Author Produced

Ett-trinns Rensing av Twin-streptokokk-merket Proteiner og deres Komplekser for streptokokk-Tactin Resin tverrbundet Med Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En fremgangsmåte er beskrevet for effektiv rensing av en tvilling-Strep-merkede fusjonsproteiner og deres spesifikke komplekser på modifisert streptavidin (Strep-Tactin) harpiks kovalent kryssbundet med Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3). Fremgangsmåten har fordelen med høy hastighet, god målprotein utvinning og høy renhet, og er forenlig med etterfølgende analyse ved massespektrometri.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ivanov, K. I., Bašić, M., Varjosalo, M., Mäkinen, K. One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3). J. Vis. Exp. (86), e51536, doi:10.3791/51536 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Affinitetsrensing av streptokokk-merkede fusjonsproteiner på harpiks bærer en konstruert streptavidin (Strep-Tactin) har blitt en mye brukt metode for isolering av protein komplekser under fysiologiske forhold. Fusjon proteiner inneholder to kopier av streptokokk-tag II, utpekte twin-streptokokk-tag eller SIII-tag, har fordelen av høyere affinitet for streptokokk-Tactin sammenlignet med dem som bare inneholder en enkelt Strep-tag, og dermed gir mer effektiv protein rensing. Imidlertid er denne fordel oppveies av det faktum at eluering av tvilling-Strep-merkede proteiner med biotin kan være ufullstendig, noe som fører til lav proteingjenvinning. Utvinningen kan bli dramatisk forbedret ved bruk av denaturerende eluering med natriumdodecylsulfat (SDS), men dette fører til forurensning av prøven med Strep-Tactin frigjøres fra harpiksen, noe som gjør analysen uforenlig med nedstrøms proteomikk analyse. For å overkomme denne begrensningen, har vi utviklet en metode der harpiks-coupled tetramer av streptokokk-Tactinblir først stabilisert ved kovalent tverrbinding med Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) og den resulterende tverrbundne harpiks blir så brukt til å rense mål-protein komplekser i en enkel batch-rensetrinn. Effektiv eluering med SDS sikrer god proteingjenvinning, mens fraværet av forurensende Strep-Tactin tillater nedstrøms protein-analyse ved massespektrometri. Som et bevis på konseptet, beskriver vi her en protokoll for rensing av SIII-merket viral protein VPG-Pro fra kjerner av virusinfisert N. benthamiana planter ved hjelp av streptokokk-Tactin polymethacrylate harpiks tverrbundet med BS3. Den samme protokoll kan benyttes for å rense ethvert tvilling-Strep-merket protein av interesse og å karakterisere dets fysiologiske bindingspartnere.

Introduction

I de senere årene har streptokokk-tag teknologien blitt mye brukt i mange områder av biomedisinsk forskning, inkludert proteomikk og strukturbiologi. Dette proteinet renseteknologi, som er avhengig av sammensmeltingen av rekombinante proteiner til en kort streptokokk-tag peptid, har modnet med bruk av affinitet matriser bærer streptokokk-Tactin, en genmodifisert variant av streptavidin med forbedret peptid bindingskapasitet. 1, 2 fusjon proteiner inneholder to kopier av streptokokk-tag II, utpekte twin-streptokokk-tag eller SIII-tag, utstillings en høyere affinitet for streptokokk-Tactin matriser enn de som inneholder bare en enkelt Strep-tag, noe som sikrer mer effektiv rensing av rekombinante proteiner og tilhørende bindende partnere. Imidlertid har høyere affinitet for twin-streptokokk-merkede proteiner til streptokokk-Tactin også sine ulemper. Kompetitiv eluering av slike proteiner med overskudd biotin kan være ufullstendig, noe som fører til redusert målprotein utbytte. En more effektiv alternativ er eluering med SDS, men det fører til uønsket forurensning av prøven med Strep-Tactin frigjøres fra harpiksen, noe som gjør analysen uforenlig med proteomikk analyse. Dette papir presenterer en teknikk for å overvinne denne begrensningen ved først å stabilisere harpiksen koplet tetramer av Strep-Tactin ved kjemisk tverrbinding, og deretter ved hjelp av SDS for å eluere twin-Strep-merkede proteiner og deres tilhørende kompleksene fra den resulterende tverrbundne harpiks. Således kan tilstrekkelig protein utbytte oppnås uten kontaminering av prøver med Strep-Tactin, for derved å tillate ytterligere analyse ved massespektrometri.

Fremgangsmåten er egnet for rensing av en hvilken som helst rekombinant fusjonsprotein med et overflateeksponert SIII-taggen tre-eller tvilling-Strep-tag (aminosyresekvens WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK og SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, henholdsvis). Proteinet kan være av animalsk, plante eller bakteriell opprinnelse, og kan isoleres fra enten total cellelysatet eller beriket organelle brøkdel. Som et eksempel, beskrives her for rensing av en SIII-kodet protein VPG-Pro for potetvirus A (PVA) 4 fra atomfraksjonen av PVA-infiserte Nicotiana benthamiana planter. Atom fraksjonen ble isolert som tidligere beskrevet 5, med de følgende modifikasjoner: celler ble ikke behandlet med formaldehyd, er natrium-butyrat substituert i alle buffere med 5 mM natriumfluorid, var komplett protease-inhibitor substituert med PMSF, Triton X-100 konsentrasjonen i ekstraksjon buffer nr. 2 ble senket til 0,3% (v / v), og den nukleære pellets erholdt ved sentrifugering gjennom sucrose pute (ekstraksjon buffer nr. 3) ble på nytt oppslemmet i 1,45 ml av pre-kjølt bindingsbuffer og rotert i 1,5 timer ved 4 ° C. Den resulterende atom ekstrakt inneholder SIII-merket agn protein og tilhørende komplekser (agn protein utvalget) ble behandlet i henhold til protokollen beskrevet nedenfor (se punkt 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Cross-linking av streptokokk-Tactin polymethacrylate Resin med Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3)

  1. Stabil en forseglet mikrorør inneholdende 2 mg av BS3 tverrbinder til romtemperatur. FORSIKTIG: BS3 er et farlig stoff. Bruk hansker og vernebriller.
  2. Resuspender Strep-Tactin polymetakrylat-harpiks (50% suspensjon i 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) ved et kort kraftig risting og umiddelbart overføre 600 ul av suspensjonen til en spin-kolonnen ved hjelp av en pipettespiss med slutten avskåret.
  3. Sentrifuger ved 1500 x g i 30 sekunder ved romtemperatur. Kast gjennomstrømning og tilsett 450 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) til kolonnen.
  4. Gjenta forrige trinn to ganger for å erstatte tris-buffer med PBS, og la harpiksen i 430 ul PBS justert til pH 8,0 etter den siste sentrifugering.
  5. Punkter folie av micro med BS3 med en pipette tips som inneholder 1001, l av ultrarent vann. Oppløs BS3 pulver i vann ved forsiktig pipettering opp og ned og straks tilsett 20 pl av oppløsningen av spinnkolonne. Den endelige konsentrasjonen av BS3 i det tverrbindende reaksjons er ~ 1,2 mM.
  6. Drei-kolonnen i 30 minutter ved romtemperatur. Kontroller at harpiksen blandes på riktig måte med BS3 løsning.
  7. For å stanse reaksjonen, tilsett 6 mL 3M Tris-HCl, pH 7,5 og rotere søylen i ytterligere 15 min ved romtemperatur.
  8. Sentrifuger ved 1500 x g i 30 sekunder ved romtemperatur. Kast gjennomstrømning og resuspender den tverrbundne harpiks i 450 ul Tris bufret saltvann med Tween 20 (TBST). Gjenta sentrifugeringen og vaskefremgangsmåten to ganger til. I det siste trinnet, resuspender harpiksen i 450 ul TBS.
  9. Overfør harpiksen suspensjonen til et nytt rør ved hjelp av en pipettespiss med enden avskåret. Resuspender harpiksen igjen i kolonnen med ytterligere 450 ul TBS og overføring til det samme røret. Gjenta the siste trinn en gang til for å sikre maksimal overføring av harpiksen fra kolonnen til røret.
  10. La røret stå i 10 min ved romtemperatur og justere volumet til 600 pl ved å fjerne overskytende TBS. Harpiksen er klar for umiddelbar bruk (anbefales), eller kan lagres ved 4 ° C, uten å fryse.

2. Binding av Twin-streptokokk-merket Bait Protein og Associated Komplekser til tverrbundet Strep-Tactin polymethacrylate Resin

  1. Sentrifuger 1 ml av agnet proteinprøven i bindingsbuffer ved 17 000 xg i 10 min ved 4 ° C og supernatanten overføres til et nytt rør.
  2. For å redusere binding av biotinylerte endogene proteiner til Strep-Tactin harpiksen, legg avidin til en endelig konsentrasjon på 100 pg / ml og roterer i 15 min ved 4 ° C.
    1. Dersom den tverrbundne harpiks fra trinn 1.10 har vært lagret i lengre tid ved 4 ° C, samle harpiksen ved sentrifugering ved 400 xg for 1 min ved 4 ° C, supernatanten kastes og vaske resinet med 1 ml TBST. Gjenta sentrifugeringen og vaske trinn to ganger, først med TBST og deretter med TBS. Sentrifuger røret ved 400 x g i 1 minutt ved 4 ° C og justeres til det opprinnelige volum ved å fjerne overskytende TBS.
  3. Resuspender kryssbundne Strep-Tactin harpiks ved virvling. Umiddelbart tilsett 50 pl av harpiksen suspensjonen til røret som inneholder agn proteinprøven ved hjelp av et kutt pipettespissen og roterer ytterligere 30 min ved 4 ° C.
  4. Mens man venter, sett Thermo til 55 ° C og forvarme 500 pl elueringsbuffer for anvendelse i trinn 3.1.
  5. Sentrifuger ved 400 x g i 1 minutt ved 4 ° C. Kast supernatanten og vask harpiksen på en rotator i 5 min ved 4 ° C med 1 ml av pre-kjølte vaskebuffer 1. Gjenta sentrifugeringen og vaske trinn tre ganger. I det siste trinnet, resuspender harpiksen i 250 pl vaskebuffer 2.
  6. Tr ansfer harpiksen suspensjonen til en frisk spinn kolonne. Resuspender harpiks som er igjen i røret i en annen 250 pl vaskebuffer som nr. 2 og overføre til den samme kolonne.
  7. Sentrifuger ved 400 x g i 3 min ved 4 ° C, kastes gjennomstrømning og overføre kolonnen til en frisk delfin-nose 2 ml rør. Går umiddelbart videre til elueringstrinnet nedenfor.

Tre. Elusjon av bestemt protein komplekser

  1. Tilsett 150 pl av forvarmet elueringsbuffer fra trinn 2,4 til spinnkolonne.
  2. Inkuber i Thermo for 5 min ved 55 ° C, rist ved 1400 rpm.
  3. Sentrifuger ved 1500 x g i 1 min ved romtemperatur.
  4. Kast kolonnen og lagre de rensede målproteiner ved ≤ -20 ° C.
0 "> x "> 550 mM 2 "height =" 20 "style =" height: 20px; width: 597px; "> elueringsbuffer
Fosfatbufret saltvann (PBS)
Na 2 HPO 4 10 mM
KH 2 PO 4 2mM
NaCl 137 mM
KCl 2,7 mM
pH ble justert til 7,4 med mindre annet er angitt (pH 8,0 i avsnitt 1.4)
Tris-bufret saltvann (TBS)
Tris-HCl, pH 7.4 50 mM
ght = "20" style = "height: 20px; width: 299px;"> NaCl 150 mM
Tris buffered saltløsning med Tween 20 (TBST)
Tris-HCl, pH 7.4 50 mM
NaCl 150 mM
Tween 20 0,1% (v / v)
Bindingsbuffer
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl
NaF 5 mM
EDTA 0,5 mM
Glyserol 10% (v / v)
PMSF 0,1 mM
Vask buffer # 1
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl 500 mM
NaF td> 5 mM
EDTA 0,4 mM
Igepal CA-630 0,2% (v / v)
Glyserol 5% (v / v)
PMSF 0,1 mM
Vask buffer # 2
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl 150 mM
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
SDS 1% (vekt / volum)

Tabell 1.. Buffere som brukes i den foreliggende studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rensefremgangsmåten er skjematisk vist i figur 1, sammen med en representasjon av problemer forbundet med andre eksisterende rensemetoder.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk fremstilling av renseprosedyren. Arbeidsflyten omfatter stabilisering av harpiks-koblet Strep-Tactin tetramer via kovalent tverrbinding med BS3, binding av tvilling-Strep-merket protein som åte og tilhørende kompleksene til den tverrbundne harpiks , bortvasking av ubundet protein, denaturerende eluering av spesifikt bundet protein-komplekser med 1% SDS, og deres analyse ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS). To røde kuler i agn protein betegne twin-streptokokk-tag. Begrensninger av andre rensemetoder er vist i innfeltboksene til høyre. De omfatter ufullstendig eluering av målproteiner med biotin og prøvekontaminering med streptokokk-Tactin følgende denaturering eluering med 1% SDS.

Typiske resultater av SIII-merket protein-rensing ved hjelp av BS3-tverrbundet Strep-Tactin polymetakrylat-harpiks og denaturerende eluering med 1% SDS som vist i figur 2.. 10% (15 ul) sentrifuge kolonne-eluatet inneholdende renset SIII-tagged PVA VPG-Pro og assosierte proteiner ble analysert ved SDS-PAGE etterfulgt av sølvfarging. Fraværet av 52 kDa bånd tilsvarende PVA VPG-Pro i den negative kontrollen kjørefelt bekreftet spesifisiteten av pull-ned. 40 ul gjenværende spinnkolonne eluat av ble påført på en keratin-fri SDS gel og det tilsvarende felt ble skåret ut og de inneholdte proteiner ble fordøyd med trypsin og analysert ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Den massespektrometri analyse identifisert viral RNA-dependent RNA polymerase (replicase) NIB som samspill partner av VPG-Pro. Flere tryptic peptider som tilsvarer NIB ble påvist i alle fire biologiske duplikater av affinitetsrensing og ingen i de fire kontrollene uttrykker VPG-Pro uten SIII-tag, bekrefter spesifisitet for interaksjon. På grunn av at molekylvekten til hake (59 kDa) er nær den av SIII-merket VPG-Pro (52 kDa), de to proteinene viste seg som et dobbelt bånd på SDS-PAGE-analyse (figur 2, pilspiss). Til sammen resultatene beskrevet ovenfor gir eksperimentelle bevis for at affinitetsrensing på streptokokk-Tactin harpiks kovalent kryssbundet med BS3 kan med hell benyttes til å isolere twin-streptokokk-merkede proteiner og identifisere deres fysiologiske bindende partnere ved massespektrometri.

Fig. 2
SIII-merket PVA VPG-Pro og dets bindingspartner PVA nib on Strep-Tactin polymetakrylat-harpiks tverrbundet med BS3. Figuren viser en sølvfarget SDS-polyakrylamid-gel av eluater fra det tverrbundne perler. Nib ble identifisert ved massespektrometri som en bindingspartner av VPG-Pro ved hjelp av en alikvot av den samme prøven. SIII-merket PVA VPG-Pro (spådd MW: 52 kDa) og NIB (spådd MW: 59 kDa) vandrer som en dobbel band, angitt med en pilspiss. Negativ kontroll (central kjørefelt) tilsvarer rensing fra celler infisert med viruset uttrykker VPG-Pro uten SIII-tag.

Figur 3
Figur 3. Biotin eluering av SIII-merket PVA VPG-Pro fra streptokokk-Tactin polymethacrylate harpiksufullstendig sammenlignet med eluering med 1% SDS. Figuren viser en anti-VPG immunoblot av eluater fra Strep-Tactin perler. Perlene ble eluert med enten 15 mM biotin eller med 1% SDS. Forskjellen i signalintensitet reflekterer forskjellige protein utbytter som oppnås med de to elueringsmetoder. Negative kontroller tilsvarer renselser fra celler infisert med viruset uttrykker VPG-Pro uten SIII-tag.

Figur 4
Figur 4. Covalent kryss kobling med BS3 forhindrer utgivelsen av streptokokk-Tactin fra harpiks under SDS eluering. Figuren viser en sølv-farget gel av SDS eluatene fra ikke-tverrbundet (venstre felt) og BS3-cross-linked (høyre felt) Strep-Tactin polymethacrylate harpiks. Legg merke til tilstedeværelsen av utgitt Strep-Tactin i venstre kjørefelt, men dens fravær i høyre felt.


Figur 5. Kjemisk struktur av Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) og den tverrbindende reaksjon med epsilon-aminogrupper i lysin-rester i Strep-Tactin.

Figur 6
Figur 6. Rensing av twin-streptokokk-merket grønt fluorescerende protein (GFP) på ikke-kryssbundet og BS3-tverrbundet Strep-Tactin polymethacrylate harpiks. To like mengder humane embryonale nyre 293 celler uttrykker twin-streptokokk-merket GFP ble lysert, og likeledes behandles ved hjelp av ovennevnte protokoll, bortsett fra at i ett tilfelle harpiksen er blitt tverrbundet med BS3 og i den andre BS3 har blino substituert med vannet i den tverrbindende reaksjon. Figuren viser en sølvfarget SDS-polyakrylamid-gel-og anti-GFP immunoblot av rensede proteiner. Legg merke til at en del reduksjon i proteinutbyttet er iboende i rensemetoder involverer kjemisk kryssbinding, men dette kompenseres av den større prøve renhet på grunn av fravær av frigjort Strep-Tactin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ovennevnte protokollen kan brukes for å rense alle tvilling-Strep-merket agn protein av interesse og dens tilhørende kompleksene i en hvilken som helst egnet buffer som ikke inneholder biotin eller sterke denatureringsmidler. I den nåværende versjonen av protokollen, binding og vasking utføres under relativt strenge vilkår i nærvær av høy salt og ikke-ionisk vaskemiddel. Selv om dette resulterer i mindre bakgrunn, kan skjøre proteinkomplekser dissosiere under disse forhold. For å ta vare på slike lavere affinitet komplekser, kan saltkonsentrasjonen senkes og ikke-ionisk tensid kan reduseres eller utelates fra binding og vaskebuffere.

Den største fordelen med twin-streptokokk-tag-systemet er den høye affinitet av den lille (3kDa) tandem tag til konstruert streptavidin (Strep-Tactin) 1, 2, slik at effektiv ett-trinns rensing av target proteiner og deres komplekser selv i batch modus. På grunn av den sterke binding av twin-streptokokk-tagtil Strep-Tactin, kan harpiksen skylles under moderat stringente betingelser, slik som høy vaske-og / eller saltkonsentrasjon, noe som resulterer i høyere målprotein renhet. Imidlertid har en slik sterk binding også sine ulemper. Selv i tilfelle av proteiner med en enkelt Strep-tag II (aminosyresekvens WSHPQFEK), kan det konkurrerende eluering fra harpiksen noen ganger være vanskelig. For eksempel eluering av en Strep (II)-kodet protein kinase, NtCDPK2, fra Strep-Tactin polymetakrylat-harpiks med 10 mM desthiobiotin viste seg å være mislykket, noe som krever denaturering eluering med SDS-prøvebuffer 6.. Problemet ble løst først etter desthiobiotin ble erstattet med sterkere konkurrerende biotin (10 mM), og eluering ble utført i 5 minutter med kraftig risting 7. I tilfellet med de to-Strep-tag, som har høyere affinitet for Strep-Tactin, kan målprotein eluering være ufullstendig selv ved biotin-konsentrasjoner så høye som 15 mM. Som vist i figur 3,Bare en liten brøkdel av SIII-merket PVA VPG-Pro kunne elueres fra Strep-Tactin harpiksen med 15 mM biotin i forhold til mengden eluert med 1% SDS. Det er viktig å merke seg at effektiviteten av konkurrerende eluering sannsynlig er også avhengig av arten av den eluerte protein-eller protein-komplekset. Større og mer hydrofobe proteiner kan sterisk hindre tilgjengeligheten av biotin bindende lomme i Strep-Tactin, og dermed gjør konkurranse eluering mindre effektiv. De ovennevnte ulemper unngås ved hjelp av eluering med SDS, men en slik eluering har sine egne problemer, hovedsakelig kretser rundt det faktum at eksponering for vaskemidler fører til dissosiasjon av de harpiksbelagte koplet Strep-Tactin tetramerer og prøvekontaminering med utgitt Strep-Tactin 8.. Dette er vist i figur 4 (venstre felt), noe som viser en betydelig mengde av Strep-Tactin slippes etter inkubering av Strep-Tactin harpiksen i elueringsbuffer inneholdende 1% SDS. Slik forurensning er uakseptabelt hvisprøven må bli ytterligere analysert ved LC-MS/MS.

En effektiv løsning på de ovennevnte forurensningsproblem er stabilisering av harpiks-koblet Strep-Tactin tetramer 9 ved kovalent tverrbinding. For dette formål anvendes vi et vannoppløselig, ikke-spaltbar, homobifunctional amin-reaktiv tverrbinder BS3 med en historie med vellykket bruk i å stabilisere proteinstruktur 10-13. Figur 5 viser den kjemiske formel BS3 og dets tverrbinding reaksjon med gratis Epsilon aminogruppene av lysin i Strep-Tactin. Når harpiks-koblet Strep-Tactin tetramer ble stabilisert ved tverrbinding med BS3, ble problemet med kontaminering av prøver med utgitt Strep-Tactin talt eliminert (figur 4, høyre felt). Fordi kryssbinding med BS3 ikke medfører omfattende proteinaggregering 14, betyr det ikke redusere tilgjengeligheten av biotin bindende lomme i streptavidin, noe som gjør dettverrbundet harpiks egnet for rensing av Strep-merkede fusjonsproteiner. Det bør imidlertid bemerkes, at kjemisk tverrbinding av proteiner med biologisk aktivitet (antistoffer, osv.) stabiliserer både aktive og inaktive protein konformasjoner, som fører til en viss aktivitetstapet. For eksempel er veletablert metode ved hjelp av immunoutfelling BS3-tverrbundne antistoffer frembringer en lavere målprotein utbytte sammenlignet med det som oppnås med ikke-tverrbundne antistoffer 15. Ikke desto mindre er noe tap av biologisk aktivitet anses å være en akseptabel avveining for det forbedrede prøve renhet. Vi har observert lignende resultater med BS3-tverrbundet Strep-Tactin harpiks. Den noe lavere protein utbytte oppnådd med den tverrbundne harpiks ble mer enn kompensert av den sterkt forbedret prøve renhet (figur 6).

En annen potensiell anvendelse av den foreslåtte metoden er i rensing av streptokokk-merkede membran proteiner solubilized med vaskemidler. Vaskemidler er avgjørende for å holde slike hydrofobe proteiner og deres tilhørende komplekser i oppløsning, men deres tilstedeværelse kan føre til forurensning av prøven med Strep-Tactin frigjøres fra affinitets-harpiks. Et godt eksempel på dette er rensing av et Strep (II)-kodet membranprotein Ved NTT1 on Strep-Tactin perler i den hensikt å protein krystallisering 8.. Tilstedeværelsen av vaskemiddel laurylamidodimethylpropylaminoxide (LAPAO) i elueringsbufferen førte til frigjøring av Strep-Tactin fra kulene og påfølgende vekst av uønskede Strep-Tactin krystaller 8. Stabilisering av harpiks-koblet Strep-Tactin tetramer ved kovalent tverrbinding kan gi et effektivt middel for å overvinne dette problemet.

Sammenfatningsvis er kjemisk tverrbinding blitt anvendt for å overvinne de begrensninger som er forbundet med denaturerende eluering fra Strep-Tactin harpiks. Denne tilnærmingen bidro oppnå god målprotein reCovery uten å innføre prøvekontaminering. Den foreslåtte fremgangsmåte kan således anvendes for å identifisere spesifikke bindingspartnere av tvilling-Strep-merkede agn proteiner ved massespektrometri. Videre kan fremgangsmåten bli anvendt til å isolere og karakterisere nukleoprotein komplekser, inkludert de som er reversibelt kryssbundet med formaldehyd, samt membranproteiner oppløseliggjort med vaskemidler. Til slutt blir kjemisk tverrbinding ikke vesentlig endrer de fysiske egenskapene til Strep-Tactin harpiks, slik at den tverrbundne harpiks potensielt egnet for høy gjennomstrømning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Vi erkjenner takknemlig teknisk støtte av Sini Miettinen, Minna Pöllänen og Taru Rautavesi. Vi takker Helka Nurkkala for å gi HEK 293 celler uttrykker twin-streptokokk-merket GFP og Pekka Evijärvi for å gi lyd opptaksutstyr. Dette arbeidet ble finansiert av Academy of Finland, gi tall 138329, 134684 og 258978.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg Pierce/Thermo Scientific 21585 www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) IBA 2-1505 www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile Costar (Corning) 8163 www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes Costar (Corning) 3213 www.corning.com/lifesciences/
Avidin  IBA 2-0204 www.iba-lifesciences.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10, (8), 975-982 (1997).
  2. Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2, (6), 1528-1535 (2007).
  3. Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5, (5), 1199-1203 (2005).
  4. Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22, (2), 523-535 (2010).
  5. Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  6. Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55, (1), 135-147 (2004).
  7. Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146, (2), 418-430 (2008).
  8. Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68, (10), 1272-1277 (2012).
  9. Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, (7), 2190-2194 (1989).
  10. Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168, (6), 965-974 (2005).
  11. Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281, (50), 38266-38275 (2006).
  12. Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (9), (2010).
  13. Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
  14. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173, (3), 530-540 (2011).
  15. Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics