BS3. Hetzelfde protocol kan worden gebruikt om een ​​twee-Strep-gelabeld eiwit van belang te zuiveren en te karakteriseren zijn fysiologische bindingspartners.

Introduction

In de afgelopen jaren heeft Strep-tag technologie op grote schaal gebruikt worden in veel gebieden van het biomedisch onderzoek, met inbegrip van proteomics en structurele biologie. Deze eiwitzuivering technologie, die gebaseerd is op de fusie van recombinante eiwitten een korte Strep-tag peptide, gerijpt met de komst van affiniteitsmatrices uitvoering Strep-Tactin, een genetisch gemanipuleerde variant van streptavidine met verbeterde peptide-bindingscapaciteit. 1, 2 fusie-eiwitten die twee kopieën van Strep-tag II, aangeduid twin-Strep-tag of SIII-tag, vertonen een hogere affiniteit voor Strep-Tactin matrices dan die met slechts een enkele Strep-tag, waardoor efficiëntere zuivering van de recombinante eiwitten en bijbehorende bindingspartners. Echter, de hogere affiniteit van twin-Strep-gemerkte eiwitten om Strep-Tactin heeft ook zijn keerzijde. Concurrerende elutie van dergelijke eiwitten met overmaat biotine kan onvolledig zijn, waardoor doeleiwit rendement gedaald. Een merts efficiënt alternatief is elutie met SDS, maar het leidt tot ongewenste verontreiniging met monster Strep-Tactin afgegeven uit het hars, waardoor de bepaling onverenigbaar met proteoomanalyse. Dit document presenteert een techniek om deze beperking te overwinnen door eerst het stabiliseren van de hars-gekoppelde tetrameer van Strep-Tactin door chemische cross-linking en vervolgens met behulp van SDS naar twin-Strep-gemerkte eiwitten en hun bijbehorende complexen uit de resulterende verknoopte hars elueren. Zo kan voldoende eiwit opbrengst worden bereikt zonder monster besmetting met Strep-Tactin, waardoor verdere analyse met behulp van massaspectrometrie.

De methode is geschikt voor de zuivering van een recombinant fusie-eiwit met een oppervlak blootgestelde SIII-tag 3 of twin-Strep-tag (aminozuurvolgorde WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK en SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respectievelijk). Het eiwit kan van dierlijke, plantaardige of bacteriële oorsprong zijn en kunnen worden geïsoleerd uit zowel de totale cellysaat of verrijkte organel fractie. Als voorbeeld beschrijven we hier de zuivering van een SIII-gemerkt eiwit VPG-Pro Aardappel Virus A (PVA) 4 van de nucleaire fractie van PVA-geïnfecteerde Nicotiana benthamiana planten. De nucleaire fractie werd geïsoleerd zoals eerder beschreven 5 met de volgende wijzigingen: cellen werden niet behandeld met formaldehyde, werd natrium butyraat gesubstitueerd alle buffers met 5 mM natriumfluoride, werd volledige proteaseremmer gesubstitueerd met PMSF, Triton X-100 concentratie extractie buffer # 2 werd verlaagd tot 0,3% (v / v) en de nucleaire pellet verkregen door centrifugatie door sucrosekussen (extractiebuffer # 3) werd geresuspendeerd in 1,45 ml voorgekoeld bindingsbuffer en geroteerd gedurende 1,5 uur bij 4 ° C. De resulterende nucleaire extract dat de SIII-gelabeld aas eiwit en bijbehorende complexen (aas eiwit monster) werd verwerkt volgens de hieronder beschreven (zie punt 2) protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cross-linking van Strep-Tactin polymethacrylaathars met Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3)

  1. Equilibreer een afgedichte microbuisjes met 2 mg BS3 vernettingsmiddel tot kamertemperatuur. LET OP: BS3 is een gevaarlijke stof. Draag beschermende handschoenen en een veiligheidsbril.
  2. Resuspendeer Strep-Tactin polymethacrylaat hars (50% suspensie in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) door korte krachtig schudden en 600 pl van de suspensie onmiddellijk over in de spin-kolom met een pipet met de einde afgesneden.
  3. Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi de doorstroom en voeg 450 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de kolom.
  4. Herhaal de vorige stap 2 keer volledig vervangen Tris-buffer met PBS en laat de hars in 430 pl PBS op pH 8,0 na de laatste centrifugatie.
  5. Prik de folie van de microbuisjes met BS3 met een pipet met 1001, l van ultrapuur water. Los het poeder in water BS3 door voorzichtig en neer te pipetteren en onmiddellijk 20 ul van de oplossing aan de spin kolom. De eindconcentratie van BS3 in de verknopingsreactie is ~ 1,2 mM.
  6. Draai de kolom gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Controleer dat de hars goed gemengd met de oplossing BS3.
  7. Om de reactie te blussen, voeg 6 ui 3M Tris-HCl, pH 7,5 en draai de kolom gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi de doorstroom en resuspendeer de verknoopte hars in 450 pl Tris gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST). Herhaal het centrifugeren en wassen stappen nog twee keer. Bij de laatste stap, resuspendeer de hars in 450 pl TBS.
  9. Breng het hars suspensie naar een nieuwe buis met behulp van een pipet tip met het uiteinde afgesneden. Resuspendeer de hars links in de kolom met een 450 pl TBS en dragen dezelfde buis. Herhaal the laatste stap nogmaals maximale overdracht van de hars van de kolom buis waarborgen.
  10. Laat de buis gedurende 10 minuten staan ​​bij kamertemperatuur en het volume op 600 pi passen door het verwijderen van overmaat TBS. De hars is direct klaar voor gebruik (aanbevolen) of kan worden opgeslagen bij 4 ° C, zonder bevriezing.

2. Binding van de Twin-Strep-gelabeld Bait Eiwit en Associated Complexen voor de Cross-linked Strep-Tactin polymethacrylaathars

  1. Centrifugeer 1 ml van het aas eiwit monster in bindingsbuffer bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en breng het supernatant naar een nieuwe buis.
  2. Te minimaliseren binding van endogene gebiotinyleerde eiwitten aan de Strep-Tactin hars, voeg avidine tot een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml en roteer gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
    1. Als de verknoopte hars van stap 1.10 is opgeslagen gedurende langere tijd bij 4 ° C, verzamel de hars door centrifugatie bij 400 xg for 1 min bij 4 ° C. Giet het supernatant en was de hars met 1 ml TBST. Herhaal het centrifugeren en wassen stappen nog twee keer, eerst met TBST en vervolgens met TBS. Centrifugeer het buisje bij 400 xg gedurende 1 min bij 4 ° C en aangepast voor het oorspronkelijke volume door het verwijderen van overmaat TBS.
  3. Resuspendeer de verknoopte Strep-Tactin hars door vortexen. Voeg onmiddellijk 50 ul van de harssuspensie de buis met het aas eiwit monster met een snit pipetpunt en draai nog eens 30 min bij 4 ° C.
  4. Afwachting, ingesteld Thermomixer tot 55 ° C en verwarm 500 ui elutiebuffer voor gebruik in stap 3.1.
  5. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was de hars op een rotator gedurende 5 min bij 4 ° C met 1 ml voorgekoeld wasbuffer # 1. Herhaal het centrifugeren en wassen stappen drie keer. Bij de laatste stap, resuspendeer de hars in 250 pl wasbuffer # 2.
  6. Tr ansfer de harssuspensie een frisse draai kolom. Resuspendeer de hars achterblijft in de buis in een 250 ui wasbuffer # 2 en transfer naar dezelfde kolom.
  7. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. Giet de doorstroom en breng de kolom vers dolfijnen nose 2 ml buisje. Onmiddellijk naar de elutiestap hieronder.

3. Elutie van specifieke eiwitcomplexen

  1. Voeg 150 ul voorverwarmde elutiebuffer uit stap 2.4 tot de spin kolom.
  2. Incubeer in Thermomixer gedurende 5 minuten bij 55 ° C, onder schudden bij 1400 rpm.
  3. Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
  4. Gooi de kolom en bewaar de gezuiverde doelwit eiwitten bij ≤ -20 ° C.
0 "> x; "> 550 mm 2 "height =" 20 "style =" height: 20px; width: 597px; "> Elutiebuffer
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
Na 2 HPO 4 10 mM
KH 2 PO 4 2mM
NaCl 137 mM
KCl 2.7 mM
pH ingesteld op 7,4, tenzij anders aangegeven (pH 8.0 in sectie 1.4)
Tris gebufferde zoutoplossing (TBS)
Tris-HCl, pH 7,4 50 mM
ght = "20" style = "height: 20px; width: 299px;"> NaCl 150 mM
Tris gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST)
Tris-HCl, pH 7,4 50 mM
NaCl 150 mM
Tween 20 0.1% (v / v)
Bindingsbuffer
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl
NaF 5 mM
EDTA 0,5 mM
Glycerol 10% (v / v)
PMSF 0,1 mM
Wash Buffer # 1
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl 500 mM
NaF td> 5 mM
EDTA 0,4 mM
IGEPAL CA-630 0.2% (v / v)
Glycerol 5% (v / v)
PMSF 0,1 mM
Wash Buffer # 2
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl 150 mM
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
SDS 1% (w / v)

Tabel 1. Buffers gebruikt in de onderhavige studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De zuiveringswerkwijze is schematisch weergegeven in figuur 1, samen met een representatie van problemen in verband met andere bestaande zuiveringswerkwijzen.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische weergave van de zuiveringsprocedure. De workflow bevat stabilisatie van de hars gekoppelde Strep-Tactin tetrameer via covalente verknoping met BS3 binding van de twee-Strep-gelabeld lokaas eiwitten en complexen verbonden aan de verknoopte hars , het wegwassen van ongebonden eiwitten denatureren elutie van de specifiek gebonden eiwit complexen met 1% SDS en de analyse daarvan door middel van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Twee rode bollen in het aas eiwit duiden de twin-Strep-tag. Beperkingen andere zuiveringsmethoden zijn in bijvoegselvakken rechts. Zij omvatten onvolledige elutie van target eiwitten met biotine en besmetting monster met Strep-Tactin na denaturering elutie met 1% SDS.

Typische resultaten van de SIII-gelabeld eiwit zuivering met gebruik van de BS3-verknoopte Strep-Tactin polymethacrylaat hars denaturering elutie met 1% SDS worden getoond in Figuur 2. 10% (15 pl) van de spin kolom eluaat met gezuiverde SIII-gelabeld PVA VPG-Pro en geassocieerde eiwitten werd geanalyseerd door SDS-PAGE gevolgd door zilverkleuring. De afwezigheid van de 52 kDa band die overeenkomt met PVA VPG-Pro in de negatieve controle rijstrook bevestigde de specificiteit van het pull-down. 40 pl van het resterende spinkolom eluaat werd aangebracht op een keratine vrij SDS gel en de bijbehorende baan werd uitgesneden en bevatte eiwitten werden gedigereerd met trypsine en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) geanalyseerd. De massaspectrometrie analyse identificeerde viraal RNA-dependent RNA-polymerase (replicase) penpunt als de interactie partner van VPG-Pro. Meerdere tryptic peptiden die overeenkomen met NIB werden gedetecteerd in alle vier biologische herhalingen van de affiniteit zuivering en niemand in de vier controles uiten VPG-Pro zonder de SIII-tag, bevestiging van de specificiteit van de interactie. Omdat het molecuulgewicht van de penpunt (59 kDa) is dicht bij die van SIII-gelabeld VPG-Pro (52 kDa), de twee eiwitten verscheen als een dubbele band in SDS-PAGE analyse (Figuur 2, pijlpunt). Tezamen de bovenbeschreven resultaten experimenteel bewijs leveren dat affiniteitszuivering op Strep-Tactin harsen covalent verknoopt met BS3 met succes worden toegepast om dubbele-Strep-gemerkte eiwitten te isoleren en identificeren van de fysiologische bindingspartners door massaspectrometrie.

Figuur 2
SIII-gelabeld PVA VPG-Pro en zijn bindingspartner PVA NIB op Strep-Tactin polymethacrylaathars verknoopt met BS3. De figuur toont een zilver gekleurde SDS-polyacrylamidegel van eluaten uit de verknoopte kralen. NIB werd geïdentificeerd door massaspectrometrie als bindingspartner van VPG-Pro met een bekende hoeveelheid van hetzelfde monster. SIII-tagged PVA VPG-Pro (voorspelde MW: 52 kDa) en NIB (voorspelde MW: 59 kDa) migreren als een dubbele band, aangegeven met een pijlpunt. Negatieve controle (middelste baan) correspondeert met zuivering uit cellen geïnfecteerd met het virus dat VPG-Pro zonder SIII-tag.

Figuur 3
Figuur 3. Biotine uitwassen van SIII-gelabeld PVA VPG-Pro van Strep-Tactin polymethacrylaathars wordtonvolledige vergelijking met elutie met 1% SDS. De figuur toont een anti-VPG immunoblot van eluaten van Strep-Tactin kralen. De korrels werden geëlueerd met ofwel 15 mM biotine of met 1% SDS. Het verschil in intensiteit van het signaal reflecteert verschillende eiwitopbrengsten verkregen met de twee elutietechnieken. Negatieve controles komen overeen met zuiveringen uit cellen geïnfecteerd met het virus dat VPG-Pro zonder de SIII-tag.

Figuur 4
Figuur 4. Covalente cross-linking met BS3 voorkomt het vrijkomen van Strep-Tactin van de hars tijdens SDS elutie. De figuur toont een zilver gekleurde gel van SDS eluaten uit niet-verknoopte (linkerbaan) en BS3-verknoopte (rechter rijbaan) Strep-Tactin polymethacrylaathars. Let op de aanwezigheid van vrijgekomen Strep-Tactin in de linker rijstrook, maar de afwezigheid ervan in de rechter rijstrook.


Figuur 5. Chemische structuur van Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3) en de verknopingsreactie met epsilon-aminogroepen van lysineresten in Strep-Tactin.

Figuur 6
Figuur 6. Zuivering van twin-Strep-gelabeld groen fluorescerend eiwit (GFP) op niet-verknoopt en BS3-verknoopte Strep-Tactin polymethacrylaat hars. Twee gelijke hoeveelheden van humane embryonale nier 293 cellen die twin-Strep-gelabeld GFP werden gelyseerd en evenzo verwerkt met bovenstaande protocol, behalve dat in een geval de hars wordt vernet met BS3 en het andere BS3 heeft zijnen vervangen met water in de vernettingsreactie. De figuur toont een zilver-gekleurde SDS-polyacrylamidegel en anti-GFP immunoblot van gezuiverde eiwitten. Merk op dat enige afname in eiwitgrammen inherent is aan zuiveringswerkwijzen met chemische verknoping, maar dit wordt gecompenseerd door de hogere zuiverheid van het monster door het ontbreken van vrijgekomen Strep-Tactin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het bovenstaande protocol kan worden gebruikt om een ​​twee-Strep-gelabeld aas eiwit van interesse en de bijbehorende complexen in elke geschikte buffer die niet biotine of sterke denatureringsmiddelen bevat zuiveren. In de huidige versie van het protocol, bindende en wassen wordt uitgevoerd onder relatief stringente omstandigheden in de aanwezigheid van hoge zoutconcentratie en niet-ionisch detergens. Hoewel dit leidt tot minder achtergrond, kan breekbare eiwitcomplexen dissociëren onder deze omstandigheden. Om dergelijke lagere affiniteit complexen te behouden, kan zoutconcentratie worden verlaagd en niet-ionische detergent kan worden verminderd of weggelaten uit bindend en wasbuffers.

Het belangrijkste voordeel van de twin-Strep-tag systeem is de hoge affiniteit van de kleine (3kDa) tandem tag om gemanipuleerde streptavidine (Strep-Tactin) 1, 2, waardoor efficiënte one-step het zuiveren van doel eiwitten en hun complexen zelfs in batch modus. Door de sterke binding van twin-Strep-tagom Strep-Tactin, kan de hars onder matig stringente omstandigheden, zoals hoge wasmiddel en / of zoutconcentraties, waardoor hogere doeleiwit zuiverheid gewassen. Dergelijke sterke binding heeft ook zijn nadelen. Zelfs in het geval van eiwitten met een Strep-tag II (WSHPQFEK aminozuursequentie) kunnen concurrerende elutie uit de hars soms moeilijk zijn. Bijvoorbeeld, elutie van Strep (II)-gemerkt eiwit kinase, NtCDPK2, de Strep-Tactin polymethacrylaat hars met 10 mM desthiobiotine bleek niet succesvol te zijn, waarbij denaturering elutie met SDS monsterbuffer 6. Het probleem werd opgelost nadat desthiobiotine werd vervangen door sterkere concurrerende biotine (10 mM) en elutie werd gedurende 5 minuten onder krachtig schudden 7 uitgevoerd. Bij de dubbele-Strep-tag, die een hogere affiniteit voor Strep-Tactin heeft, kan doeleiwit elutie zelfs bij biotine concentraties zo hoog als 15 mM onvolledig zijn. Zoals getoond in figuur 3,slechts een kleine fractie van SIII-gelabeld PVA VPG-Pro kunnen worden geëlueerd van de Strep-Tactin hars met 15 mM biotine vergeleken met de hoeveelheid geëlueerd met 1% SDS. Het is belangrijk op te merken dat de efficiëntie van competitieve elutie waarschijnlijk ook afhankelijk van de aard van het geëlueerde eiwit of eiwitcomplex. Grotere en hydrofobe eiwitten kunnen sterisch hinderen de toegankelijkheid van de biotine-bindingsplaats in Strep-Tactin, waardoor competitieve elutie minder efficiënt. Bovengenoemde nadelen worden vermeden door elutie met SDS, maar dergelijke elutie heeft zijn eigen problemen, voornamelijk draait om het feit dat blootstelling aan detergentia leidt tot dissociatie van het hars gekoppelde Strep-Tactin tetrameren en vervuiling monster met model Strep-Tactin 8. Dit blijkt uit fig. 4 (linker baan), dat een aanzienlijke hoeveelheid Strep-Tactin vrijgegeven na incubatie van de Strep-Tactin hars in elution buffer die 1% SDS toont. Dergelijke contaminatie is onaanvaardbaar indienhet monster moet verder worden geanalyseerd door LC-MS/MS.

Een effectieve oplossing voor het bovenstaande probleem is de verontreiniging stabilisatie van de hars gekoppelde Strep-Tactin tetrameer 9 door covalente verknoping. Hiervoor gebruikten we een in water oplosbare, niet-splitsbare, homobifunctionele amine-reactieve vernettingsmiddel BS3 met een geschiedenis van succesvolle gebruik stabilisering eiwitstructuren 10-13. Figuur 5 toont de chemische formule van BS3 en de verknoping reactie met gratis epsilon aminogroepen van lysine in Strep-Tactin. Wanneer de hars gekoppeld Strep-Tactin tetrameer werd gestabiliseerd door cross-linking met BS3, werd het probleem van contaminatie monster met vrijgegeven Strep-Tactin vrijwel uitgesloten (figuur 4, rechter rijstrook). Omdat de verknoping met BS3 veroorzaakt geen uitgebreide eiwitsamenvoeging 14, is het niet de toegankelijkheid van de biotine-bindingsplaats in streptavidine verminderen, waardoor deverknoopte hars geschikt voor zuivering van Strep-tag fusie-eiwitten. Opgemerkt zij echter dat de chemische cross-linking van eiwitten met biologische activiteit (antilichamen, enz.) stabiliseert zowel actieve als inactieve eiwitten conformaties, leidt tot een aantal activiteitsverlies. Bijvoorbeeld, de gevestigde immunoprecipitatiemethode met BS3-verknoopte antilichamen produceert minder doeleiwit vertonen in vergelijking met die verkregen met niet-verknoopte antilichamen 15. Toch wordt een verlies van biologische activiteit als een aanvaardbaar compromis voor de verbeterde monster zuiverheid. We hebben vergelijkbare resultaten waargenomen met het BS3 verknoopte Strep-Tactin hars. De iets lagere eiwit opbrengst verkregen met de verknoopte hars bedroeg meer dan gecompenseerd door de sterk verbeterde zuiverheid van het monster (figuur 6).

Een andere mogelijke toepassing van de voorgestelde werkwijze is zuivering van Strep-aanhangsel membraaneiwitten solubilized met schoonmaakmiddelen. Wasmiddelen zijn essentieel voor het houden van dergelijke hydrofobe eiwitten en hun bijbehorende complexen in oplossing, maar hun aanwezigheid kan leiden tot monster besmetting met Strep-Tactin vrijgelaten uit de affiniteit hars. Een goed voorbeeld hiervan is de zuivering van een Strep (II)-gelabeld membraaneiwit Voor NTT1 op Strep-Tactin kralen voor het doel eiwitkristallisatie 8. De aanwezigheid van detergens laurylamidodimethylpropylaminoxide (Lapão) in de elutiebuffer tot de vrijlating van Strep-Tactin van de kralen en daaropvolgende groei van ongewenste Strep-Tactin kristallen 8. Stabilisatie van de hars gekoppelde Strep-Tactin tetrameer door covalente verknoping kan een effectieve manier om dit probleem te ondervangen.

Samenvattend, heeft chemische cross-linking succes toegepast om de beperkingen verbonden aan denaturerende elutie van de Strep-Tactin hars overwinnen. Deze aanpak hielp realiseren van een goede doelproteïne reCovery zonder dat er besmetting monster. De voorgestelde werkwijze kan derhalve worden gebruikt om specifieke bindingspartners twin-Strep-gelabeld lokaas eiwitten door massaspectrometrie bepalen. Bovendien kan de werkwijze worden toegepast voor het isoleren en karakteriseren nucleoproteïne complexen, waaronder die reversibel vernet met formaldehyde, en membraaneiwitten opgelost met schoonmaakmiddelen. Tenslotte neemt chemische verknoping niet significant de fysische eigenschappen van de Strep-Tactin hars, waardoor de verknoopte hars potentieel geschikt voor high-throughput toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

Wij dankbaar erkennen de technische ondersteuning van Sini Miettinen, Minna Pöllänen en Taru Rautavesi. Wij danken Helka Nurkkala voor het verstrekken van HEK 293 cellen die twin-Strep-gelabeld GFP en Pekka Evijärvi voor het verstrekken van geluidsopname-apparatuur. Dit werk werd gefinancierd door de Academie van Finland, verlenen nummers 138329, 134684 en 258978.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg Pierce/Thermo Scientific 21585 www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) IBA 2-1505 www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile Costar (Corning) 8163 www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes Costar (Corning) 3213 www.corning.com/lifesciences/
Avidin  IBA 2-0204 www.iba-lifesciences.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10, (8), 975-982 (1997).
  2. Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2, (6), 1528-1535 (2007).
  3. Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5, (5), 1199-1203 (2005).
  4. Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22, (2), 523-535 (2010).
  5. Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  6. Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55, (1), 135-147 (2004).
  7. Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146, (2), 418-430 (2008).
  8. Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68, (10), 1272-1277 (2012).
  9. Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, (7), 2190-2194 (1989).
  10. Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168, (6), 965-974 (2005).
  11. Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281, (50), 38266-38275 (2006).
  12. Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (9), (2010).
  13. Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
  14. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173, (3), 530-540 (2011).
  15. Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics