광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation

Bioengineering

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Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (90), e51542, doi:10.3791/51542 (2014).

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Abstract

인간 게놈의 상당 부분이 전사하지만 번역되지 않습니다. 이 게시물 게놈 시대에, RNA의 규제 기능은 점점 더 중요한 것으로 나타났다. RNA의 기능은 종종 다른 구조를 채택하는 능력에 달려있다, 그것은 직접적 RNA 서열로부터 삼차원 구조를 예측하는 것은 곤란하다. 단일 분자는 한 번에 하나의 분자 구조 분자를 모니터링하여 RNA 구조 다형성의 문제를 해결하기 위해 쇼 전위에 접근한다. 이 작업은 정확하게 광 핀셋을 사용하여 단일 RNA 분자의 폴딩 구조를 조작 할 수있는 방법을 제시한다. 첫째, 방법은 단일 분자 기계 작업에 적합한 분자가 설명되어 합성합니다. 광 핀셋의 적절한 운영을 보장하기 위해 다음, 다양한 교정 절차가 설명되어 있습니다. 다음으로, 다양한 실험을 설명한다. 기술의 유틸리티를 설명하기 위해 기계적으로 전개 RNA 헤어핀의 결과와 단일 RNA 키신g 단지는 증거로 사용된다. 이러한 예에서, nanomanipulation 기술은 독립적으로, 2 차 및 3 차 구조를 포함하여 각 도메인의 폴딩을 연구하기 위해 사용되었다. 마지막으로, 한계와 방법의 미래 응용 프로그램이 논의된다.

Introduction

광 핀셋 기술의 개발은 오랫동안 생물학 연구에서의 응용 프로그램과 함께 제공하고있다. 광 포획 효과가 처음 발견되었을 때, 아서 Ashkin 오염 된 물에서 박테리아 레이저 포커스 하나에 포획 될 수 있음을 관찰 하였다. 그 이후로, 박테리아는 생물 물리학 학생들의 세대에 대한 의도하지 않은, 재미 실험뿐만 아니라 미생물 생리학 2,3를 공부하는 심각한 연구 도구가되었습니다 덫. 광 트래핑 기술은 미세 가공 대상물 (1)을 고정화 집속 레이저 빔을 사용한다. 실제로, 또한 트랩 (ΔX)의 중심으로부터 변위에 의해 포획 된 개체에 힘 (F)을 측정 광 스프링 같은 레이저 트랩 기능한다. κ 짧은 범위, F = κ X ΔX, 내 트랩의 스프링 상수이다. 트랩은 광에 마이크로 picoNewton (PN) 정밀도로 힘을가하도록 사용될 수있다copic 객체와 나노 미터 (nm의) 정확도로 위치를 측정한다. 지난 20 년 동안 광 핀셋 생물 물리학에서 가장 일반적으로 사용되는 단일 분자 기술 중 하나가되었다. 이 기술은 폴딩 및 DNA 4-6, 7-9 RNA, 단백질 10, 11의 역학을 연구하기 위해 사용되어왔다. 광 핀셋은 DNA 복제 12, RNA 전사 (13), 및 단백질 합성 14,15,뿐만 아니라 많은 다른 생체 분자 이벤트 16-18을 관찰하는데 사용되었다.

단일 분자 방법은 주로 RNA의 견고한 접이식 에너지​​ 풍경을 탐구하는 RNA 구조의 연구에 사용된다. RNA 서열은 일반적으로 인해 RNA의 간단한 화학 조성 및 기재 페어링 규칙 여러 안정한 상호 배타적 구조로 접을 수있다. 이것은 긴 RNA 구조 다형성, 즉 리보 스위치 (19, 20)에서 발생하는 등, 유전자 조절에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. recent 게놈 전체의 조사는 몇도 크게 셀룰러 사체 (21)의 큰 부분의 구조 및 단백질 합성에 영향을 작게하는 온도 변화를 밝혔다. 이 예는 이전에 생각보다 다른 RNA 폴딩의 생물학적 역할은 아마도 더 중요하고 널리 퍼져 있음을 암시한다. 구조 다형성은, 그러나, 많은 분자의 평균 속성을 검사 기존의 생화학 및 생물 물리학 적 접근 방법에 대한 도전을 포즈. 예를 들어, "을"과 riboswitch "오프"를 입체 형태는 상호 배타적입니다. 이종 구조에서 파생 된 평균 구조는 생물학적으로 관련 이형를 닮은 것 같지 않다. 또한, 번역되지 않은 RNA와 mRNA의 보통 구조를 형성한다. 단백질과 RNA를 규제와의 상호 작용은 일반적으로 상호 작용의 일환으로 기존 구조의 전개가 필요합니다. 따라서 RNA 전개 / 접힘을 공부하는 것은 해당된다RNA 생물학의 문제를 해결합니다. 이러한 과제를 해결하기 위해, 단일 분자 방법은 한 번에 22 ~ 27에 하나의 분자를 연구함으로써 RNA 구조 다형성을 해명하기 위해 사용되었습니다.

인기 단일 분자 형광 방법에 비해 기계적인 전개 기반 핀셋 개별 분자의 입체 형태는 가해진 힘에 의해 조작 될 수 있고, 나노 미터 정밀도로 측정 할 수있는 장점을 제공한다. 이 기능은 nanomanipulation 큰 RNA의 계층 폴딩 28 해부 될 수있는 개별적인 구조적 도메인의 전개 / 폴딩을 모니터하기 위해 이용 될 수있다. 대안 적으로, 단일 가닥 여러 이형태 중 하나에 접하도록 지시 할 수있다; 또는 기존의 구조가 기계적으로 서로 다른 형태 (29)에 접힘하도록 유도 될 수있다. 생물학적 조건에서 RNA 구조가 온도 변화 또는 리간드 결합시에 변경 될 수있다. 직접 조작의 분자의 능력tructure는 RNA 구조 연구의 새로운 장을 엽니 다. 원칙적으로, 예컨대 원 자간 력 현미경과 자기 핀셋과 같은 다른 기계적 방법은 또한 단일 RNA 분자의 폴딩을 연구하는데 사용될 수있다. 그러나, 이러한 애플리케이션으로 인해 상대적으로 낮은 공간 해상도 (30)에 크게 제한된다.

광 핀셋의 고용은 RNA 구조가 기계적인 힘에 의해 전개 할 수 있습니다.

전개 기계의 장점은 여러 가지다. 금속 이온과 리간드 유도 된 폴딩은 주로 차 구조로 한정되는 반면에 힘은 모두 2 차 및 3 차 구조를 전개 할 수있다. 온도 및 변성제 크게 물과 용질의 활동에 영향을 미칠 수있다. 반대로, 힘은 분자 구조를 교란하는 국소 도포; 주변 환경에의 힘의 영향은 무시할 수있다. 또한, 용융 온도가 가장 작은 RNA 구조의 접힘 열역학을 연구하는 데 사용되는,광 핀셋은 일곱베이스 쌍 tetraloop의 머리 핀의 자형으로 28에서 400 염기 라이 보자 임 (31)에 이르기까지 다양한 크기와 RNA의 구조를 연구하는 데 사용 된 반면. 또한, RNA의 구조는 기계적으로 중온 온도에서 전개 될 수있다. 대조적으로, 열 용융 실험에서의 RNA를 펼쳐, 온도는 일반적으로 상당히 잘 특히 Mg를 2 + 이온의 존재하에, RNA 가수 분해를 증가 생리적 온도 이상으로 상승된다.

그것은 힘의 기계적 효과가 구조에 적용되는 방법에 의존한다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 가해진 힘은 접는 에너지 풍경을 올라옵니다. 예를 들면, 힘이 머리핀에 적용될 때, 염기쌍 순차 시간 (도 1A)에 하나씩 세분화된다. 리핑 포크 가해진 힘에 수직 인 나선 축을 따라 진행한다. 최소한 키스 착체가 신장 상태로되면 반대로,이 키스가해진 힘에 평행 염기쌍은 힘로드를 공유 (도 1B). 2 차 및 3 차 폴딩 (28, 32)를 구별하기 위해 이용 될 수있는 서로 다른 기계적 응답에 가해진 힘의 결과로 헤어핀과 키스 복잡한 상대의 다른 형상. 전개 기계의 이론적 측면은 이전에 8,9,30을 검토하고있다. 이 작품은 설정하고 단일 분자 기계 전개 분석을 수행 할 수있는 기본적인 방법을 설명합니다.

실험 설정. 우리의 기계 당기는 실험에서, 협 지부의 RNA 샘플은 두 개의 이중 가닥 DNA / RNA 손잡이로 측면에 관심있는 RNA (그림 2)로 구성되어 7. 전체 분자는 각각-비오틴 스트렙 타비 딘과 디그 옥시 제닌 항 디곡 시게 닌 항체의 상호 작용을 통해 표면이 피복 미크론 크기의 비드 (Spherotech)에 닿는 될 수있다. 한 비드 힘 측정 광학 조원에 의해 개최됩니다AP는 다른 반면, 마이크로 피펫의 선단에 유지된다. 비드 사이의 상대 거리가 트랩 조향 또는 마이크로 피펫을 움직이는 하나에 의해 변경 될 수있다. 이 방법을 사용하여 비드를 테 더링 단일 RNA 분자는 연신 및 완화 될 수있다.

샘플의 준비. 협 지부에 대한 RNA 샘플의 합성은 몇 단계 (그림 3)를 포함한다. 먼저, 관심 RNA에 대응하는 DNA 서열은 제 플라스미드 벡터 내로 클로닝된다. 다음으로, 세 PCR 반응은 두 개의 손잡이와 전사의 템플릿을 생성하기 위해 수행된다. 전사 템플릿 핸들 영역 및 삽입 된 서열을 포함한다. 전체 길이의 RNA는 시험 관내 전사에 의해 합성된다. 마지막으로, RNA 및 화학적으로 변형 핸들은 협 지부에 대해 분자를 생성하기 위해 함께 열처리된다.

보정 및 핀셋의 작동. Minitweezers 사용의 기본적인 디자인이 작품의 D는 듀얼 빔 광 핀셋 (33)의 다음과 같습니다. 첫 번째 세대 광 핀셋에 비해 많은 개선으로, Minitweezers 특별한 안정성을 표시합니다. 여러 나라에서 연구 그룹의 숫자는 단일 분자 연구 14,15,34-37에 Minitweezers를 사용합니다. 교육 비디오를 포함하여 장치의 건설, 교정 및 운영의 세부 사항은, "족집게 연구소"웹 사이트 (http://tweezerslab.unipr.it)에서 사용할 수 있습니다. 여기서, 염기 매일 수행되어야 개선 및 교정 과정을 상세히 설명한다.

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Protocol

단일 분자 협 지부에 대한 RNA 분자의 1 준비

  1. 관심 서열 복제. 벡터에 RNA 구조에 대응하는 DNA 서열을 복제.
  2. 합성 및 전사 템플릿의 정화. PCR에 의한 전사 템플릿을 합성. [여기서 도시 표 1] 다음에, PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 제품을 정제하고,> 200 NG / μL로 샘플을 집중한다. 정제 된 DNA가 전사를 위해 사용되기 때문에,의 RNase가없는 물 용출 농도 단계에 사용한다.
  3. 시험 관내 전사합니다. RNA 수율을 극대화하기 위해 밤새 37 ° C에서 시험 관내 전사에 의해 RNA를 합성. 전사 후 [여기 장소 표 2], 나는 37 ° C에서 15 분 동안 DNA 템플릿을 소화 한 μL의 DNase를 추가합니다. 실리카 스핀 컬럼을 사용하여 RNA를 정제 하였다.
  4. 비오틴 핸들 A.의 합성 먼저, 프라이머 AF 및 아르곤과 진한 PCR을 사용하여 개질 된 핸들을 생성증폭 된 DNA> 200 NG / μL로를 entrate. 다음으로, 프라이머 신장 반응을 이용하여 PCR 생성물로 바이오틴 변형을 통합한다. [장소 여기 표 3] NOTE : 바이오틴 손잡이 A (비오틴-HA)을 정제없이 직접 어닐링에 사용될 수있다. 비오틴-HA는 RNA에 어닐링 할 수있는 바와 같이, 그것은 두 단계의 RNase없는 물을 사용하는 것이 중요하다.
  5. 디그 옥시 제닌 수정 핸들 B.를 합성의 합성 프라이머 Bf로와 디그 옥시 제닌 수정 올리고 파 - BR (그림 3)를 사용하여 PCR에 의해 핸들 B (발굴-HB)를 수정 디그 옥시 제닌. 이어서, PCR 생성물을 정제하고> 200 NG / μL로 샘플을 집중한다.
  6. 핸들에 어닐링 RNA. 핸들 RNA를 어닐링. [여기서 도시 표 4 및 표 5]
  7. 단련 된 샘플을 정화. 열처리 된 시료의 에탄올 3 볼륨을 넣고 잘 섞는다. 적어도 1 시간 동안 -70 ℃에서 혼합물을 저장합니다. 15,800 XG에 스핀 다운 및 상층 액을 제거한다. 동결 건조기를 사용하여 펠렛을 건조시킵니다. 에서 펠렛을 녹여100 μL의 RNase없는 물. 참고 : 샘플을 사용할 준비가 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.

광 핀셋의 2 교정 및 운영

  1. 비디오 모니터의 픽셀 크기를 보정
    1. 트랩으로 알려진 지름 (크기 기준)와 비드를 광 트랩을 사용합니다.
    2. 이미징 소프트웨어를 사용하여 포획 된 구슬의 캡처 이미지 (그림 4).
    3. 중심 법에 의한 이미징 소프트웨어를 이용하여 비드의 직경을 결정한다.
    4. 다른 크기의 구슬의 직경을 결정하기 위해이 절차를 반복합니다.
    5. 화소의 물리적 크기를 얻기 위해 선형 회귀에 의해 측정 한 비드의 직경 및 공지를 장착한다.
  2. 거리 보정 확인
    1. 트랩에 비드를 광 트랩을 사용합니다.
    2. 촬상 소프트웨어에 의해 그 무게 중심의 화소 위치를 결정하고 Minitweezers를 사용하여 위치를 기록한다.
    3. diffe하는 비드 스티어 위치를 임대하고 위치 결정을 반복합니다.
    4. 교정 픽셀 크기를 이용하여 m 단위로 화소로부터 비드의 X 및 Y 위치를 변환한다.
    5. 비디오 의해 Minitweezers 측정 위치 사이의 X 및 Y를 비교한다. 값의 두 세트에 동의한다. 이미지 해상도가> 0.1 μm의이기 때문에 정확도를 보장하기 위해 측정 사이에 1 μm의를 통해 비드를 이동합니다. 거리 보정 Minitweezers에 기억 한 필적 없으면 계측기를 재조정.
  3. 트랩 강성 교정
    1. 광학 트랩을 사용하여 구슬을 캡처 여전히를 개최합니다.
    2. 3 초 동안 속도> 5 kHz에서 바이 패스 고속 데​​이터 수집을 사용하여 트랩의 힘을 기록한다.
    3. 소프트웨어를 이용하여 비드의 기록 동작에서 전력 스펙트럼을 생성한다. 로렌츠 (그림 5) (38) 파워 스펙트럼에 맞는 :
      542 / 51542eq1.jpg "너비 ="200 "/> (식. 1)
      어떤 S (F)는 F의 주파수에서의 힘을, F (C)는 코너 주파수이고, S는 0 점근 전력이다. 코너 주파수는 C F, 열 동작 전원이 점근 값의 절반으로 감소 주파수이다. F (C)가 레이저 파워와 구슬의 크기에 따라 달라집니다으로, 개별적으로 갇혀 비드를 교정.
    4. f를 C에서 트랩의 스프링 상수 κ를 계산한다 :
      식 (2) (식. 2)
      하는 γ는 비드 (식. 3)의 항력 계수이다. 힘의 변화에​​서 RNA의 확장 변경 사항을 결정하기 위해 스프링 상수를 사용합니다.
  4. 스토크 법률 테스트
    1. 광 트랩을 사용하여 비드를 캡처. 백업 및 힘 비드를 이동 다른 속도로.
    2. 구슬의 움직임을 기록하고 Minitweezers을 이용한 강제.
    3. 비드의 반경을 계산한다.
      NOTE : 마찰력, F d를, 유체의 구형 입자의 움직임에 의해 생성은 스토크의 법칙에 의해 설명 될 수있다 :
      식 (3) (식. 3)
      R은되는 구의 반경, V는 속도이다, h는 참조 테이블에서 발견 될 수있는 유체의 동점도이다. F의 D와 같은 힘을 측정하여, 비드 부의 반경은 식을 사용하여 계산 될 수있다. 3 (그림 6) 및 이미지 수집 소프트웨어에 의해 결정이 동의해야한다. 스톡스 법칙 테스트 효과적으로 전체적인 교정 및 기기의 성능을 테스트한다.

단일 RNA 분자의 3 Nanomanipulation

  1. 유체 만들기.
    1. 2 번 커버 유리에 6 홀 (2mm 직경 각) (도 7a)를 뚫고 (7B 그림) 레이저 조각기를 사용하여 양면 폴리이 미드 테이프로 세 슬릿 (2mm 폭을) 잘라.
    2. 양면 캡톤 테이프의 두 층으로이 커버 유리를 끼워 흐름 챔버를 확인합니다. 테이프 (그림 7C) 사이에 마이크로 피펫과 두 개의 바이 패스 튜브를 삽입합니다.
    3. 유체 구멍 (그림 7D)을 일치시켜 금속 프레임 상에 유량 용기를 탑재합니다.
    4. 폴리에틸렌 호스 (그림 7E)를 통해 선택의 버퍼 가득 10 ML 주사기로 챔버의 유체 채널을 연결합니다.
    5. 두 목표 사이의 광 핀셋에 전체 챔버를 탑재합니다. 유체 채널 챔버의 앞면이 오른쪽으로 향하도록해야합니다. 올바른 목표를 후퇴와 t에 장착 구멍에 프레임 (그림 7E)의 황동 핀 플러그그는 핀셋. 챔버의 위치를​​ 고정하는 나사를 조입니다.
  2. 열처리 된 시료와 구슬을 혼합. 안티 - 디그 옥시 제닌 코팅 구슬 (발굴 구슬)로 어닐링 샘플을 혼합하고,이 혼합물은 5 ~ 10 분 동안 실온에서 체류 할 수 있습니다. 전형적으로, 어닐링 된 시료 1 ㎕의 완충액 1 ㎖에 5 ㎕를 발굴 비드와 혼합된다. NOTE : 비드의 양은 유동 챔버로 로딩되는 비드의 적당한 양이 바이 패스 관으로부터 전달되도록 보장하기 위해 선택되어야한다. 비드 어닐링 시료의 비율은 쉽게 정량화 될 수 없다. 이상적인 경우에, 대부분의 비즈 비즈의 작은 부분 만이 비드 당 하나의 RNA 분자를 가질 수 있도록 RNA에는 없다. 어닐링 된 샘플 및 비드 현탁액을 정량화하기 어렵다 같이, 유일한 방법은 현재 가장 및 혼합비를 변화와 핀셋 혼합물을 테스트하는 것이다.
  3. 마일 위에, (유동 챔버에서 반응 사이트로 수 마이크로 미터 구슬 배달cropipette 팁, 그림 7C).
    1. 1 ML의 주사기에 스트렙 타비 딘 - 코팅 구슬 (연쇄상 구균 구슬)의 현탁액을로드합니다.
    2. 유량 용기 (도 7a)의 바닥 채널로 이어지는 유체 튜브에 주사기를 연결합니다.
    3. 챔버로 패 혈성 구슬을 흘러 주사기를 밀어 넣습니다.
    4. 바닥 바이 패스 관 (도 7b)의 개구 근처 광 트랩을 배치하는 모터 제어 소프트웨어를 사용하여 전체 챔버를 이동. 그런 다음 연쇄상 구균 구슬을 캡처하는 트랙볼에 의해 광 트랩을 운영하고 있습니다.
    5. 모터 제어 소프트웨어를 사용하여 마이크로 피펫의 선단 주변의 비드를 이동.
    6. 마이크로 피펫에 비드를 빨아 마이크로 피펫에 연결된 주사기를 당깁니다.
    7. 추가 연쇄상 구균 구슬을 세척하는 중간 채널에 주사기를 눌러 부드럽게 흐름을 적용합니다.
    8. 유사하게, 시료의 혼합 챔버의 상부 채널 발굴 - 비즈 (단계 3.2 참조) 전달.
    9. 발굴 비드를 캡처 및 광학 트랩을 사용하여 연쇄상 구균 - 비드가 가까이 가져.
    10. 흐름을 적용하여 중간 채널을 청소합니다. NOTE : strep- 그들이 뷰 현미경 하에서 시각적으로 구별 될 수 있도록 비드가 DIG 다른 사이즈로 선택된다 (도 4).
  4. 낚시 '구슬의 쌍 사이에 테 더링 단일 분자.
    1. 연쇄상 구균 비드 (그림 4)의 상부에 수직으로 발굴 비드를 놓습니다.
    2. 트랩을 핸들에 의해 아래로 연쇄상 구균 구슬을 향해 발굴 비드를 이동합니다. 힘의 변화를 시각화하는 컴퓨터의 힘 - 거리 그래프 창을 엽니 다.
    3. 이 구슬의 접촉시, 수직 거리 패 혈성 구슬에서 발굴 구슬을 이동합니다.
    4. 특정 접촉이 이루어지지 않은 경우, 힘은 거의 제로 남아있다. 이 비드 분자에 의해 접속하는 경우에는, 힘이 크게 증가이 비드를 분리 할 때. 일반적으로 "낚시"라고 함이 절차는 종종 상승률이며구슬의 각 쌍에 ORMED 여러 번 효과적인 단일 분자 연결 고리를 찾을 수 있습니다.

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Representative Results

공간에 의해 제한, 단일 RNA 분자의 nanomanipulation는 기계 전개 RNA 헤어핀의 예와 차 구조를 가진 RNA를 표시하여 설명된다.

단일 머리 핀 분자를 조작

테더가 비드 사이에 확립되면, 테더에 연장 및 힘은 사용자 정의 된 프로토콜을 사용하여 조작 될 수있다. 일반적인 네 개의 조작 프로토콜은 일반적으로 사용된다.

포스 램프 실험. 단일 RNA를 조작하는 가장 직관적 일반적인 실험 (세로도 4에 도시 된 바와 같이) 반복 스트레칭 및 핸들의 헬리컬 축 방향으로 분자를 완화하는 것이다. 힘 F, 및 트랩 위치를, Y는, 시간의 함수로서 기록된다. TRA의 스프링 상수 인 F / κ - 분자 (E)의 확장은, E = Y에 의해 계산 될 수있다페이지. 결과 당기는 힘 - 신장 곡선 (도 8a)으로 표시 될 수있다. 이중 가닥 핸들의 스트레칭은 양의 기울기로 상승 곡선으로 표시됩니다. 핸들 이완 곡선은 연신 되짚어. 간단하고,이 상태 접이식 머리 핀의 자형의 구조 전환은 하나의 협력 전개 전환 39을 나타내는 음의 기울기와 "립"을 표시합니다. 머리핀의 폴딩은 힘 - 확장 곡선에 "지퍼"로 표시됩니다. 중요한 것은, 같은 분자 펼쳐 다른 힘에 때마다 리 폴딩 할 수있다. 이러한 경향은 전이의 힘 (도 8b)의 분포에 분명하다. 일반적으로, 힘은 고정 된 로딩 / 언 로딩 속도, 시간의 선형 함수로 변화된다. 일정한 적재 / 하적 속도에서 힘 종속 동역학은 전이 40-42 힘의 분포로부터 추출 될 수있다.

일정한 힘 실험. 일정한 힘 모드에서 장비가 설정치로부터 힘 편차를 보상하기위한 피드백 메커니즘을 사용한다. RNA 분자의 확장은 신장 분자 상태의 관찰 및 정량화를 가능하게하는 특정 RNA 분자 전이의 전이 힘 또는 근처에 힘을 설정. 시간 (도 9)의 함수로서 기록된다. 각 상태에서의 분자의 수명은 구조적 전이 (7)의 동력학을 계산하기 위해 함께 풀링 될 수있다. 일정한 힘의 실험은 같은 머리핀 7,28의 것과 같은 가역 접는를 모니터링하는 데 사용됩니다.

포스 점프 실험. 힘 점프 실험에서 힘이 빠르게 다른 값으로 변경하고 일정하게 유지된다; 제 천이의 수명은 43 모니터링된다. 힘 점프의 반응 속도를 특성화 할 때 특히 유용합니다비가역 과정, 순방향 및 역방향의 수명 반응은 직접 다른 힘에 개별적으로 측정 될 수 있기 때문이다. 각 힘 점프 / 드롭에서, 단 하나의 유효 기간이 관찰된다. 따라서, 이러한 실험은 여러 발사 동력학을 추출하기에 충분한 관측을 수집하기 위해 수행 될 필요가있다.

수동 실험. 수동 모드에서 트랩 및 마이크로 피펫의 위치는 둘 다 (그림 10)를 고정됩니다. 머리핀은 전이 세력 근처 펼친 접힌 RNA에 해당하는 두 개의 상태를 나타낸다. 일정한 힘 실험, 힘과 구조 전환에 따라 분자 변화의 확장을 모두 달리. 분자 전환을 피드백 제어를 가능하게 제거하는 것은 바로 외부의 간섭없이 모니터링 할 수 있습니다. 그러나, 수동 모드가 계시 하에서 일정한 힘을 유지하는 것이 곤란하다. 광학 트랩에서 포획 된 구슬 확산으로, 힘의 변화에​​ 따라. 목전자 패시브 모드 크게 변경된다 강제되는 동안 긴 체류 시간과 분자 상태를 측정하기위한 적합하다. 일정한 힘 및 수동 모드의 장점과 단점은 광범위하게 연구와 44를 논의되었다.

2 차 및 3 차 구조의 해명 접는

기계 연결된 두 GACG의 tetraloop 헤어핀에 의해 형성된 두 개의 염기쌍 키스 RNA의 전개는 여기에 예 (그림 11A)로 사용된다. 줄기 서열이 다르지만 둘 다 9 염기쌍 줄기 헤어핀. RNA (그림 11A)의 기계적 전개 경로는 힘 램프 방법 (34)을 특징으로하고있다. 힘이 발생되는 경우, 키싱 복합체는 제 머리핀의 전개 순차 뒤에 끊어. 폴딩에서 헤어핀 낮은 힘에서 키스 상호 작용에 의해 다음에, 첫번째 배. 이러한 전환은 힘 - 확장 곡선에 볼 수 있습니다 (그림11B). 머리핀 전환의 할당을 확인하려면, 헤어핀 각각 개별적으로 공부하실 수 있습니다. unkissing / 키스 천이 할당 tetraloops 키스가 상호 작용 (28)의 형성을 방지하는 돌연변이 된 돌연변이 RNA를 연구함으로써 검증 될 수있다. 대안 적으로, 낮은 힘 키스 힘보다 10 PN, 설정 될 수있다. 예상대로, 같은 조건에서 강제 확장 곡선은 헤어핀 (그림 11C) 34 만 전개 / 접힘을 표시합니다. 따라서 다른 힘에 독립적으로이 머리핀의 키스 상호 작용과 각 접는 조사 할 수있다.

그것은이 머리핀의 접는 키스 상호 작용이 매우 다른 unkissing 키스 힘에 의해 알 수있는 바와 같이, 매우 돌이킬 수없는 반면, 가역적이며, 큰 히스테리시스에 의해 것이 눈에 띈다. 따라서, 머리핀의 접힘 동역학을 연구 할 수 directlY는 일정한 힘을 사용하여 실험. 키스 상호 작용의 반응 속도는, 그러나, 힘 점프 방법을 사용하여 측정되어야한다. 그림 12A는 일반적인 힘 점프 실험 28을 보여줍니다. 3 PN에서 전체 RNA는 절첩된다. 힘은 빠른 속도로 22 PN로 상승하고 일정하게 유지된다. 잠시 후, 전체 RNA는 30 내지 ~ 연장의 갑작스런 증가에 의해 명백한 바와 같이, 단일 가닥으로 전개된다. 이 13 PN로 저하되기 전에 힘은, 상기 RNA를 스트레칭하는 PN 30로 상승한다. 헤어핀의 접는 후, 힘은 신속하게 8 PN에 삭제됩니다. 키스 복합체의 형성은 ~ 7-8 nm의에 의해 연장의 단축으로 표시됩니다. 이들 수명 측정의 많은 수집 unkissing와 일정한 힘에 속도론 키스함으로써 계산 될 수있다.

모든 실험 조건에서 키스 단지는 항상 먼저 전개된다. 헤어핀 스스로 불안정 힘에서, 키스 상호 작용이온 전개에서 머리 핀의 자형 구조를 보호합니다. 이러한 속도 제한 효과는 힘 점프 실험을 통해 공개된다. 힘이 16 PN에 점프 28도 12b에 도시 된 바와 같이, 분자의 확장은이 20 nm ~ 의해 펼쳐진 증가 연장이어서 몇 초 동안 크게 변하지. 확장의 변화는 약한 일곱베이스 쌍의 머리핀이 키스 복잡한의 붕괴 직후에 펼쳐진 지적했다. 머리핀의 준 안정성은 수명에 의해 분명하다. 키스가 파손되면, 머리 핀의 자형으로 빠르게 접어 펼친 상태 사이에서 천이; 수명은 1 초 미만이다. 본질적으로,이 관찰은 머리핀을 전개하기위한 일정한 힘 실험이다. 반면에, 그것은 머리핀과 함께 키스 복잡한 휴식을 10 초 이상 걸립니다. 유사하게, 힘은 전체 RNA에 의해 명백한 바와 같이, 단일 가닥으로 전개되는 PN 17.7 (도 12C)에 점프~ 30 나노 미터의 확장에 주름. 확장이 두 값 사이에 홉으로 대형, 11 염기쌍의 머리 핀의 자형의 쌍 안정성 볼 수 있습니다. 다시, 머리 핀의 자형의 짧은 수명은 준 안정 상태에서의 긴 수명 대조적이다. / 폴딩 단계를 전개하는 힘과 힘 램프 점프 실험, 열역학 및 동역학의 개별의 조합을 사용하는 것은 28를 측정 할 수있다. 키스 복합체의 파괴와 형성의 직접 관측은 최소한의 키스 복합 (34)에 기지를 플 랭킹의 정력적인 기여를 분석하고 키스 상호 작용 (45)의 소금 의존도를 측정하기 위해 우리가 할 수 있습니다.

그림 1
가해진 힘에 대해 그림 1 RNA 구조. 장력 미만) 머리핀. b) 두 개의 기저 풀링쌍은 복잡한 키스. 이 머리 핀의 자형 루프는 빨간색과 노란색 색상으로되어 있습니다.

그림이
그림 2 실험 설정. RNA의 구조는이 DNA / RNA 손잡이로 측면에 선다. 핸들의 단부에 화학적 변형을 통해, 전체 분자는 단백질 코팅 마이크론 크기의 한쌍의 비드에 연결될 수있다. 구슬 중 하나가 조종 힘 측정 광학 트랩에 의해 개최됩니다. 다른 하나는 압전 정밀 모션 스테이지에 의해 구동되는 마이크로 피펫에 배치된다. 도면은 확장 할 수 없습니다.

그림 3
그림 3 핸들 RNA 분자를 합성하는 일반적인 방식. 핸들 A, B를 처리하고, transcription 템플릿은 복제 된 RNA 서열과 플라스미드로부터 PCR에 의해 생성됩니다. 핸들은 3 '말단에 dig​​oxigenins (발굴)에 의해 수정된다. 핸들 B는 한 가닥의 5 '말단에 비오틴 수정이 있습니다. 전체 길이 RNA가 전사 템플릿에서 전사한다. RNA 및 변형 된 핸들 혼합 소둔이다. 적절하게는 스트렙 타비 딘 분자 및 항 - 디곡시 제닌 항체로 코팅 된 비드의 쌍에 속박 될 수있다. 도면은 확장 할 수 없습니다.

그림 4
비디오로 촬영 된이 구슬 사이의 단일 분자 낚시의 4 이미지 그림 카드. 한 비드 흡입하여 마이크로 피펫의 끝 부분에 배치됩니다. 다른 개최 및 힘 측정 광학 트랩에 의해 조종된다. 트랩 운동의 방향이 화살표로 표시됩니다. 갇혀 비드 첫번째 이동수직 마이크로 피펫에 구슬을 향해. 접촉시, 포획 된 비드가 위로 이동합니다. 테더가 비드 사이에 확립되면 분자가 확장 될 때, 비드의 분리 및 분자 력 증가에 당긴다. 이 구슬이 어떤 분자가 연결되지 않은 경우, 후퇴 동작은 힘을 생성하지 않습니다.

그림 5
도 5 트랩 비드 브라운 운동의 파워 스펙트럼. 실선 인서트에 도시 된 로렌츠 방정식 (식. 1)에 적합하다. 트랩의 스프링 상수는 코너 주파수 (식. 2)로부터 계산 될 수있다.

그림 6
그림 6 스토크 법 시험의 예.

그림 7
그림 7, 협 지부에 대한 유량 용기. a) 여섯 구멍 2mm의 직경은 각각 세 2mm 넓은 슬릿 양면 폴리이 미드 테이프로 절단된다. b) 레이저 조각기를 이용하여 제 2 커버 유리에 천공된다. c) 확대 모습 마이크로 피펫 및이 바이 패스 튜브를 포함하는 영역에서의 실험. 상부 및 하부 채널로부터 비드 CEN으로 각 바이 패스 관 (청색 및 녹색)을 통하여 이송화살표로 나타낸 방향으로 TRAL 채널. d)는 유체 구멍을 일치시켜 금속 프레임 상에 유체 챔버를 탑재. 전자) 파이프 플로우에 연결된 3 채널 챔버. 중심 통로는 RNA 당기는 위해 사용된다. 상단 (파란색)과 바닥 (녹색) 채널은 구슬을 제공하는 데 사용됩니다. 실험 영역은 빨간색 사각형으로 표시됩니다.

그림 8
8 포스 램프를 그림. 기계적으로 머리 핀의 자형의 전개의) 힘 - 신장 곡선. 당기 빨간색 파란색과 휴식에 표시됩니다. 머리핀의 전개 / 폴딩은 화살표로 표시됩니다. b) 항 (파란색) 전개와 머리핀 (빨간색) 힘을 폴딩의 분포. 그림은 제출 된 원고 39에서 구성된다.


그림 9 일정한 힘에서 RNA의 머리핀. 실험) 다이어그램. 머리핀. B에서 일정한 힘을 유지하기 위하여 트랩의 위치는 헤어핀 UN / 폴딩 대 시간)의 피드백을 통해 강제로 위치를 변경한다. 힘이 일정하게 유지되기 때문에, 트랩의 위치는 힘의 머리핀의 쌍 안정성을 나타내는 두 개의 값 사이에서 변동한다. 트랩 분포의 이항 분포는 19.4 ± 0.2 nm의의 전개 머리핀시 확장 변화를 얻을 수 있습니다. 그림은 제출 된 원고 39에서 구성된다.

그림 10
머리 핀의 자형 (10)의 수동 모드를 그림. ) 확장자) 력. B 증가 멀리 트랩의 중심에서 포획 된 비드를 제공하는 포스 단축 및 수동 모드에서 머리핀의 대 시간 연장.

그림 11
두 개의 염기쌍 키스 RNA의 그림 11 강제 램프. 기계적인 긴장. 아래 두 염기쌍 키스 RNA의) 계층 접이식) 포스 확장 곡선. 구조 전환 화살표. 다) 가장 힘이 키스 상호 작용을 방지하기 위해 10 PN 설정되어 힘 - 신장 곡선으로 표시됩니다. Fi를gure는 저널 미국 화학 학회 (34)의 허가를 맞게된다.

그림 12
두 개의 염기쌍 키스 RNA의 그림 (12)을 강제로 점프. ) 힘 점프 / 드롭 사이클은 두 개의 서로 다른 세력에서 unkissing 키스 수명을 측정합니다. 상단 패널은 힘의 시간 추적을 도시한다. 하단 패널은 분자의 상대적인 확장을 나타낸다. 힘은 제 22 PN에서 키스 착체의 수명을 측정하기 위해 22 내지 PN 3 PN에서 뛰어된다. unkissing는 한 가닥으로 전개 된 전체 RNA를 나타내는 ~ 30 nm의에 의해 확장의 빠른 증가에 의해 표시된다. 이완에 힘이 헤어핀이 접힘 있도록 14 내지 PN 램핑 다운된다. 힘은 PN 팔에 삭제됩니다. 키스 상호 작용의 형성은 ~ 7-8 nm의 연장에 감소로 표시됩니다. 나)힘이 16 PN에 점프로, 시간 연장 추적은 머리핀이 전개 빠르게 refolds. 다) 전체 키스 단지는 이후 전개하는 키스 복잡하고 칠베이스 쌍의 머리핀, 몇 초간의 시간이 소요되는 표시 힘이 후 몇 초 17.7 PN에 점프 한 가닥으로 전개. 나머지 트레이스는 11 염기쌍의 머리 핀의 자형의 쌍 안정성을 보여줍니다. 키스 RNA를 전개의 구조 전환의 각 수치는 과학 (28)의 국립 아카데미 논문집 허가를하도록되어 독특한 X를 보여줍니다.

시약 μL
플라스미드 (10 NG / ㎖) 10
프라이머 T7f (100 밀리미터) 10
프라이머 브롬 (100 밀리미터) 10
의 dNTP 믹스 (25 mM의 각) 10
10 배PCR 버퍼 100
H 2 O 850
의 Taq DNA 중합 효소 10
전체 1000

참고 : 3 KBP의 DNA를 합성하는 일반적인 열 사이클이다 : 95 ° C 45초, 53 ° C 일분, 72 ° C 삼분.

표 1 전사 템플릿을 합성 PCR의 예.

시약 μL
템플릿 (> 200 NG / ㎖) 8
NTPS 8 (2 ㎖의 각)
10 배의 반응 완충액
T7 RNA 폴리머 라제
전체 20

참고 : 37 ° C의 overni에서 반응을 품어GHT.

시험 관내 전사에서 표 2.

시약 μL
A (~ 10 mg)을 핸들 50
비오틴-11UTP 5
T4의 POL 반응 완충액 5
BSA 솔루션 1
T4 DNA 폴리머 라제 5
전체 66

참고 : 20 분 동안 실온에서 반응을 배양한다. 실온까지 천천히 냉각 한 다음, 20 분간 70 ° C로 가열하여 효소를 실활.

표 3 프라이머 신장 반응.

시약 μL
포름 아미드 800
EDTA (0.5 M, pH를 8.0)
파이프 (1 M, pH를 6.3) 40
염화나트륨 (500) 80
전체 922

어닐링 완충액 레시피 표 4.

시약
비오틴-HA 1000 NG
파-HB 1000 NG
RNA 1000 NG
소둔 버퍼 80 mL의

참고 : 어닐링의 일반적인 열 사이클은 : 4 ° C까지 올렸 다음 95 ° C 십분, 62 ° C 1 시간 52 ° C 1 시간.

핸들 표 5 어닐링 RNA.

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Discussion

협 지부 샘플의 준비에서 수정 및 문제 해결

클로닝 벡터의 선택. 여기에 설명 된 일반적인 구조 (도 3) 특수 클로닝 벡터를 필요로하지 않지만, 벡터는 프로모터가 원하는 위치에서 PCR을 통해 도입 될 수 있도록 전사의 용이성을 위해 고유 T7 또는 T3 프로모터를 갖지 않는 것이 바람직하다.

순서 및 핸들의 길이. 핸들에 대한 구체적인 순서 요구 사항은 없습니다. 그러나, AT 비율 가까운 GC는 호모 폴리머 및 높은 반복 서열은 피해야하는 반면, 바람직하다. 저서에서,이 핸들은 관심 RNA 구조가 중간에 대략 위치되도록 유사한 길이를 유지한다. 이전 작업은 미묘 측정 동력학 (46, 47)에 영향을 핸들의 전체 길이가 500 내지 10,000 염기쌍까지 변화 것을 보여준다.

풀림 혼합물의 ve_content "> 품질 검사 및 정량. 핸들 의도 된 RNA 외에, 최종 제품 또한 어닐링되지 DNA 핸들 및 RNA를뿐만 아니라, 다른 사람이 포함되어 있습니다. 그것은 협 지부 분자를 정화 어렵고 비 경제적이다. 대신, 어닐링 만 적절히 어닐링 핵산이 표면 피복 비드 닿는 될 수 있기 때문에, 혼합물을 직접, 협 지부에 사용될 수있다. 적절히 어닐링 상품은 핸들 및 아가 로스 겔 전기 영동에 RNA 구별하기 어렵다. 가장 좋은 방법을 테스트하기 위해 품질 및 어닐링 된 생성물의 농도를 정량화는 핀셋에서 테스트하는 것이다. 그러나, 검사 및 다양한 분자 생물학 기술을 이용하여 각 단계에서 전사 및 PCR 제품을 정량화하는 것이 도움이된다.

비즈에 밧줄 RNA 대안 적 방법을 제공. 공유 적 또는 비공 유적으로 표면 (48) RNA 분자를 연결하는 여러 가지 방법을 생각할 수있다

단일 대 다중 분자 연결 고리. strep- 및 발굴 - 구슬 한 쌍의 여러 분자에 의해 연결될 수 있습니다. 비드 테 더링 여러 분자의 이러한 가능성을 애타게, 힘 - 거리 곡선은 밀접하게 조사 할 필요가있다. 단일 분자 밧줄 다중 분자 사슬에서 일반적으로 보이지 않는 벌레 같은 체인 탄성 사를 표시합니다. 각 시스템에 대한 특정 추가 제어 실험은 단일 분자 밧줄을 확인하기위한 요구 될 수있다.

Minitweezers의 개선

빠르고 느린 데이터 기록. Minitweezers에는 내장이 작품의 운영 시스템으로 지칭 될 것이다 컴퓨터에서 200 Hz의 속도로 21 쓸모 파라미터를 기록하는 데이터 획득. 그러나 일부 입학 원서기능 및 교정은 빠른 데이터 수집 속도를 필요로합니다. 이를 위해 힘과 거리의 전기 신호는 컴퓨터에서 운영 데이터 수집 이외에, 새로운 컴퓨터, "고속 기록"컴퓨터에 기록되는 분할된다. 고속 기록 컴퓨터는 1 메가 헤르츠까지에 여러 개의 채널을 분리 할 수​​있는 데이터 수집 카드와 소프트웨어를 통해 데이터를 판독한다. 새 컴퓨터와 데이터 수집은 전적으로 운영 컴퓨터에 의해 제어되는 기기의 작동을 방해하지 않습니다. 실험에서 데이터는 동시에 서로 다른 속도에서 모두 컴퓨터에 기록됩니다. 시간 동기화는 대응하는 데이터 파일의 데이터를 비교하여 분석 동안 수행된다.

영상 이미지 촬영. 비디오 카드 및 이미징 소프트웨어는 반응의 실시간 이미지를 캡처하고 비디오 이미지를 분석하는 고속 기록이 컴퓨터에 설치된다. 이러한 발전은 t를 구현하는 것을 가능하게그 픽셀 크기 및 거리 보정 상술.

제한 사항 및 방법의 미래 응용

정확하게 하나의 RNA 분자의 구조 변화를 조작하고 측정하는 방법이 논의되고있다. 이러한 능력은 가능한 실시간 RNA 가닥의 구조적 재 배열을 모니터링 할 수 있도록. 또한, 힘은 희귀 및 / 또는 최적 이하의 구조가 절첩 될 수 있도록 RNA의 구조 및 폴딩 경로에 영향을 미치는 데 사용될 수있다.

그러나, 기계적 접근 방법의 한계가있다. 가장 중요한 것은, 구조 변화를 해석하는 데 사용되는 확장은, 3 차원 구조의 일차원 투영이다. 그것은 어떤 구조 변화가 49-52을 측정 할 수없는 경우, 및 / 또는 운동 장벽 (53)로부터 관찰 숨겨져있는 것이 가능하다. 다양한 악기 효과 및 제한 사항도 있습니다 그 수도ffect 관찰 열역학과 속도론 44,46,47.

게놈 전체의 조사 (54)에 의해 제안 된 다수의 성적과 비교하여 광 핀셋은 RNA 구조의 제한된 수의 연구에 적용되어왔다. 기술은 다른 구조적 모티브 큰 RNA를 연구하기 위해 사용된다. 또한,이 방법은 RNA 연구의 새로운 애플리케이션을 발견 할 것이다. 예를 들면, 리간드는 RNA-결합 단백질이 안정 또는 기계적 방법을 사용하여 측정 될 수있는 RNA의 구조를 변경할 수있다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minitweezers Steven B. Smith Engineering http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card National Instruments USB-6351
Video card National Instruments PCI-1407
Labview programming software National Instruments
NI Vision Builder National Instruments
Laser engraver Epilogue laser systems Zing-16
PCR purification kit Qiagen 28104
MEGAscript T7 kit Life Technologies AM1334
MEGAclear kit Life Technologies AM1908
Biotin-11-UTP Thermo Fisher FERR0081
T4 DNA polymerase New England Labs M0203
Streptavidin coated microsphere Spherotech SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere Spherotech DIGP-20-2
Size standard microspheres Spherotech PPS-6K
Kapton tape Kaptontape.com KPPTDE-1
No. 2 cover glass Thermo Fisher 12-543D

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References

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