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Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)

Biology

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Summary

É descrito um método para a purificação eficiente de proteínas de fusão duplo-Strep-marcados e os seus complexos específicos de estreptavidina modificada (Strep-Tactin) resina covalentemente reticulado com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). O método tem as vantagens de alta velocidade, uma boa recuperação da proteína alvo e de elevada pureza, e é compatível com a análise subsequente por espectrometria de massa.

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Ivanov, K. I., Bašić, M., Varjosalo, M., Mäkinen, K. One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3). J. Vis. Exp. (86), e51536, doi:10.3791/51536 (2014).

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Abstract

A purificação por afinidade das proteínas de fusão marcadas com Strep-resinas que transportam um estreptavidina engenharia (Strep-Tactin) tornou-se um método utilizado para o isolamento de complexos de proteínas sob condições fisiológicas. As proteínas de fusão que contêm duas cópias de Strep-tag II, designadas-Strep-tag ou duplo SIII-tag, têm a vantagem de uma maior afinidade para o Strep-Tactin em comparação com aquelas que contêm apenas um Strep-tag único, permitindo assim a purificação da proteína mais eficiente. No entanto, esta vantagem é compensada pelo fato de que a eluição de proteínas twin-Strep-marcadas com biotina pode ser incompleta, levando a baixa recuperação de proteína. A recuperação pode ser drasticamente melhorada utilizando desnaturação eluição com dodecil-sulfato de sódio (SDS), mas isto conduz a amostra de contaminação com Strep-Tactin libertado da resina, tornando o ensaio de incompatibilidade com a análise de proteómica jusante. Para superar esta limitação, temos desenvolvido um método pelo qual tetrâmero acoplados à resina de Strep-Tactiné estabilizada pela primeira vez por reticulação covalente com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3), e a resina com ligações cruzadas resultante é, então, utilizada para purificar complexos de proteínas-alvo em um único passo de purificação por lotes. Eluição eficiente com SDS garante uma boa recuperação de proteína, enquanto a ausência de contaminação Strep-Tactin permite a análise de proteínas downstream por espectrometria de massa. Como prova do conceito, aqui descrita de um protocolo para a purificação de proteínas virais SIII marcado com VPg-Pro a partir de núcleos de N. infectadas com vírus benthamiana plantas utilizando a resina de polimetacrilato Strep-Tactin reticulados com BS3. O mesmo protocolo pode ser utilizado para purificar qualquer proteína duplo-Strep-tag de interesse e caracterizar os seus parceiros de ligação fisiológicas.

Introduction

Nos últimos anos, a tecnologia Strep-tag tornou-se amplamente utilizado em muitas áreas de pesquisa biomédica, incluindo proteômica e biologia estrutural. Esta tecnologia de purificação de proteínas, o qual baseia-se na fusão de proteínas recombinantes a um péptido curto Strep-tag, amadureceu com o advento de matrizes de afinidade que transportam Strep-Tactin, uma variante geneticamente modificada de estreptavidina com uma melhor capacidade de ligação de péptidos 1, 2. As proteínas de fusão contendo duas cópias do Strep-tag II, designados-Strep-tag ou twin-tag SIII, exibem uma maior afinidade para matrizes Strep-Tactin do que aqueles que contêm apenas uma tag Strep único, garantindo a purificação mais eficiente das proteínas recombinantes e seus parceiros de ligação associados. No entanto, a maior afinidade de proteínas twin-Strep-tag para Strep-Tactin também tem seu lado negativo. Eluição competitiva de tais proteínas, com o excesso de biotina pode ser incompleta, levando à produção de proteína alvo diminui. Um mminério eficiente alternativa é a eluição com SDS, mas conduz a uma contaminação indesejada da amostra com Strep-Tactin libertado da resina, tornando o ensaio de incompatibilidade com a análise de proteoma. Este documento apresenta uma técnica para superar esta limitação, o primeiro estabilizador tetrâmero acoplado à resina de Strep-Tactin por reticulação química e, em seguida, utilizando SDS para eluir proteínas de duplo Strep-tag e os seus complexos associados a partir da resina com ligações cruzadas resultante. Assim, o rendimento de proteína suficiente pode ser conseguida sem a contaminação da amostra com Strep-Tactin, permitindo, assim, ainda mais a análise por espectrometria de massa.

O método é adequado para a purificação de qualquer proteína de fusão recombinante com uma etiqueta de SIII exposto à superfície ou 3-Strep-tag duplo (WSHPQFEK sequência de aminoácidos (GGGS) 3 WSHPQFEK SAWSHPQFEK e (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respectivamente). A proteína pode ser de origem animal, vegetal ou de origem bacteriana e pode ser isolado a partir de qualquer célula totaislisado ou fracção enriquecida organelo. Como exemplo, descrevemos aqui a purificação de uma proteína marcada com SIII VPg-Pro de batata vírus A (PVA) 4 a partir da fracção nuclear de PVA-infectadas de plantas de Nicotiana benthamiana. A fracção nuclear foi isolado como descrito anteriormente 5, com as seguintes modificações: As células não foram tratadas com o formaldeído, o butirato de sódio foi substituído em todos os tampões, com fluoreto de sódio 5 mM, inibidor de protease completo foi substituído com PMSF, Triton X-100 a concentração na extracção tampão # 2 foi reduzido para 0,3% (v / v) e o sedimento nuclear obtida por centrifugação através de almofada de sacarose (tampão de extracção # 3) foi novamente suspenso em 1,45 ml de tampão de ligação pré-refrigerado e rodado durante 1,5 horas a 4 ° C. O extrato nuclear resultante contendo a proteína isca SIII-marcados e complexos associados (amostra proteína isca) foi processado de acordo com o protocolo descrito a seguir (ver secção 2).

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Protocol

1. Cross-linking de Strep-Tactin polimetacrilato Resina com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)

  1. Equilibrar um microtubo selado contendo 2 mg de BS3 de reticulação à temperatura ambiente. CUIDADO: BS3 é uma substância perigosa. Usar luvas e óculos de proteção.
  2. Resina de polimetacrilato Ressuspender Strep-Tactin (50% de suspensão em 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM; NaCl 150 mM) por breve agitação vigorosa e transferir imediatamente 600 uL da suspensão para uma coluna de centrifugação utilizando uma ponta de pipeta com a extremidade cortada.
  3. Centrifugar a 1.500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Descartar o fluxo e adicionar 450 ul de salina tamponada com fosfato (PBS) para a coluna.
  4. Repetir o passo anterior mais 2 vezes para substituir completamente o tampão Tris com PBS e deixar a resina em 430 ul de PBS, ajustado a pH 8,0, após a última centrifugação.
  5. Perfurar a folha do microtubo com BS3 com uma ponteira que contém 1001; l de água ultrapura. Dissolver o pó em água BS3 cuidado pipetando para cima e para baixo e imediatamente adicionar 20 mL da solução para a coluna de centrifugação. A concentração final de BS3 na reacção de ligação cruzada é de aproximadamente 1,2 mM.
  6. Girar a coluna durante 30 minutos à temperatura ambiente. Verificar que a resina é misturada com a solução adequadamente BS3.
  7. Para terminar a reacção, adiciona-se 6 mL de Tris-HCl 3 M, pH 7,5 e a coluna rodar durante mais 15 minutos à temperatura ambiente.
  8. Centrifugar a 1.500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Descartar o fluxo e ressuspender a resina reticulada, em 450 ul de solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST). Repetir a centrifugação e passos de lavagem mais duas vezes. Na última etapa, ressuspender a resina em 450 ul de TBS.
  9. Transferir a suspensão de resina, para um tubo novo utilizando uma ponta de pipeta com a extremidade cortada. Ressuspender a resina deixada na coluna com mais 450 mL de TBS e transferir para o mesmo tubo. Repita ªe último passo mais uma vez para assegurar a transferência máxima da resina a partir da coluna para o tubo.
  10. Deixe o tubo de repousar durante 10 minutos à temperatura ambiente e ajustar o volume para 600 mL, removendo o excesso de TBS. A resina está pronta para utilização imediata (recomendado), ou pode ser armazenado a 4 ° C, sem congelação.

2. Ligação da proteína Bait Twin-Strep-marcados e Complexos Associated ao reticulado Strep-Tactin polimetacrilato Resina

  1. Centrifugar 1 ml da amostra de proteína isco em tampão de ligação a 17000 xg durante 10 min a 4 ° C e transferir o sobrenadante para um tubo fresco.
  2. Para minimizar a ligação de proteínas biotiniladas endógenos para a resina de Strep-Tactin, adicionar avidina a uma concentração final de 100 ug / ml e rodar durante 15 min a 4 ° C.
    1. Se a resina reticulada do passo 1.10 foi armazenado durante um longo período de tempo, a 4 ° C, recolher a resina por centrifugação a 400 xg for 1 min a 4 ° C, deitar fora o sobrenadante e lava-se a resina com 1 ml de TBST. Repita a centrifugação e lavagem passos mais duas vezes, primeiro com TBST e, em seguida, com TBS. Centrifuga-se o tubo a 400 xg durante 1 min a 4 ° C e ajusta-se o volume original, removendo o excesso de TBS.
  3. Ressuspender a resina Strep-Tactin reticulado por vórtice. Imediatamente adicionar 50 ul da suspensão de resina para o tubo contendo a amostra de proteína isco utilizando uma ponta de pipeta de corte e rodar durante mais 30 minutos a 4 ° C.
  4. Enquanto espera, definido termomisturador a 55 ° C e pré-aquecer a 500 ul de tampão de eluição para o uso no passo 3.1.
  5. Centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e lava-se a resina sobre um rotador durante 5 min a 4 ° C com 1 ml de tampão de lavagem pré-refrigerada # 1. Repetir a centrifugação e passos de lavagem três vezes. Na última etapa, ressuspender a resina em 250 ul de tampão de lavagem # 2.
  6. Tr ansfer a suspensão de resina para uma coluna de rotação fresca. Ressuspender a resina remanescente no tubo em mais 250 ul de tampão de lavagem 2 e transferir a mesma coluna.
  7. Centrifugar a 400 xg por 3 min a 4 ° C, descarte o flow-through e transferir a coluna para um golfinho-nariz 2 tubo fresco ml. Vá imediatamente para a etapa de eluição abaixo.

3. Eluição de complexos de proteínas específicas

  1. Adicionar 150 ul de tampão de eluição pré-aquecida do passo 2.4 para a coluna de centrifugação.
  2. Incubar em termomisturador durante 5 min a 55 ° C, com agitação a 1400 rpm.
  3. Centrifugar a 1.500 xg durante 1 min à temperatura ambiente.
  4. Descartar a coluna e armazenar as proteínas alvo purificados a ≤ -20 ° C.
0 "> x; "> 550 mM 2 "height =" "style =" 20 height: 20px; width: 597px; "> tampão de eluição
Salina tamponada com fosfato (PBS)
Na 2 HPO 4 10 mM
KH 2 PO 4 2 mM
NaCl 137 mM
KCl 2,7 mM
pH ajustado para 7,4, salvo indicação contrária (pH 8,0 na secção 1.4)
Solução salina tamponada com Tris (TBS)
Tris-HCl, pH 7,4 50 mM
ght = estilo "20" = "height: 20px; width: 299px;"> NaCl 150 mM
Solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST)
Tris-HCl, pH 7,4 50 mM
NaCl 150 mM
Tween 20 0,1% (v / v)
Tampão de ligação
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl
NaF 5 mM
EDTA 0,5 mM
Glicerina 10% (v / v)
PMSF 0,1 mM
Lave tampão # 1
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl 500 mM
NaF td> 5 mM
EDTA 0,4 mM
Igepal CA-630 0,2% (v / v)
Glicerina 5% (v / v)
PMSF 0,1 mM
Lave tampão # 2
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl 150 mM
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
SDS 1% (w / v)

Tabela 1. Tampões utilizados no presente estudo.

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Representative Results

O procedimento de purificação está esquematicamente ilustrada na Figura 1, juntamente com uma representação de problemas associados com outros métodos de purificação existentes.

Figura 1
Figura 1. Representação esquemática do procedimento de purificação. O fluxo de trabalho inclui a estabilização da Strep-Tactin tetrâmero acoplado à resina por meio de ligação covalente de ligação cruzada com BS3, a ligação da proteína isco duplo-Strep-tag e complexos associados à resina reticulada , lavando de proteínas não ligados, desnaturação eluição dos complexos de proteínas especificamente ligados com 1% SDS e sua análise por cromatografia-espectrometria de massa líquida (LC-MS/MS). Duas esferas vermelhas na proteína isca denotar o Strep-tag gêmea. Limitações de outros métodos de purificação são mostrados na inserçãocaixas à direita. Eles incluem eluição incompleta das proteínas alvo com biotina e a contaminação da amostra com Strep-Tactin seguinte desnaturante eluição com 1% de SDS.

Os resultados típicos de purificação da proteína SIII-etiquetado usando a resina de polimetacrilato Strep-Tactin BS3-reticulado e desnaturação a eluição com 1% de SDS são mostrados na Figura 2. De 10% (15 ul) do eluato da coluna de centrifugação contendo purificada SIII-etiquetados proteínas PVA VPg-Pro e associados foi analisado por SDS-PAGE seguida por coloração com prata. A ausência da banda 52 kDa correspondente ao PVA VPg-Pro na pista controle negativo confirmou a especificidade do pull-down. 40 ul do eluato da coluna de spin restantes foram aplicadas a um gel de SDS-livre de queratina e a pista correspondente foi cortado e as proteínas contidas foram digeridos com tripsina e analisada por cromatografia em espectrometria de massa de líquido (LC-MS/MS). A análise por espectrometria de massa identificou viral ARN-dependent RNA polimerase (replicase) NIb como o parceiro de interação VPg-Pro. Vários peptídeos trípticos correspondentes a NIb foram detectados em todas as quatro réplicas biológicas da purificação por afinidade e em nenhum dos quatro controlos expressam VPg-Pro sem a marcação SIII, confirmando a especificidade da interacção. Uma vez que o peso molecular da ponta (59 kDa) é próximo do de SIII-etiquetado VPg-Pro (52 kDa), as duas proteínas apareceu como uma banda dupla, durante a análise de SDS-PAGE (Figura 2, seta). Tomados em conjunto, os resultados acima descritos fornecem evidência experimental de que a purificação por afinidade em resinas Strep-Tactin covalentemente reticulados com BS3 pode ser utilizado com êxito para isolar proteínas de duplo-Strep-tag e identificar os seus parceiros de ligação fisiológicos por espectrometria de massa.

Figura 2
SIII-etiquetado PVA VPg-Pro e seu parceiro de ligação PVA NIb em resina de polimetacrilato Strep-Tactin reticulados com BS3. A figura mostra um gel de poliacrilamida-SDS corado com prata de eluatos do reticulado grânulos. NIb foi identificado por espectrometria de massa como um parceiro de ligação de VPg-Pro utilizando uma aliquota da mesma amostra. SIII-marcado PVA VPg-Pro (MW previsto: 52 kDa) e ponta (MW previsto: 59 kDa) migram como uma banda dupla, indicado por uma seta. O controlo negativo (linha central) corresponde à purificação a partir de células infectadas com o vírus expressando VPg-Pro sem a marcação SIII.

Figura 3
Figura 3. Eluição Biotina de SIII-marcado PVA VPg-Pro a partir de resina polimetacrilato Strep-Tactin éincompletas em comparação com a eluição com 1% de SDS. A figura mostra uma imunotransferência anti-VPg dos eluatos de esferas de Strep-Tactin. As esferas foram eluídas com 15 mM ou biotina ou com 1% de SDS. A diferença na intensidade de sinal reflecte diferentes rendimentos proteicos obtidos com as duas técnicas de eluição. Os controlos negativos correspondem a purificação a partir de células infectadas com o vírus expressando VPg-Pro sem a marcação SIII.

Figura 4
Figura 4. Covalente de ligação cruzada com BS3 impede a libertação de Strep-Tactin da resina durante a SDS eluição. A figura mostra um gel corado com prata de SDS eluatos a partir de não-reticulada (pista da esquerda) e BS3 reticulado (pista da direita) resina polimetacrilato Strep-Tactin. Observe a presença de lançado Strep-Tactin na faixa da esquerda, mas a sua ausência na pista da direita.


Figura 5. Estrutura química de bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) e a sua reacção de reticulação com os grupos epsilon amino de resíduos de lisina em Strep-Tactin.

Figura 6
Figura 6. Purificação de proteína twin-Strep-marcado verde fluorescente (GFP) em não-reticulado e BS3-reticulado resina polimetacrilato Strep-Tactin. Duas quantidades iguais de embrionárias do rim 293 células humanas expressando GFP twin-Strep-marcado foram lisadas e processadas de forma semelhante utilizando o protocolo anterior, excepto que no caso de uma resina tem sido reticulado com BS3 e no outro tem ser BS3en substituído com água na reacção de reticulação. A figura mostra um gel de SDS-poliacrilamida corados com prata e imunotransferência anti-GFP de proteínas purificadas. Note-se que uma certa diminuição na produção de proteína é inerente aos métodos de purificação envolvendo a ligação cruzada química, mas isso é compensado pela maior pureza da amostra, devido à ausência de autorização de Strep-Tactin.

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Discussion

O protocolo acima pode ser utilizado para purificar qualquer proteína isco duplo-Strep-tag de interesse e os seus complexos associados em qualquer tampão adequado, que não contém biotina ou desnaturantes fortes. Na versão atual do protocolo, obrigatório e lavagem são realizadas em condições relativamente severas na presença de alto teor de sal e detergente não-iônico. Embora isto resulta em menos fundo, complexos de proteína frágeis podem dissociar sob estas condições. Para preservar os complexos de afinidade inferior, a concentração de sal pode ser reduzido e o detergente não iónico pode ser reduzida ou omitida de tampões de ligação e de lavagem.

A principal vantagem do sistema de Strep-tag duplo é a elevada afinidade do pequeno (3 kDa) tag tandem para estreptavidina engenharia (Strep-Tactin) 1, 2, permitindo eficiente de purificação de um só passo de proteínas-alvo e os seus complexos no mesmo lote modo. Por causa da forte ligação de-Strep-tag gêmeoa Strep-Tactin, a resina pode ser lavada em condições moderadamente rigorosas, tais como elevada de detergente e / ou as concentrações de sal, que resulta em uma maior pureza da proteína alvo. No entanto, tal ligação forte também tem os seus inconvenientes. Mesmo no caso de as proteínas com um único Strep-tag II (sequência WSHPQFEK aminoácido), eluição competitiva a partir da resina pode ser por vezes difícil. Por exemplo, a eluição de uma Strep (II) marcado com proteína-quinase, NtCDPK2, a partir da resina de polimetacrilato Strep-Tactin com 10 mM desthiobiotin provou ser bem-sucedida, necessitando de desnaturação de eluição com tampão de amostra de SDS 6. O problema foi resolvido apenas após desthiobiotin foi substituído com forte biotina concorrentes (10 mM) e a eluição foi realizada durante 5 minutos com agitação vigorosa 7. No caso de a-Strep-tag duplo, o qual tem maior afinidade para o Strep-Tactin, a eluição da proteína alvo pode estar incompleta, mesmo em concentrações tão elevadas como biotina 15 mM. Como mostrado na Figura 3,apenas uma pequena fracção de SIII-etiquetado PVA VPg-Pro pode ser fluido a partir da resina de Strep-Tactin com 15 mM de biotina em comparação com a quantidade eluída com 1% de SDS. É importante salientar que a eficiência de eluição competitiva provavelmente também depende da natureza da proteína eluída ou complexo de proteínas. Proteínas maiores e mais hidrofóbicos podem impedir estereoquimicamente a acessibilidade da bolsa de ligação de biotina em Strep-Tactin, fazendo assim a eluição competitiva menos eficiente. Os inconvenientes acima são evitados usando eluição com SDS, mas tal eluição tem seus próprios problemas, principalmente giram em torno do fato de que a exposição a detergentes leva à dissociação dos tetrâmeros Strep-Tactin juntamente com resina e contaminação da amostra com liberado Strep-Tactin 8. Isto é demonstrado na Figura 4 (pista da esquerda), que mostra uma quantidade considerável de Strep-Tactin libertado após a incubação da resina Strep-Tactin em tampão de eluição contendo 1% de SDS. Esta contaminação é inaceitável sea amostra precisa ser mais bem analisadas por LC-MS/MS.

Uma solução eficaz para o problema de contaminação de cima é a estabilização da resina acoplada-Strep-Tactin tetrâmero 9 por reticulação covalente. Para este fim, utilizou-se um, não clivável, homobifuncional amina reactivo reticulante BS3 solúvel em água, com uma história de utilização com sucesso na estabilização de estruturas de proteínas 10-13. Figura 5 mostra a fórmula química dos BS3 e a sua reticulação reação com grupos livres epsilon amino de lisina em Strep-Tactin. Quando o Strep-Tactin tetrâmero acoplados à resina foi estabilizada por reticulação com BS3, o problema da contaminação da amostra com libertado Strep-Tactin foi virtualmente eliminado (Fig. 4, pista da direita). Porque a ligação cruzada com BS3 não causar grande agregação de proteínas 14, ele não reduz a acessibilidade da bolsa de ligação de biotina estreptavidina, tornando oresina de ligação cruzada adequados para a purificação de proteínas de fusão de Strep-tag. Deve notar-se, no entanto, que a reticulação química de proteínas com actividade biológica (anticorpos, etc) estabiliza ambas as conformações de proteínas activas e inactivas, que leva a alguma perda de actividade. Por exemplo, o método de imunoprecipitação bem estabelecida utilizando anticorpos reticulados-BS3 produz um rendimento de proteína alvo menor em comparação com a obtida com anticorpos não reticulado 15. No entanto, alguma perda de actividade biológica é considerado para ser um trade-off aceitável para a pureza da amostra melhorado. Temos observado resultados similares com a resina Strep-Tactin reticulado-BS3. O rendimento de proteína ligeiramente inferior obtida com a resina reticulada foi mais do que compensada pela pureza da amostra muito melhorada (Figura 6).

Outra aplicação potencial do método proposto é na purificação de proteínas de membrana Strep marcadas solubilized com detergentes. Os detergentes são essenciais para manter essas proteínas hidrofóbicas e seus complexos associados na solução, mas a sua presença pode levar à contaminação da amostra com Strep-Tactin libertada da resina de afinidade. Um bom exemplo disto é a purificação de uma proteína de membrana (II)-marcado Strep No NTT1 em grânulos Strep-Tactin para efeitos de cristalização da proteína 8. A presença do detergente laurylamidodimethylpropylaminoxide (Lapao) no tampão de eluição conduziu à libertação de Strep-Tactin a partir das pérolas e o crescimento subsequente de cristais indesejáveis ​​Strep-Tactin 8. Estabilização do acoplamento de resina Strep-Tactin tetramer por ligações covalentes cross-linking pode fornecer um meio eficaz para superar este problema.

Em resumo, a reticulação química foi utilizada com sucesso para ultrapassar as limitações associadas com a desnaturação de eluição a partir da resina de Strep-Tactin. Esta abordagem ajudou a alcançar um bom re proteína alvoperação sem introduzir contaminação da amostra. O método proposto pode, assim, ser utilizada para identificar parceiros de ligação específicos de proteínas isco duplo-Strep-tag por espectrometria de massa. Além disso, o método pode ser aplicado para isolar e caracterizar os complexos nucleoproteicos, incluindo aqueles reversivelmente reticulado com formaldeído, assim como as proteínas de membrana solubilizadas com detergentes. Finalmente, a reticulação química não altera significativamente as propriedades físicas da resina de Strep-Tactin, tornando a resina reticulada potencialmente apropriado para aplicações de alto rendimento.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Agradecemos o apoio técnico da Sini Miettinen, Minna Pöllänen e Taru Rautavesi. Agradecemos Helka Nurkkala para fornecer HEK 293 células expressando twin-Strep-marcado GFP e Pekka Evijärvi para o fornecimento de equipamentos de gravação de som. Este trabalho foi financiado pela Academia da Finlândia, conceder números 138329, 134684 e 258978.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg Pierce/Thermo Scientific 21585 www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) IBA 2-1505 www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile Costar (Corning) 8163 www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes Costar (Corning) 3213 www.corning.com/lifesciences/
Avidin  IBA 2-0204 www.iba-lifesciences.com

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References

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