Author Produced

Tek aşamalı Strep-taktin Reçine Bis (sülfosuksinimidil) ile çapraz bağlanmış suberat (BS3) hakkında Çift Strep-etiketli proteinler ve komplekslerinin saflaştırılması

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bir yöntem olup (Strep-taktin) reçinesi kovalent Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ile çapraz bağlanmış, modifiye edilmiş streptavidin ile ilgili çift-Strep-etiketli füzyon proteinleri ve bunların özel komplekslerinin etkin arıtma için açıklanmıştır. Bir yöntem hızlı hızlı, iyi bir hedef protein geri kazanımı ve yüksek saflıkta avantajları vardır ve kütle spektrometresi ile bir sonraki analiz ile uyumludur.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ivanov, K. I., Bašić, M., Varjosalo, M., Mäkinen, K. One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3). J. Vis. Exp. (86), e51536, doi:10.3791/51536 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Işlenmiş bir streptavidin (Strep-taktin) taşıyan reçineleri Strep-etiketli füzyon proteinlerinin afinite saflaştırılması, fizyolojik koşullar altında, protein kompleksleri izolasyonu için yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir. Çift-Strep-etiket ya da SIII-etiketi belirlenmiş Strep-etiketi II iki kopyasını ihtiva eden füzyon proteinleri, böylece daha etkili bir protein arıtma sağlayan, tek bir Strep-etiketi ihtiva eden kıyasla Strep-taktin için daha yüksek afinite avantajına sahiptir. Ancak bu avantaj biyotin ile çift-Strep ile işaretlenmiş olan proteinlerin elüsyon düşük protein geri kazanımı yol açan, eksik olabilir gerçeği ile dengelenir. Kurtarma önemli ölçüde sodyum dodesil sülfat (SDS) ile denatüre elüsyonu kullanılarak geliştirilebilir, ancak bu alt-proteomik analizi ile tahlil uyumsuz hale reçineden serbest Strep-taktin bulaşmasını örnek yol açar. Bu sınırlamayı aşmak için, bir yöntem Strep-taktin bu sayede, reçine-birleştiğinde tetramerdir geliştirdikilk kovalent Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ile çapraz bağlama ile elde edilen çapraz bağlanmış Reçine daha sonra, bir tek partili saflaştırma adımında, hedef protein komplekslerinin saflaştırılması için kullanılan ile stabilize edilir. Strep-taktin kontamine olmaması kütle spektrometresi ile aşağı protein analizine olanak verirken SDS verimli yıkama, iyi bir protein iyileşme sağlar. Kavramının bir kanıtı olarak, virüs bulaşmış N. çekirdeklerden VPg-Pro SIII-etiketli viral proteinin saflaştırılması için burada bir protokol açıklar BS3 ile çapraz bağlanmış Strep-taktin polimetakrilat reçine kullanılarak benthamiana bitkileri. Aynı protokol, ilgi duyulan herhangi bir çift-Strep-etiketli proteinin saflaştırılması ve bunun fizyolojik bağlanma ortakları karakterize etmek için kullanılabilir.

Introduction

Son yıllarda, Strep-etiket teknolojisi proteomik ve yapısal biyoloji dahil olmak üzere biyomedikal araştırmanın birçok alanda yaygın olarak kullanılır hale gelmiştir. Kısa bir Strep-eklentisi peptide rekombinant proteinlerin füzyon dayanır Bu protein saflaştırma tekniği, Strep-taktin, geliştirilmiş peptid-bağlama kapasiteli streptavidin bir varyantını taşıyan genetik olarak benzer matrislere gelişine olgunlaşmıştır. 1, 2 çift-Strep-eklentisi veya SIII-eklentisi, sergi rekombinant proteinlerin daha etkili bir temizlik sağlanması, sadece tek bir Strep-etiketi ihtiva eden daha Strep-taktin matrisler için daha yüksek bir afinite ve belirlenmiş Strep-etiketi II iki kopyasını ihtiva eden füzyon proteinleri ilişkili bağlama ortakları. Bununla birlikte, Strep-taktin için çift-Strep-etiketli proteinlerinin daha yüksek afinite da yanları vardır. Fazla biotin ile bu tür proteinlerin Rekabetçi elüsyon hedef protein verimi azalmasına yol, eksik olabilir. A mcevher Diğer alternatif SDS ile yıkama, ancak proteomik analizi ile tahlil uyumsuz hale reçineden serbest Strep-taktin ile istenmeyen örnek kirlenmesine yol açar. Bu çalışma, birinci kimyasal çapraz bağlama ile Strep-taktin reçine çiftli tetramer stabilize etme ve daha sonra elde edilen çapraz bağlanmış reçinenin ikinci çift-Strep-etiketli proteinleri ve ilgili kompleksleri elüt edilmesi için SDS kullanarak bu sınırlamanın üstesinden gelmek için bir yöntem sunar. Bu nedenle, yeterli bir protein verimi ve böylece kütle spektrometresi ile daha fazla analiz sağlayan, Strep-taktin numune kirlenme olmadan elde edilebilir.

Yöntem, bir yüzey-açık-etiket SIII 3 ya da çift-Strep-etiketi (amino asit sekansı WSHPQFEK (GGGS) sırasıyla 3 ve WSHPQFEK SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK) ile herhangi bir rekombinant füzyon proteininin saflaştırılması için uygundur. Protein, hayvan, bitki veya bakteri kaynaklı olabilir ve toplam hücre ya da izole edilebilirlizatı veya organel zenginleştirilmiş fraksiyon. Bir örnek olarak, burada PVA ile enfekte edilmiş Nicotiana benthamiana bitkilerinin nükleer fraksiyondan Potato Virüs A (PVA) 4 bir SIII etiketli protein VPg-Pro saflaştırılmasını anlatmaktadır. Daha önce, aşağıdaki modifikasyonlar ile, tarif edildiği gibi, 5 nükleer fraksiyon izole edilmiştir: hücre formaldehit ile tedavi edildi, sodyum bütirat 5 mM sodyum fluorür Tüm tamponlar içinde ikame edilmiş, tam proteaz inhibitör PMSF ile ikame edilmiş, ekstre içinde Triton X-100 konsantrasyonu tampon # 2% 0.3 'e düşürülmüştür (v / v) ve (ekstraksiyon tampon # 3) sakroz yastığı içinden santrifüjleme ile elde edilen nükleer pelet önceden soğutulmuş bağlanma tamponu içinde 1.45 ml içinde yeniden süspansiye edildi ve 4 ° C' de 1.5 saat boyunca döndürülür SIII-etiketli yem protein ve ilişkili kompleksler (yem protein örneği) ihtiva eden ortaya çıkan çekirdek ekstraktı, (bakınız bölüm 2), aşağıda tarif edilen protokole göre işlenmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Bis ile Strep-taktin polimetakrilat reçine (sülfosuksinimidil) çapraz bağlanması, suberat (BS3)

  1. Oda sıcaklığına BS3 çapraz bağlayıcı içeren 2 mg bir sızdırmaz mikrotüp dengelenmesi. DİKKAT: BS3 tehlikeli bir maddedir. Koruyucu eldiven ve gözlük takın.
  2. Strep-taktin süspanse polimetakrilat reçine (100 mM Tris-HCI, pH 8.0 içinde% 50 süspansiyon, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) ile çalkalanarak kısa ve hemen bir pipet kullanarak bir döndürme kolonuna süspansiyonu 600 ul transfer uç kesti.
  3. Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1500 x g'de santrifüjleyin. Akış yoluyla atın ve sütun fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 450 ul ekleyin.
  4. Tamamen PBS ile Tris tamponu değiştirmek ve son santrifüj sonra pH 8.0 'e ayarlandı 430 ul PBS içindeki reçineyi bırakmak için önceki aşamada, 2 kez daha tekrarlayın.
  5. 100 ihtiva eden bir pipet ucu ile BS3 ile mikrotüp folyo delinme1, ultra saf su l. Hafifçe aşağı ve yukarı pipetlenerek su içinde çözülür ve toz BS3 hemen döndürme kolonuna çözeltisinin 20 ul ekle. Çapraz bağlama reaksiyonunda BS3 nihai konsantrasyon ~ 1.2 mM'dir.
  6. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sütunu döndürün. Reçine BS3 çözeltisi ile düzgün karışık olduğunu kontrol edin.
  7. Reaksiyonu söndürmek için, 3M Tris-HCI, pH 7.5, 6 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika daha sütunu döndürün.
  8. Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1500 x g'de santrifüjleyin. Akış yoluyla uzaklaştırılır ve Tris içinde 450 ul çapraz bağlı reçine tekrar süspansiyon Tween 20 (TBST) ile tamponlu tuz. Tekrar santrifüj ve adımları iki kez yıkayın. Son adımda, TBS içinde 450 ul reçine tekrar süspansiyon.
  9. Sonu ile bir pipet kullanarak yeni bir tüp reçine süspansiyonu aktarın kesti. TBS başka bir 450 ul sütunda kalan reçine yeniden süspanse edin ve aynı tüpe aktarın. Tekrar incibir kez daha tüp sütundan reçinenin en transferini sağlamak için son adım e.
  10. Tüp oda sıcaklığında 10 dakika boyunca durmak ve aşırı TBS kaldırarak 600 ul seviyesini ayarlamak olsun. Reçine (önerilen) hemen kullanıma hazır ya da dondurma olmadan 4 ° C'de saklanabilir.

2.. Çapraz bağlı Strep-taktin polimetakrilat reçine için Çift-Strep-etiketli Protein yem ve İlişkili Kompleksleri bağlanması

  1. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 17,000 x g ve bağlama tamponu, yeni bir tüpe transfer süpernatantı yem protein örneğinin Santrifüj 1 mi.
  2. , Strep-taktin reçineye biyotinile endojen proteinlerin bağlanma en aza indirmek 100 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar avidin ekleyin ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca döndürmek için
    1. Adım 1.10 arasındaki çapraz bağlı reçinesi, 4 ° C de, uzun bir süre boyunca depolanmış olması durumunda, 400 x g'da santrifüjleme ile fo reçine toplamak4 ° C'de 1 dakika r, süpernatantı atmak ve TBST içinde 1 ml reçine yıkayın. Tekrar santrifüj ve yıkama birinci TBST ile ve daha sonra TBS ile iki kez daha, adım. 4 ° C'de 1 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj tüpü ve fazla TBS kaldırarak, orijinal hacme ayarlayın.
  3. Vorteks ile çapraz bağlanmış Strep-taktin reçine yeniden süspanse edin. Derhal bir kesim pipet kullanarak yem protein örneği içeren tüpe reçine süspansiyonu 50 ul ekleyin ve 4 ° C'de başka bir 30 dakika boyunca döndürmek
  4. Beklerken, 55 ° C'ye ayarlanmış Thermomixer ve aşama 3.1 'de kullanım için elüsyon tamponunun 500 ul ön ısıtma.
  5. 4 ° C'de 1 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje Süpernatant atılır ve önceden soğutulmuş yıkama tamponu # 1 ve 1 ml 4 ° C'de 5 dakika boyunca bir karıştırıcı üzerine reçine yıkayın. Santrifüj adımları tekrarlayın ve üç kez yıkayın. Son adımda, yıkama tamponu # 2 250 ul içindeki reçineyi tekrar süspansiyon.
  6. Tr taze bir spin kolon için reçine süspansiyon ansfer. Yıkama tampon # 2'nin bir 250 ul tüp içinde kalan reçine yeniden süspanse edin ve aynı sütuna transfer.
  7. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin, akış-through atın ve yeni bir yunus burun-2 ml tüp sütunu aktarın. Aşağıdaki yıkama aşamasından hemen geçin.

Özgül Protein Komplekslerinin 3. Elüsyonu

  1. Döndürme kolonuna aşama 2.4 'ten önceden ısıtılmış elüsyon tamponu 150 ul ekle.
  2. 1400 rpm'de çalkalanarak, 55 ° C'de 5 dakika boyunca Thermomixer inkübe edin.
  3. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleyin.
  4. Sütunu atın ve ≤ -20 ° C'de saflaştırılmış hedef proteinlerin depolamak
0 "> x; "> 550 mM 2 "height =" 20 "style =" height: 20px; width: 597px; "> Yıkama tamponu
Fosfat tamponlu tuz (PBS)
Na 2 HPO 4 10 mM
KH 2 PO 4 2mm
NaCl 137 mM
KCl 2.7 mM
(bölüm 1.4 pH 8,0), aksi belirtilmedikçe, pH değeri 7.4 'e ayarlanmıştır
Tris (TBS) tamponlu tuzlu
Tris-HCl, pH 7.4 50 mM
GHT = "20" style = "height: 20px; width: 299px;"> NaCl 150 mM
Tris Tween 20 (TBST) ile tamponlu tuzlu
Tris-HCl, pH 7.4 50 mM
NaCl 150 mM
Tween 20 % 0.1 (v / v)
Bağlama tamponu
Tris-HCl, pH 8.0 25 mM
NaCl
NaF 5 mM
EDTA 0.5 mM
Gliserin % 10 (v / v)
PMSF 0.1 mM
Tampon # 1 yıkayın
Tris-HCl, pH 8.0 25 mM
NaCl 500 mM
NaF td> 5 mM
EDTA 0.4 mM
Igepal CA-630 % 0.2 (v / v)
Gliserin % 5 (v / v)
PMSF 0.1 mM
Tampon # 2 yıkayın
Tris-HCl, pH 8.0 25 mM
NaCl 150 mM
Tris-HCl, pH 8.0 25 mM
SDS % 1 (ağ / hac)

Tablo 1.. Mevcut çalışmada kullanılan tamponlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Saflaştırma prosedürü, şematik olarak bir arada var olan diğer saflaştırma yöntemleri ile bağlantılı sorunların bir temsili, Şekil 1 'de gösterilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1. Saflaştırma prosedürü şematik temsili. Akışı kovalent çapraz bağlı reçine için çift-Strep-etiketli yem protein ve ilişkili kompleksler bağlayıcı, BS3 ile çapraz bağlama ile reçineden bağlanmış Strep-taktin tetramer içerir stabilizasyonu , Bağlanmamış proteinlerin yıkanması% 1 SDS ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) kendi analizi ile spesifik olarak bağlanan protein kompleksleri elüsyonu denatüre. Yem protein iki kırmızı küreleri ikiz-Strep-etiketi belirtir. Diğer saflaştırma yöntemleri sınırlamaları içerlek gösterilmiştirSağdaki kutuları. Bunlar, Strep-taktin% 1 SDS ile denatürasyon ile elüsyon aşağıdaki biotin ve örnek kirlenme ile hedef proteinlerin eksik elüsyonu içerir.

BS3 çapraz bağlanmış Strep-taktin polimetakrilat reçinesi kullanılarak ve% 1 SDS ile denatüre elüsyon SIII-etiketli protein saflaştırma tipik sonuçlar, Şekil 2'de gösterilmiştir. Içeren spin kolon eluatın% 10 (15 ul), saflaştırılmış SIII etiketli PVA VPg-Pro ve bağlı proteinler gümüş lekeleme ile SDS-PAGE ile analiz edilmiştir. Negatif kontrol şeritte PVA VPg-Pro tekabül eden 52-kDa bandının olmayışı pull-down özgünlüğünü teyit etmiştir. Kalan spin kolon sıyırma sıvısı, 40 ul bir keratin içermeyen SDS jel uygulanmıştır ve buna karşılık gelen şerit kesildi ve içerdiği protein tripsin ile sindirildi ve sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) ile analiz edilmiştir. Kütle spektrometrisi analizi, viral RNA-DEPE tanımlanmışVPg-Pro etkileşim ortağı olarak ndent RNA polimeraz (replikaz) uç. Uç tekabül eden birden fazla triptik peptidler etkileşimin özgünlüğünü teyit SIII-etiketi olmadan VPg-Pro ifade dört kontrollerde afinite saflaştırma ve hiçbiri tüm dört biyolojik tekrardan tespit edildi. Uç (59 kDa) molekül ağırlığı SIII-etiketli VPg-Pro (52 kDa) birbirine çok yakın olduğu için, iki proteinin (Şekil 2, ok başı) SDS-PAGE analizi sırasında bir çift bant olarak ortaya çıkmıştır. Birlikte ele alındığında, yukarıda anlatılan sonuçlar kovalent BS3 ile çapraz bağlanmış Strep-taktin reçineleri bu afinite arındırma işlemi iki Strep-etiketli proteinleri izole etmek ve kütle spektrometrisi ile bunların fizyolojik bağlanma ortakları belirlemek için kullanılabilecektir deneysel kanıt sağlar.

Şekil 2,
PVA VPg-Pro SIII-etiketli ve Strep-taktin polimetakrilat reçine üzerinde bağlanma ortağı PVA uç BS3 ile çapraz bağlanmış. şekil çapraz bağlanmış ikinci yıkama sıvılarından bir gümüş-lekeli SDS-poliakrilamid jeli göstermektedir boncuk. Uç aynı numunenin bir kısım kullanılarak VPg-Pro bir bağlanma partneri olarak kütle spektrometresi ile tanımlandı. Bir ok ile gösterilen, bir çift bant olarak göç: ve uç (59 kDa tahmin MW): PVA VPg-Pro (52 kDa tahmin MW) SIII-etiketledi. Negatif kontrol (merkezi şerit) virüs SIII-etiketi olmadan VPg-Pro ifade ile enfekte edilmiş hücrelerden saflaştırma işlemine karşılık gelir.

Şekil 3,
Şekil 3. Biotin elüsyon Strep-taktin polimetakrilat reçineden PVA VPg-Pro olduğu SIII etiketlieksik% 1 SDS ile yıkama ile karşılaştırıldığında. şekil Strep-taktin boncuklardan elüsyonların bir anti-VPg immüno göstermektedir. Taneler 15 mM biyotin ile ya da% 1 SDS ile ya da elüt edilmiştir. Sinyal yoğunluğundaki fark, iki yıkama teknikleri ile elde edilen değişik protein verimi yansıtmaktadır. Negatif kontroller SIII-etiketi olmadan VPg-Pro ifade edilen virüs ile enfekte hücrelerden saflaştırılması karşılık gelir.

Şekil 4,
Şekil 4,. BS3 ile çapraz bağlama kovalent Şekil olmayan çapraz bağlanmış (sol şerit) için SDS yıkama sıvılarından bir gümüş lekeli jeli göstermektedir. SDS elüsyon sırasında reçineden Strep-taktin salınımını önleyen ve BS3 çapraz bağlanmış (sağ şerit) Strep-taktin polimethacrylate reçine. Sol şeritte yayımlanan Strep-taktin varlığını ancak sağ şeritte yokluğunu unutmayın.


Şekil 5,. Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ve Strep-taktin lizin artıklarının epsilon amino grupları ile çapraz bağlama reaksiyonu kimyasal yapısı.

Şekil 6,
On iki Strep-etiketli yeşil floresan proteini (GFP) ve Şekil 6,. Saflaştırma olmayan çapraz bağlı ve Strep-taktin polimetakrilat reçine BS3 çapraz bağlanmış. Çift Strep-etiketli GFP ifade eden insan embriyonik böbrek 293 hücrelerinin iki eşit miktarlarda parçalanır ve benzer şekilde edildiğini reçine BS3 ile çapraz bağlanmış edilmiş bir durumda olması hariç diğer BS3 olarak, yukarıdaki protokol kullanılarak işlenmiştiren, çapraz bağlama reaksiyonunda su ile ikame edilir. Şekil gümüş-lekeli SDS-poliakrilamid jel ve saflaştırılmış proteinler anti-GFP immüno göstermektedir. Protein, verimde bir azalma kimyasal çapraz bağlanmasını içeren saflaştırma yöntemleri doğasında, ancak bu durum serbest Strep-taktin yokluğu için daha fazla örnek saflığı ile telafi unutmayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yukarıdaki protokol biotin ya da güçlü denşirme içermeyen, herhangi bir uygun tampon maddesi içinde ilgi ve ilgili kompleksleri herhangi bir çift-Strep-etiketli yem proteini saflaştırmak için kullanılabilir. Protokol geçerli sürümünde, bağlanma ve yıkama, yüksek tuz ve iyonik olmayan deterjanın varlığında, nispeten sert koşullar altında gerçekleştirilir. Bu, daha az arka sonuçlanır, ancak kırılgan protein kompleksleri, bu koşullar altında ayırmak olabilir. Örneğin düşük afinite kompleksleri korumak için, tuz konsantrasyonu düşürülebilir ve iyonik olmayan deterjan tamponlar bağlama ve yıkama indirgenmiş ya da ihmal edilebilir.

Ikiz-Strep-tag sisteminin temel avantajı tasarlanmış streptavidin da toplu olarak hedef proteinler ve komplekslerinin etkin tek-aşamalı saflaştırma izin (Strep-taktin) 1, 2, en küçük (3kDa) tandem etiketinin yüksek afinite modu. Çünkü iki Strep-etiketinin güçlü bir bağlanma bölgesininStrep-taktin için, reçine, örneğin yüksek saflıkta hedef protein ile sonuçlanan yüksek bir deterjan ve / veya tuz konsantrasyonu gibi orta derecede sıkı şartlar altında yıkanabilir. Ancak, bu tür güçlü bir bağlanma aynı zamanda dezavantajları vardır. Hatta tek bir Strep etiketi II (amino asit sekansı WSHPQFEK) ile proteinlerin durumunda, reçineden elüsyon rekabet bazen zor olabilir. Örneğin, 10 mM Strep-taktin polimetakrilat reçine bir Strep (II)-etiketli protein kinaz, NtCDPK2, elüsyon SDS numune tamponu ile elüsyon 6 denatüre gerektiren, başarısız olduğu kanıtlanmıştır destiobiyotin. Sorun destiobiyotin güçlü rekabet biyotin (10 mM) ve elüsyon güçlü 7 çalkalayarak 5 dakika boyunca gerçekleştirilmiştir ile değiştirildi sonra çözüldü. Strep-taktin için daha yüksek bir afiniteye sahip olan çift-Strep-etiketi, durumunda, hedef protein elüsyon da 15 mM kadar yüksek konsantrasyonlarda biyotin eksik olabilir. Şekil 3'te gösterildiği gibiSIII-etiketli PVA VPg-Pro sadece küçük bir kısmı,% 1 SDS ile akıtılan miktarına göre 15 mM biyotin ile Strep-taktin reçineden elüe edilebilir. Bu rekabet elüsyonun etkinliği büyük olasılıkla da elüt protein veya protein kompleksi doğasına bağlıdır dikkat etmek önemlidir. Daha büyük ve daha hidrofobik olan ve böylece rekabetçi protein sterik olarak yıkama daha verimli hale getirerek, Strep-taktin olarak biyotin bağlayıcı cebin erişilebilirliğini engelleyebilir. Yukarıdaki dezavantajları SDS ile elüsyonu kullanılarak önlenebilir, ama bu tür elüsyon esas olarak deterjan maruz serbest Strep-taktin 8 reçine çiftli Strep-taktin tetramerleri ve örnek kirlenme ayrışmasına yol açtığı gerçeğini etrafında döner, kendi sorunları vardır vardır. Bu, SDS% 1 ihtiva eden yıkama tamponu içinde Strep-taktin reçine inkübasyondan sonra serbest Strep-taktin önemli bir kısmını göstermektedir, Şekil 4 (sol şerit) olarak gösterilmiştir. Bu tip bir kontaminasyon ise kabul edilemezbir numune, LC-MS/MS ile analiz edilmesi gerekmektedir.

Yukarıdaki kirlilik sorununa bir çözüm, kovalent çapraz bağlanma ile reçineden bağlanmış Strep-taktin tetramer 9'un stabilizasyonudur. Bu amaç için, protein yapıları 10-13 stabilize başarılı kullanımının bir geçmişi olan bir suda çözünür olmayan, bölünebilir, iki-işlevli amin reaktif çapraz-bağlayıcı BS3 kullanılabilir. BS3 5 kimyasal formülünü gösterir ve çapraz bağlama Şekil Strep-taktin lizin epsilon serbest amino grupları ile reaksiyonu. Reçine çiftli Strep-taktin tetramer BS3 ile çapraz bağlama ile stabilize edildiğinde, serbest Strep-taktin numune kontaminasyon sorunu hemen (bkz. Şekil 4, sağ şerit) ortadan kaldırılmıştır. BS3 ile çapraz bağlama geniş bir protein agregasyonunu 14 neden olmadığı için, bu yapım, streptavidin bağlayıcı cep biyotin erişilebilirliğini azaltmazStrep-etiketli füzyon proteinlerinin saflaştırılması için uygun olan çapraz bağlı reçine. Bu, biyolojik aktivite (antikorlar, vb) ile proteinlerin kimyasal çapraz bağlama bazı aktivite kaybına yol açan, hem de aktif ve aktif olmayan protein şeklindeki stabilize Ancak, dikkat edilmelidir. Örneğin, BS3 çapraz bağlanmış antikorlar kullanılarak köklü immünopresipitasyon yöntem olmayan çapraz bağlanmış antikorlar 15 ile elde edilene göre daha düşük bir hedef protein verimi üretir. Bununla birlikte, biyolojik aktivitenin bir miktar kayıp geliştirilmiş örnek saflığı için kabul edilebilir bir denge olarak kabul edilir. Biz, BS3 çapraz bağlanmış Strep-taktin reçinesi ile benzer sonuçlar gözlenmiştir. Çapraz bağlı reçinesi ile elde edilen daha düşük protein verimi büyük ölçüde geliştirilmiş örnek saflığı (Şekil 6) ile telafi daha fazla oldu.

Önerilen yöntemin bir başka potansiyel uygulama Strep-işaretli zar proteinlerinin saflaştırılmasına olduğu solubilizdeterjan ile ed. Deterjan çözeltisi içinde bu gibi hidrofobik proteinleri ve ilgili kompleksleri tutmak için gerekli olan, ancak, bunların varlıklarının afinite reçineden serbest Strep-taktin numune kirlenmesine yol açabilir. Bu iyi bir örnek, protein kristalleştirme 8 amacıyla Strep-taktin boncuk NTT1 azından bir Strep (II)-işaretli zar proteini saflaştırılmasıdır. Elüsyon tamponu içinde deterjan laurylamidodimethylpropylaminoxide (Lapão) mevcudiyeti, boncuk ve istenmeyen Strep-taktin kristaller 8 daha sonra büyüme Strep-taktin serbest bırakılması yol açtı. Kovalent çapraz bağlanma ile reçineden bağlanmış Strep-taktin tetramer stabilizasyonu, bu sorunun üstesinden gelmek için etkili bir araç sağlayabilir.

Özet olarak, kimyasal çapraz bağlanma başarıyla Strep-taktin reçineden bir elüsyon denatürasyon ile ilişkili sınırlamaların üstesinden gelmek için kullanılmıştır. Bu yaklaşım iyi hedef protein yeniden elde yardımcı oldunumune kontaminasyonu tanıtan olmadan Covery. Önerilen yöntem, ve böylece kütle spektrometresi ile çift-Strep-etiketli yem proteinlerin spesifik bağlanma ortakları belirlemek için kullanılabilir. Ayrıca yöntem, nükleoprotein tersine çevrilebilir formaldehid ile çapraz bağlanmış kompleksler de dahil olmak üzere, hem de deterjan ile eriyebilir hale zar proteinleri izole edilmesi ve karakterize etmek için uygulanabilir. Son olarak, kimyasal çapraz bağlama belirgin bir yüksek hacimli uygulamalar için, çapraz bağlı reçine potansiyel olarak uygun hale getirmek, Strep-taktin reçinenin fiziksel özelliklerini değiştirmez.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Biz minnetle Sini Miettinen, Minna Pöllänen ve Taru Rautavesi teknik destek için minnettarım. Biz HEK ses kayıt ekipmanları sağlanması için ikiz-Strep-etiketli GFP ve Pekka Evijarvi ifade 293 hücreler sağlamak için Helka Nurkkala teşekkür ederim. Bu çalışma Finlandiya Akademisi tarafından finanse edildi, sayıları 138329, 134684 ve 258978 hibe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg Pierce/Thermo Scientific 21585 www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) IBA 2-1505 www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile Costar (Corning) 8163 www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes Costar (Corning) 3213 www.corning.com/lifesciences/
Avidin  IBA 2-0204 www.iba-lifesciences.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10, (8), 975-982 (1997).
  2. Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2, (6), 1528-1535 (2007).
  3. Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5, (5), 1199-1203 (2005).
  4. Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22, (2), 523-535 (2010).
  5. Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  6. Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55, (1), 135-147 (2004).
  7. Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146, (2), 418-430 (2008).
  8. Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68, (10), 1272-1277 (2012).
  9. Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, (7), 2190-2194 (1989).
  10. Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168, (6), 965-974 (2005).
  11. Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281, (50), 38266-38275 (2006).
  12. Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (9), (2010).
  13. Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
  14. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173, (3), 530-540 (2011).
  15. Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics