Author Produced

Et-trins Oprensning af Twin-Strep-mærkede proteiner og deres komplekser på Strep-Tactin Resin tværbundet med Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En metode er beskrevet til effektiv rensning af twin-Strep-kodede fusionsproteiner og deres specifikke komplekser på modificeret streptavidin (Strep-Tactin) harpiks kovalent krydsbundet med Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3). Fremgangsmåden har fordelene ved hurtig hastighed, god målprotein nyttiggørelse og høj renhed, og er forenelig med efterfølgende analyse ved massespektrometri.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ivanov, K. I., Bašić, M., Varjosalo, M., Mäkinen, K. One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3). J. Vis. Exp. (86), e51536, doi:10.3791/51536 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Affinitetsoprensning af Strep-mærkede fusionsproteiner på harpikser bærer en manipuleret streptavidin (Strep-Tactin) er blevet en udbredt metode til isolering af protein-komplekser under fysiologiske betingelser. Fusionsproteiner indeholdende to kopier af Strep-tag II udpegede twin-Strep-tag eller SIII-tag, har fordelen af ​​en højere affinitet for Strep-Tactin forhold til dem, der kun indeholder en enkelt Strep-tag, således at en mere effektiv rensning af proteiner. Imidlertid er denne fordel modsvares af den kendsgerning, at eluering af twin-Strep-mærkede proteiner med biotin kan være ufuldstændig, hvilket fører til lavt proteinindhold recovery. Genopretning kan forbedres dramatisk ved hjælp af denaturerende eluering med natriumdodecylsulfat (SDS), men dette fører til prøve kontaminering med Strep-Tactin frigives fra harpiksen, hvilket gør assayet uforenelig med nedstrøms proteom analyse. For at overvinde denne begrænsning, har vi udviklet en metode, hvor harpiks-koblede tetramer af Strep-Tactinførst stabiliseret ved covalent tværbinding med bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3), og den resulterende tværbundne harpiks derefter anvendes til at oprense target protein-komplekser i en enkelt batch oprensningstrin. Effektiv eluering med SDS sikrer god protein recovery, mens fravær af kontaminerende Strep-Tactin tillader nedstrøms protein analyse ved massespektrometri. Som et proof of concept, vi beskriver her en protokol til oprensning af SIII-mærket viralt protein VPG-Pro fra kerner af virus-inficerede N. benthamiana anlæg, der anvender Strep-Tactin polymethacrylatharpiks tværbundet med BS3. Den samme protokol kan anvendes til at oprense enhver twin-Strep-mærkede protein af interesse og karakterisere dets fysiologiske bindingspartnere.

Introduction

I de senere år har Strep-tag teknologien bliver udbredt i mange områder af biomedicinsk forskning, herunder proteomics og strukturel biologi. Dette protein rensning teknologi, som er baseret på fusionen af rekombinante proteiner til en kort Strep-tag-peptidet, er modnet med fremkomsten af affinitetsmatricer bærer Strep-Tactin, et gensplejset variant af streptavidin med forbedret peptid-bindende kapacitet. 1, 2 fusionsproteiner indeholdende to kopier af Strep-tag II, der er udpeget twin-Strep-tag eller SIII-tag, udviser en højere affinitet for Strep-Tactin matricer end dem, der kun indeholder et enkelt Strep-tag, sikre en mere effektiv rensning af rekombinante proteiner og deres tilknyttede bindingspartnere. Men den højere affinitet af twin-Strep-mærkede proteiner til Strep-Tactin har også sin downside. Konkurrencedygtige eluering af sådanne proteiner med overskydende biotin kan være ufuldstændige, hvilket fører til nedsat target protein udbytte. A mmalm effektivt alternativ er eluering med SDS, men det fører til uønsket prøvekontamination med Strep-Tactin frigives fra harpiksen, hvilket gør assayet uforenelig med proteom analyse. Denne artikel præsenterer en teknik til at overvinde denne begrænsning ved først at stabilisere harpiks-koblede tetramer af Strep-Tactin ved kemisk krydsbinding og derefter bruge SDS til eluering af twin-Strep-mærkede proteiner og deres tilknyttede komplekser fra den resulterende tværbunden harpiks. Således kan tilstrækkelig proteinudbytte opnås uden forurening prøve med Strep-Tactin, hvorved yderligere analyse ved massespektrometri.

Metoden er egnet til oprensning af en hvilken som helst rekombinant fusionsprotein med en overflade-eksponerede SIII-mærke 3 eller dobbelt-Strep-tag (aminosyresekvens WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK og SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, henholdsvis). Proteinet kan være af animalsk, plante-eller bakteriel oprindelse og kan isoleres fra enten total cellelysat eller beriget organel fraktion. Som et eksempel beskriver vi her oprensningen af en SIII-mærket protein VPG-Pro kartoffel virus A (PVA) 4 fra kernefraktionen PVA-inficerede Nicotiana benthamiana planter. Kernefraktionen blev isoleret som tidligere beskrevet 5 med følgende modifikationer: celler blev ikke behandlet med formaldehyd, blev natriumbutyrat substitueret i alle buffere med 5 mM natriumfluorid blev fuldstændig proteaseinhibitor substitueret med PMSF Triton X-100-koncentration i ekstraktion buffer # 2 blev sænket til 0,3% (v / v), og den nukleare pille opnået ved centrifugering gennem saccharosepude (ekstraktionsbuffer # 3) blev resuspenderet i 1,45 ml forafkølet bindingsbuffer og roteret i 1,5 timer ved 4 ° C. Den resulterende nukleare ekstrakt, der indeholder den SIII-mærkede bait protein og associerede komplekser (bait protein prøven) er behandlet i henhold til protokollen beskrevet nedenfor (se afsnit 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Krydsbinding af Strep-Tactin polymethacrylatharpiks med Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3)

  1. Ækvilibrer en forseglet mikrorør indeholdende 2 mg BS3 tværbinder til stuetemperatur. ADVARSEL: BS3 er et farligt stof. Bær beskyttelseshandsker og beskyttelsesbriller.
  2. Resuspender Strep-Tactin polymethacrylatharpiks (50% suspension i 100 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) ved en kortvarig kraftig rystning og straks overføre 600 ul af suspensionen til en spin-søjle ved anvendelse af en pipettespids med ende afskåret.
  3. Centrifuger ved 1.500 x g i 30 sekunder ved stuetemperatur. Kassér gennemstrømning tilsættes 450 pi phosphatpufret saltvand (PBS) til kolonnen.
  4. Gentag det forrige trin 2 gange mere fuldstændigt at erstatte Tris-buffer med PBS og efterlade harpiksen i 430 pi PBS justeret til pH 8,0 efter den sidste centrifugering.
  5. Punktere folien af ​​mikrorør med BS3 med en pipette spids indeholdende 1001, l ultrarent vand. Opløs BS3 pulver i vand ved forsigtigt at pipettere op og ned og straks tilsættes 20 ul af opløsningen til spinsøjle. Den endelige koncentration af BS3 i tværbindingsreaktionen er ~ 1.2 mM.
  6. Drej kolonnen i 30 minutter ved stuetemperatur. Kontroller, at harpiksen er blandet korrekt med BS3 løsning.
  7. For at standse reaktionen, tilsættes 6 pi 3M Tris-HCI, pH 7,5 og rotere søjlen i yderligere 15 minutter ved stuetemperatur.
  8. Centrifuger ved 1.500 x g i 30 sekunder ved stuetemperatur. Kassér gennemstrømning og resuspender tværbundet harpiks i 450 pi Tris-bufret saltvand med Tween 20 (TBST). Gentag centrifugering og vasketrin to gange mere. På det sidste trin, resuspender harpiksen i 450 ul TBS.
  9. Overfør harpiksen suspensionen til et frisk rør ved hjælp af en pipettespids med enden afskåret. Resuspender harpiks tilbage i søjlen med yderligere 450 pi TBS og overføres til det samme rør. Gentag the sidste trin en gang mere for at sikre maksimal overførsel af harpiksen fra kolonnen til rør.
  10. Lad røret stå i 10 min ved stuetemperatur og justere lydstyrken til 600 pi ved at fjerne overskydende TBS. Harpiksen er klar til øjeblikkelig brug (anbefales) eller kan opbevares ved 4 ° C, uden at fryse.

2.. Binding af Twin-Strep-mærket Bait Protein og associerede komplekser til Cross-linked Strep-Tactin polymethacrylatharpiks

  1. Centrifugeres 1 ml af agn proteinprøve i bindingsbuffer ved 17.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C og overføres supernatanten til et frisk rør.
  2. For at minimere binding af endogene biotinylerede proteiner til Strep-Tactin harpiksen, tilsættes avidin til en slutkoncentration på 100 ug / ml og rotere i 15 minutter ved 4 ° C.
    1. Hvis den tværbundne harpiks fra trin 1.10 har været opbevaret i en længere tid ved 4 ° C opsamles harpiksen ved centrifugering ved 400 xg for 1 min ved 4 ° C, supernatanten og harpiksen vaskes med 1 ml TBST. Gentag centrifugering og vask trin to gange, først med TBST og derefter med TBS. Centrifuger røret ved 400 g i 1 min ved 4 ° C og justeres til det oprindelige volumen ved at fjerne overskydende TBS.
  3. Resuspender tværbundet Strep-Tactin harpiks ved hvirvelbehandling. Straks tilføje 50 pi harpiksen suspensionen til røret med agn protein prøve ved hjælp af et snit pipettespids og rotere i yderligere 30 minutter ved 4 ° C.
  4. Mens vi venter, indstille Thermomixer til 55 ° C og forvarme 500 pi elueringspuffer til brug i trin 3.1.
  5. Centrifuger ved 400 x g i 1 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og vaskes harpiks på en rotator i 5 min ved 4 ° C med 1 ml forafkølet vaskebuffer # 1. Gentag centrifugering og vask trin tre gange. På det sidste trin, resuspender resinet i 250 pi vaskepuffer # 2.
  6. Tr ansfer harpiksen suspensionen til en frisk spinsøjle. Resuspender harpiks tilbage i røret i yderligere 250 pi vaskepuffer # 2 og overføres til den samme kolonne.
  7. Centrifuger ved 400 xg i 3 min ved 4 ° C, kasseres gennemstrømning og overføre kolonnen til en ny delfin-næse 2 ml rør. Fortsæt straks til elueringstrin nedenfor.

3.. Eluering af specifikke protein-komplekser

  1. Tilføj 150 pi forvarmet elueringsbuffer fra trin 2.4 til spin kolonne.
  2. Inkuber i Thermomixer i 5 minutter ved 55 ° C, rystning ved 1.400 rpm.
  3. Centrifuger ved 1.500 x g i 1 min ved stuetemperatur.
  4. Kassér kolonnen og gemme de oprensede målproteiner ved ≤ -20 ° C.
0 "> x "> 550 mM 2 "height =" 20 "style =" height: 20px; bredde: 597px; "> Elueringsbuffer
Phosphatbufret saltvand (PBS)
Na 2 HPO 4 10 mM
KH 2 PO4 2 mM
NaCl 137 mM
KCl 2.7 mM
pH justeret til 7,4, medmindre andet er angivet (pH 8,0 i afsnit 1.4)
Tris-pufret saltvand (TBS)
Tris-HCI, pH 7,4 50 mM
GHT = "20" style = "height: 20px; bredde: 299px;"> NaCl 150 mM
Tris-bufret saltvand med Tween 20 (TBST)
Tris-HCI, pH 7,4 50 mM
NaCl 150 mM
Tween 20 0,1% (v / v)
Bindingsbuffer
Tris-HCI, pH 8,0 25 mM
NaCl
NaF 5 mM
EDTA 0,5 mM
Glycerol 10% (v / v)
PMSF 0.1 mM
Vask buffer # 1
Tris-HCI, pH 8,0 25 mM
NaCl 500 mM
NaF td> 5 mM
EDTA 0,4 mM
Igepal CA-630 0,2% (v / v)
Glycerol 5% (v / v)
PMSF 0.1 mM
Vask buffer # 2
Tris-HCI, pH 8,0 25 mM
NaCl 150 mM
Tris-HCI, pH 8,0 25 mM
SDS 1% (w / v)

Tabel 1. Buffere anvendes i den foreliggende undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oprensningsproceduren er skematisk illustreret i figur 1, sammen med en repræsentation af problemer i forbindelse med andre eksisterende oprensningsmetoder.

Figur 1
Fig. 1. Skematisk repræsentation af oprensningsprocedure. Arbejdsgangen omfatter stabilisering af harpiksen-koblede Strep-Tactin tetramer via covalent tværbinding med BS3 binding af twin-Strep-mærket bait protein og associerede komplekser til den tværbundne harpiks , bortvaskning af ubundne proteiner denaturering eluering af specifikt bundne protein komplekser med 1% SDS og analyse ved væskechromatografi-tandem-massespektrometri (LC-MS/MS). To røde kugler i bait protein betegne twin-Strep-tag. Begrænsninger af andre oprensningsmetoder er vist i indsattebokse til højre. De omfatter ufuldstændig eluering af target-proteiner med biotin og forurening prøve med Strep-Tactin efter denaturering eluering med 1% SDS.

Typiske resultater af SIII-mærket protein oprensning ved hjælp af BS3 tværbundne Strep-Tactin polymethacrylatharpiks og denaturering eluering med 1% SDS er vist i fig. 2. 10% (15 ul) af spin søjleeluatet som indeholder renset SIII-mærket PVA VPG-Pro og associerede proteiner blev analyseret ved SDS-PAGE efterfulgt af sølvfarvning. Fraværet af den 52 kDa bånd svarende til PVA VPG-Pro i den negative kontrol lane bekræftede specificiteten af ​​pull-down. 40 pi af den resterende spinsøjle eluatet blev påført en keratin-fri SDS-gel, og den tilsvarende bane blev skåret ud og de indeholdte proteiner blev spaltet med trypsin og analyseres ved væskekromatografi-tandem-massespektrometri (LC-MS/MS). Den massespektrometrianalyse identificeret viralt RNA-Dependent RNA polymerase (replicase) NIB som interagerende partner VPG-Pro. Flere tryptiske peptider svarende til nib blev påvist i alle fire biologiske gentagelser af affinitetsrensningen og ingen i de fire knapper, der udtrykker VPG-Pro uden SIII-tag, der bekræfter specificitet interaktion. Fordi molekylvægten af nib (59 kDa) er tæt på, at SIII-mærkede VPG-Pro (52 kDa), de to proteiner viste sig som et dobbelt bånd i SDS-PAGE-analyse (fig. 2, pilespids). Tilsammen de ovenfor beskrevne resultater giver eksperimentel dokumentation for, at affinitetsrensning på Strep-Tactin harpiks kovalent tværbundet med BS3 med held kan anvendes til at isolere twin-Strep-mærkede proteiner og identificere deres fysiologiske bindende partnere ved massespektrometri.

Figur 2
SIII-mærkede PVA VPG-Pro og dens bindingspartner PVA nib på Strep-Tactin polymethacrylatharpiks tværbundet med BS3. Figuren viser en sølvfarvet SDS-polyacrylamidgel af eluater fra den tværbundne perler. NIB blev identificeret ved massespektrometri som en bindingspartner VPG-Pro under anvendelse af en portion af den samme prøve. SIII-mærket PVA VPG-Pro (forventet MW: 52 kDa) og NIB (forventet MW: 59 kDa) migrere som en dobbelt band, angivet med en pilespids. Negativ kontrol (central bane) svarer til oprensning fra celler inficeret med virus, der udtrykker VPG-Pro uden SIII-tag.

Figur 3
Figur 3.. Biotin eluering af SIII-mærket PVA VPG-Pro fra Strep-Tactin polymethacrylatharpiks erufuldstændige i forhold til eluering med 1% SDS. Figuren viser en anti-VPG immunoblot af eluaterne fra Strep-Tactin perler. Perlerne blev elueret med enten 15 mM biotin eller med 1% SDS. Forskellen i signalintensitet afspejler forskellige protein udbytter opnået med de to elueringstrin teknikker. Negative kontroller svarer til oprensninger af celler inficeret med virus, der udtrykker VPG-Pro uden SIII-tag.

Figur 4
Figur 4.. Kovalent krydsbinding med BS3 forhindrer frigivelsen af Strep-Tactin fra harpiksen under SDS eluering. Figuren viser en sølv-farvet gel af SDS eluaterne fra ikke-krydsbundet (venstre bane) og BS3-cross-linked (højre bane) Strep-Tactin polymethacrylatharpiks. Bemærk tilstedeværelsen af ​​frigivet Strep-Tactin i venstre vognbane, men sit fravær i den rigtige vognbane.


Fig. 5. Kemisk struktur af bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) og tværbindingsreaktion med epsilon aminogrupper i lysinrester i Strep-Tactin.

Figur 6
Fig. 6. Oprensning af twin-Strep-tagget grønt fluorescerende protein (GFP) på ikke-tværbundet og BS3-tværbundet Strep-Tactin polymethacrylatharpiks. To lige store mængder af humane embryonale nyre 293 celler, der udtrykker to-Strep-tagget GFP blev lyseret og tilsvarende behandlet under anvendelse af ovennævnte protokol, bortset fra, at i et tilfælde harpiksen er tværbundet med BS3 og i den anden BS3 har væreen substitueret med vand i tværbindingsreaktionen. Figuren viser en sølvfarvet SDS-polyacrylamidgel og anti-GFP immunoblot af oprensede proteiner. Bemærk, at nogle fald i proteinudbytte er uløseligt forbundet med oprensningsmetoder involverer kemisk krydsbinding, men dette opvejes af den højere prøve renhed på grund af fraværet af frigivet Strep-Tactin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ovennævnte protokol kan anvendes til at oprense enhver twin-Strep-mærket agn protein af interesse og dens tilhørende komplekser i en egnet buffer, der ikke indeholder biotin eller stærke denatureringsmidler. I den nuværende udgave af protokollen, er bindende og vask udføres under relativt strenge betingelser i tilstedeværelse af høje salt-og ikke-ionisk detergent. Selvom dette resulterer i mindre baggrund kan skrøbelige proteinkomplekser dissociere under disse betingelser. For at bevare sådanne lavere affinitet komplekser kan saltkoncentrationen sænkes og ikke-ionisk detergent kan reduceres eller udelades fra binding og vask buffere.

Den største fordel ved den to-Strep-tag system er den høje affinitet af den lille (3kDa) tandem tag til manipuleret streptavidin (Strep-Tactin) 1, 2, der tillader en effektiv ettrins-oprensning af target-proteiner og deres komplekser, selv i batch tilstand. På grund af den stærke binding af twin-Strep-tagtil Strep-Tactin kan harpiksen vaskes under moderat stringente betingelser, såsom høj rengøringsmiddel og / eller saltkoncentrationer, hvilket resulterer i højere målprotein renhed. Men sådan stærke binding har også sine ulemper. Selv i tilfælde af proteiner med et enkelt Strep-tag II (aminosyresekvens WSHPQFEK) kan konkurrencedygtig eluering fra harpiksen undertiden være svært. For eksempel desthiobiotin eluering af Strep (II)-mærket protein kinase, NtCDPK2 fra Strep-Tactin polymethacrylatharpiks med 10 mM viste sig at være mislykket, kræver denaturering eluering med SDS-prøvebuffer 6. Problemet blev løst efter desthiobiotin blev erstattet med stærkere konkurrerende biotin (10 mM), og eluering blev udført i 5 minutter med kraftig rystning 7. I tilfælde af to-Strep-tag, som har højere affinitet for Strep-Tactin kan målproteinet eluering være ufuldstændig, selv ved biotin koncentrationer så høje som 15 mM. Som vist i figur 3,kun en lille brøkdel af SIII-mærkede PVA VPG-Pro kan elueres fra Strep-Tactin harpiks med 15 mM biotin forhold til den mængde elueret med 1% SDS. Det er vigtigt at bemærke, at effektiviteten af ​​konkurrencedygtige eluering sandsynligvis også afhænger af arten af ​​det eluerede protein eller protein-kompleks. Større og mere hydrofobe proteiner kan sterisk hindrer adgangen til biotinbindingssitet lomme i Strep-Tactin, hvorved konkurrencedygtig eluering mindre effektiv. De ovennævnte ulemper undgås ved hjælp af eluering med SDS, men sådan eluering har sine egne problemer, primært centreret omkring det faktum, at eksponering for vaskemidler fører til dissociation af harpiks-koblede Strep-Tactin tetramere og forurening prøve med frigivet Strep-Tactin 8. Dette er demonstreret i figur 4 (venstre bane), der viser en betydelig mængde af Strep-Tactin frigivet efter inkubation af Strep-Tactin harpiks i elueringsbuffer indeholdende 1% SDS. En sådan forurening er uacceptabel, hvisprøven skal analyseres yderligere ved LC-MS/MS.

En effektiv løsning på det ovennævnte problem forureningen er stabiliseringen af harpiks-koblede Strep-Tactin tetramer 9 ved covalent tværbinding. Til dette formål har vi ansat en vandopløselig, ikke-spalteligt, homobifunktionelt aminreaktiv cross-linker BS3 med en historie af vellykket brug stabilisere protein strukturer 10-13. Figur 5 viser den kemiske formel for BS3 og sin cross-linking reaktion med frie epsilon aminogrupper af lysin i Strep-Tactin. Når harpiksen-koblede Strep-Tactin tetramer blev stabiliseret ved krydsbinding med BS3 blev problemet med forurening prøve med frigivet Strep-Tactin stort set elimineret (figur 4, højre bane). Da tværbindingen med BS3 ikke forårsager omfattende proteinaggregering 14, betyder det ikke reducere tilgængeligheden af biotinbindende lomme i streptavidin, hvilket gørtværbundet harpiks er egnet til oprensning af Strep-mærkede fusionsproteiner. Det skal imidlertid bemærkes, at kemisk tværbinding af proteiner med biologisk aktivitet (antistoffer, osv.) stabiliserer både aktive og inaktive protein konformationer, hvilket fører til en vis aktivitet tab. For eksempel veletableret immunpræcipitationsfremgangsmåden hjælp BS3 tværbundne antistoffer resulterer i en lavere målprotein udbytte i forhold til det, der opnås med ikke-tværbundne antistoffer 15. Ikke desto mindre er nogle tab af biologisk aktivitet anses for at være et acceptabelt trade-off for den forbedrede prøve renhed. Vi har observeret lignende resultater med BS3-krydsbundet Strep-Tactin harpiks. Den noget lavere Proteinudbyttet opnået med tværbunden harpiks blev mere end opvejet af den stærkt forbedret prøve renhed (figur 6).

En anden potentiel anvendelse af den foreslåede metode er rensning af Strep-mærkede membranproteiner solubilized med rengøringsmidler. Rengøringsmidler er afgørende for at holde sådanne hydrofobe proteiner og deres tilknyttede komplekser i opløsning, men deres tilstedeværelse kan føre til forurening prøve med Strep-Tactin frigivet fra affinitet harpiks. Et godt eksempel på dette er oprensning af en Strep (II)-mærket membranprotein NTT1 på Strep-Tactin perler med henblik på proteinkrystallisation 8. Tilstedeværelsen af detergent laurylamidodimethylpropylaminoxide (LAPAO) i elueringsbufferen førte til frigivelse af Strep-Tactin fra perlerne og den efterfølgende vækst af uønskede Strep-Tactin krystaller 8. Stabilisering af harpiks-koblede Strep-Tactin tetramer ved kovalent tværbinding kan give et effektivt middel til at overvinde dette problem.

Sammenfattende har kemisk tværbinding blevet anvendt til at overvinde de begrænsninger, der er forbundet med denaturering eluering fra Strep-Tactin harpiks. Denne fremgangsmåde er der opnået gode målprotein reselvopdagende uden at indføre forurening prøve. Den foreslåede metode kan således anvendes til at identificere specifikke bindende partnere twin-Strep-mærkede bait proteiner ved massespektrometri. Endvidere kan fremgangsmåden anvendes til at isolere og karakterisere nukleoprotein-komplekser, herunder reversibelt tværbundet med formaldehyd, samt membranproteiner som er solubiliseret med detergenter. Endelig er kemisk tværbinding ikke væsentligt de fysiske egenskaber af Strep-Tactin harpiks, hvilket gør den tværbundne harpiks potentielt egnet til high-throughput applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgements

Vi takker den tekniske support af Sini Miettinen, Minna Pöllänen og Taru Rautavesi. Vi takker Helka Nurkkala for at yde HEK 293 celler, der udtrykker twin-Strep-mærket GFP og Pekka Evijärvi for at yde lydoptagelse udstyr. Dette arbejde blev finansieret af Finlands Akademi, giver numrene 138.329, 134.684 og 258.978.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg Pierce/Thermo Scientific 21585 www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) IBA 2-1505 www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile Costar (Corning) 8163 www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes Costar (Corning) 3213 www.corning.com/lifesciences/
Avidin  IBA 2-0204 www.iba-lifesciences.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10, (8), 975-982 (1997).
  2. Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2, (6), 1528-1535 (2007).
  3. Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5, (5), 1199-1203 (2005).
  4. Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22, (2), 523-535 (2010).
  5. Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  6. Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55, (1), 135-147 (2004).
  7. Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146, (2), 418-430 (2008).
  8. Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68, (10), 1272-1277 (2012).
  9. Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, (7), 2190-2194 (1989).
  10. Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168, (6), 965-974 (2005).
  11. Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281, (50), 38266-38275 (2006).
  12. Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (9), (2010).
  13. Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
  14. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173, (3), 530-540 (2011).
  15. Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics