单个RNA分子的光镊纳米操作

Bioengineering

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Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (90), e51542, doi:10.3791/51542 (2014).

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Abstract

人类基因组中有很大一部分被转录,但没有翻译。在这篇文章中基因组时代,RNA的调节功能已被证明是越来越重要。作为RNA的功能,通常取决于其采用替代的结构的能力,它是很难直接从序列预测RNA的三维结构。单分子方法展示潜能监测分子结构一个分子在同一时间,解决了RNA的结构多态性的问题。这项工作提出了一种方法,能够精​​确地操控利用光学镊子单个RNA分子的折叠和结构。首先,方法以合成适于单分子机械功分子中描述。接着,各个校准程序,以确保所述光学镊子的正确操作进行了讨论。接着,不同的实验进行说明。为了证明该技术的实用性,机械地展开发夹RNA的结果和一个RNA的亲吻克复合体作为证据使用。在这些例子中,纳米操作技术被用来研究每个结构域,其中包括二级和三级折叠,独立。最后,在限制和方法的未来的应用进行了讨论。

Introduction

光学镊子技术的发展早已伴随其在生物研究中的应用。当第一次被发现的光学捕获效应,亚瑟Ashkin观察到细菌污染的水可以在激光焦点1被困住。此后,细菌诱捕已经成为一个意外的,有趣的实验几代生物物理的学生,以及一个严肃的研究工具,研究微生物生理学2,3。光诱捕技术使用聚焦激光束来固定微观对象1。实际上,激光陷阱功能的光学弹簧,其中还通过从陷阱(ΔX)的中心,它的位移测量捕获对象上的力(F)。在很短的范围内,F =κ点¯xΔX,κ是陷阱的弹簧常数。在光阱可以用来施加在picoNewton(PN)精密力为百万分之一COPIC物体并测量其与纳米精度的位置。在过去的二十年中,光学镊子已经成为生物物理学中最常用的单分子技术中的一种。该技术已用于研究的折叠和DNA 4-6,7-9的RNA和蛋白质10,11力学。光学镊子也已用于观察DNA复制12,RNA转录13,和蛋白合成14,15,以及许多其它生物分子事件16-18。

单分子的方法是采用RNA的结构研究主要探讨RNA的折叠崎岖的能源格局。的RNA序列通常可以折叠成多个稳定,互斥的结构中,由于RNA的简单的化学组合物和碱配对规则。人们早已知道,RNA结构的多态性,如发生在核糖开关19,20,起着基因调控中起重要作用。 àrecen吨全基因组的调查显示,温度变化小到几度极大地影响结构和蛋白质合成的细胞转录组21一 ​​大截。这个例子暗示的替代RNA折叠的生物学作用可能更为重要和普遍比以前承担。结构多态性,但是,带来了传统的生物化学和生物物理的方法,其中许多研究分子的平均性能是一个挑战。例如,在“开”和核开关的“关”的构象是相互排斥的。从异质结构衍生的平均结构不太可能像任生物学相关的构象异构体。此外,非编码RNA和mRNA的一般形式结构。它们与蛋白质和调控RNA的相互作用通常需要现有结构的展开作为交互的一部分。因此,研究RNA的折叠/折叠成为相关问题的RNA生物学。为了迎接这样的挑战,在单分子的方法已被用来通过研究一个分子在同一时间22-27解开RNA的结构多态性。

较流行的单分子荧光法,基于机械展开镊子提供了单个分子的构象,可以通过施加力来操纵并与纳米精度测量的优点。这种纳米操作能力可被利用来监视单个结构域,使得大量的RNA的分层折叠可解剖28的解折叠/折叠。备选地,单链,可向折叠成若干构象之一;或现有结构可以机械地诱导重新折叠成不同的构象29。根据生物的条件下,一种RNA结构可以根据温度变化或配体结合结构被改变。直接操纵分子S中的能力tructure打开一个新场地的RNA结构的研究。原则上,其它机械技术,例如原子力显微镜和磁镊子,也可以用于研究单个RNA分子的折叠。但是,这样的应用在很大程度上限于由于相对低的空间分辨率30。

光镊的就业使RNA结构受机械力来展开。

机械折叠的优点是数倍。力可以用来展现两个二级和三级结构,而金属离子和配体诱导的折叠主要限于三级结构。温度和变性剂可以显著影响水和溶质的活动。与此相反,力局部地施加于扰动的分子结构;的力对周围环境的影响是可以忽略不计。此外,热熔最好用于研究小分子RNA折叠结构热力学,而光学镊子已用于研究RNA结构,各种大小不等的7个碱基对tetraloop发卡28至400个核苷酸的核酶31。此外,RNA结构可以机械地展开在嗜温温度。与此相反,以展开的RNA中的热熔融实验中,温度通常升高远高于生理温度,这显著增加RNA的水解,特别是在Mg 2 +的离子的存在。

要注意的力的机械作用取决于它是如何施加到结构是很重要的。作用力倾斜折叠能源格局。例如,当力被施加到一个发夹,基地对被顺序地破碎,每次一个( 图1a)。翻录叉前进沿着螺旋轴,其垂直于所施加的力。相反,当一个最小接吻络合物是在张力下,两亲碱基对,它们平行于所施加的力,共享的力负载( 图1b)。不同几何形状的发夹,亲吻复杂相对于所施加的力导致在其不同的力学响应,这可以被用来区分二级和三级折叠28,32的。机械展开的理论方面先前已审查8,9,30。这项工作概括了基本的方法建立并执行单分子机械展开分析。

实验装置 。在我们的机械拉力实验中,对于如何运用眼线改变RNA样品由目的RNA由两个双链DNA / RNA的把手侧接( 图2)7。整个分子可被拴经由链霉亲和素 - 生物素和地高辛抗地高辛抗体相互作用,两个分别的表面被覆的微米尺寸的小珠(Spherotech)。一个珠子是由测力光TR举行AP,而另一种是举行微量的一角。小珠之间的相对距离可以通过操纵陷阱或移动的微量改变。使用这种方法,单个RNA分子圈养珠可以拉伸和放松。

样品的制备 。 RNA样品的合成对于如何运用眼线改变包括几个步骤( 图3)。首先,对应于感兴趣的RNA的DNA序列,首先克隆到质粒载体中。接下来,三PCR反应进行,生成两个手柄和转录的模板。转录模板包括手柄区域和插入序列。全长RNA通过体外转录合成。最后,该RNA和化学修饰的手柄一起退火,以产生所述分子为如何运用眼线改变。

校准和镊子的操作 。在Minitweezers使用的基本设计d在此工作如下的双光束光镊33。有许多改进,Minitweezers相比第一代光学镊子显示非常稳定。一些研究小组在几个国家使用Minitweezers在他们的单分子研究14,15,34-37。建筑设备,包括教学影片,校准和操作的细节,都可以在“镊子实验室”网站(http://tweezerslab.unipr.it)。这里,需要在每日基础进行改进和校准程序进行详细说明。

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Protocol

1,制备RNA分子的单分子如何运用眼线改变

  1. 克隆的目的序列。克隆对应于RNA的结构到载体的DNA序列。
  2. 合成与转录模板的净化。合成通过PCR转录模板。 [地方表1这里]接下来,净化用PCR纯化试剂盒PCR产物,集中了样品> 200毫微克/微升。因为纯化的DNA用于转录,无RNA酶的水应在洗脱和浓缩步骤中使用。
  3. 体外转录。合成通过体外转录的RNA在37℃下过夜,以最大限度地提高RNA的产率。 [地方表2这里]转录后,加入1μl的DNase I在37℃下消化DNA模板15分钟。净化用硅胶离心柱的RNA。
  4. 生物素化的手柄A的合成首先,通过PCR用引物Af和氩气和浓产生的未经修改的手柄上entrate扩增的DNA至> 200毫微克/微升。接着,结合生物素修饰成的PCR产物使用引物延伸反应。 [地方表3这里]注:生物素化的把手A(生物素-HA),可直接使用在退火无需纯化。作为生物素-HA是用RNA进行退火,这是至关重要的,以使用无RNA酶的水在这两个步骤。
  5. 地高辛-改性手柄B.合成的合成地高辛,通过PCR使用引物Bf与洋地黄毒苷修饰寡挖一Br( 图3)改性手柄B(挖-11B)。接着,纯化的PCR产物和浓缩样品至> 200毫微克/微升。
  6. 退火的RNA的手柄。退火带手柄的RNA。 [地方表4和表5这里]
  7. 净化退火样品。添加3卷退火样品乙醇拌匀。在-70℃下保存该混合物至少1小时。降速在15,800 XG弃上清。干用冻干机沉淀。溶解在沉淀100μl的无RNA酶的水。注:样品准备好被使用,并且可以储存在-20℃。

2,标定光镊和操作

  1. 校准视频监控的像素大小
    1. 使用光学陷阱陷阱与已知的直径(标准尺寸),小珠。
    2. 使用图像处理软件捕获的珠拍摄图像( 图4)。
    3. 确定使用基于质心方法的图像处理软件对珠子的直径。
    4. 重复此步骤,以确定直径大小不同的珠子。
    5. 通过线性回归拟合珠的测定的和已知的直径,以获得像素的物理尺寸。
  2. 验证远程校准
    1. 使用光学陷阱陷阱珠。
    2. 确定其重心由图像捕获软件的像素位置,并使用Minitweezers记录其位置。
    3. 操纵珠迪菲租房位置和重复位置的确定。
    4. 使用校准的像素尺寸转换像素的珠粒的X和Y位置,以米单位。
    5. 比较由视频和由Minitweezers测量位置之间的X和Y。这两组数值应该同意。作为图像的分辨率是> 0.1微米,将珠用1微米的测量之间,以确保准确性。如果距离校准无法媲美的一个存储在Minitweezers,重新校准仪器。
  3. 陷阱刚度标定
    1. 利用光阱捕获珠,并保持不动。
    2. 记录的陷阱使用旁路快速数据采集力的速度> 5千赫,持续3秒。
    3. 产生使用软件珠运动的记录功率谱。适合功率谱洛伦兹( 5)38:
      542 / 51542eq1.jpg“宽度=”200“/>(公式1)
      其中S(f)为在f的频率的电力,f c是角频率,而S 0是渐近功率。转角频率,F C,是频率在那里热运动的力量已经下降到一半的渐近值。由于F C与激光功率和珠子大小各不相同,单独校准每个被困珠。
    4. 计算陷阱的弹簧常数,κ,从F C:
      式(2) (式2)
      其中γ是在胎圈(式3)的阻力系数。使用弹簧常数来确定力变化的RNA的延伸变化。
  4. 斯托克斯定律测试
    1. 拍摄使用的光学陷阱珠。将珠子来回控制,力在不同的速度。
    2. 记录下珠的运动,并使用Minitweezers力。
    3. 计算胎圈的半径。
      注:该摩擦力,F D,由球形粒子中的流体的运动而产生可描述由斯托克斯定律:
      式(3) (式3)
      其中r是该球的半径,V是速度,h是液体,它可以在参考表中找到的动态粘度。使用测得的力为F d胎圈的半径可以用公式进行计算。 3( 图6)和应与该图像获取软件来确定。斯托克斯定律测试有效地测试整个校准和仪器的性能。

3,纳米操纵单个RNA分子

  1. 使流体。
    1. 钻6孔(直径为2毫米的每个)在第2玻璃盖( 图7a)和切三个狭缝(2毫米的宽度)成双面聚酰亚胺胶带( 图7b)用激光雕刻。
    2. 夹在2防护玻璃双面卡普顿胶带两层作流室。将胶带( 图7c)之间的微管和两个旁路管。
    3. 通过匹配射流孔( 图7d)安装流动室上的金属框架。
    4. 连接的腔室的流体通道至10ml注射器填充有通过聚乙烯管( 图7E)的选择的缓冲液中。
    5. 加载整个腔到两个目标之间的光学镊子。确保与流体通道的腔室的前侧朝向右侧。收回权的目标和插架( 图7E)的铜针脚在T安装孔他镊子。拧紧螺丝固定腔的位置。
  2. 混合退火样品和珠子。混合用抗地高辛包被的珠子(挖珠)退火的样品,并让该混合物留在室温下搅拌5-10分钟。通常情况下,1微​​升退火的样品,用5微升挖珠在1ml缓冲液中混合。请注意:在小珠的量加载到流动室的选择应确保的珠的合理数量,由旁通管递送。退火的样品与珠子的比例不能容易地进行定量。在理想的情况下,大部分颗粒具有无RNA,使得珠子只有一小部分可以仅具有一个每珠RNA分子。作为退火的样品与珠子悬浮液难以量化,最好和唯一的方式目前是改变混合比和测试对镊子的混合物。
  3. 交付珠的反应点流室( 几微米的MI的顶部cropipette尖, 图7c)。
    1. 负载链亲和素包被的磁珠(链球菌珠)的悬浮成1 ml注射器。
    2. 将注射器连接到所述流体管道通向流动室( 图7a)的底部的通道。
    3. 推动注射器流动的链球菌珠进入腔室。
    4. 移动用马达控制软件以放置底部旁通管( 图7b)的开口部附近的光阱的整个腔室。然后,通过轨迹球操作光学陷阱捕捉链球菌珠。
    5. 将珠接近使用电动机控制软件的微尖。
    6. 拉连接到微量的珠吸入微量注射器。
    7. 按注射器中间渠道,以冲洗掉多余的链球菌珠轻轻地涂抹流。
    8. 类似地,提供样品和挖珠(参见步骤3.2),以在腔室的顶部通道的混合物。
    9. 捕捉挖珠,并把它靠近使用光学陷阱链球菌珠。
    10. 清洁中间渠道通过应用流量。注:strep-和辛珠被选择为具有不同的尺寸,以便它们能够在视觉上的微观角度下加以区分( 图4)。
  4. 钓鱼“单分子对珠之间的圈养。
    1. 将挖珠垂直于链球菌珠( 图4)的顶部。
    2. 通过操纵陷阱将挖珠下来,对链球菌珠。在电脑上打开一个力 - 距离积窗口来可视化的力量变化。
    3. 当两个珠子接触,将挖珠垂直距离链球菌珠。
    4. 如果没有特定的接触时,该力保持几乎为零。如果两个珠粒通过分子连接时,力增大显著当两个珠分离。此过程中,通常被称为“钓鱼”,往往表现在每对珠ormed多次找到一个有效的单分子系绳。

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Representative Results

受空间限制,单个RNA分子的纳米操纵的证明显示的RNA发夹只是机械展开的例子,并与三级结构的RNA。

操纵单分子发夹

一旦系绳珠粒之间建立,扩展和力上的系绳可以使用用户定义的协议进行操作。四种常见的操作协议是常用的。

强制斜坡实验 。最直观和通用实验操纵的单个RNA是反复拉伸和放松在手柄的螺旋轴的方向上的分子(垂直方向所示的图4)。的力,F和捕集位置,Y,被记录为时间的函数。 F /κ,其中是台铁的弹簧常数-分子,E的扩展,可通过e = Y来计算页。提拉结果可以显示为力-延伸曲线( 图8a)。拉伸双链手柄,其由上升的曲线具有正斜率。手柄的松弛曲线追溯的拉伸。一个简单的,两个国家的折叠发夹结构转变显示“RIP”负斜率,说明单一,合作开展过渡39。发夹的折叠由力 - 延伸曲线上的“压缩”表示。重要的是,在同一分子可以被展开并在每次重折叠在不同的力。这种趋势在过渡部队( 图8b)的分布明显。通常,该力被改变为时间的线性函数, ,在一个固定的装载/卸载速率。在一个恒定的装载/卸载速度,力量取决于动力学可提取的过渡势力40-42分布。

恒力实验 。在恒力模式下,仪器采用了反馈机制,从设定值补偿力偏差。的RNA分子的扩展记录为时间( 图9)的功能设定力处或附近的特定RNA分子跃迁的跃迁力允许分子伸展状态的观察和定量。分子在每个国家的寿命可以汇集在一起,计算结构转型7的动力学。恒定力试验是用来监视可逆折叠,如那些发夹7,28的。

强制跳转实验 。在跳跃力试验,力正在迅速变成一个不同的值,并保持恒定;第一过渡的寿命监测43。力跳跃是特别有用的表征动力学不可逆的过程,因为在前进的寿命和反向反应可直接分别在不同的力进行测量。在每一个跳跃力/降,只有一个终生观察。因此,需要多轮此类实验的进行,以收集足够的观测值来提取动力学进行。

被动实验 。在被动模式下,告警和微量的位置都被固定( 图10)。发夹表现出相应的近过渡部队展开和折叠的RNA两种状态。不同的是恒力实验,无论是力量,扩展后的结构性转变的分子变化。消除反馈控制允许的分子转变为直接对外无干扰监控。然而,这是难以维持恒定的力的作用下被动模式下显示。由于在光阱被困珠弥漫,力发生相应变化。日E被动模式不适合用于测量分子态与较长的停留时间,在此期间,力显著改变。恒力和被动模式的利弊已经被广泛地研究和讨论44。

的二级和三级结构折叠绎

机械展开由两个相连的GACG tetraloop发夹形成了两个碱基对接吻的RNA作为这里的例子( 图11A)。两个发夹的9个碱基对茎,虽然干的序列是不同的。将RNA( 图11A)的机械展开路径的特点是力量斜坡方法34。当力被提高,亲吻络合物第一破碎,然后依次折叠的发夹。在复性,发夹折叠第一,其次是在低动力的亲吻互动。这些转变的力-延伸曲线图上可见( 11B)。确认发夹跃迁的分配,每个发夹管可以独立地研究。该unkissing /接吻跃迁的分配可以通过研究突变的RNA,其中,所述tetraloops被突变,以防止形成吻相互作用28的验证。备选地,最低的力可以设定在10 PN,比接吻力更高。正如预期的那样,在这种条件下的力-伸展率曲线显示了发夹管( 11C)34的唯一的解折叠/重折叠。因此,能够以调查折叠两个发夹的吻相互作用并各以不同的力独立。

值得注意的是,这两个发夹的折叠是可逆的,而亲相互作用是高度可逆的,因为显然通过非常不同unkissing和吻力,并通过大的滞后。因此,发夹管的折叠动力学可以研究directl只有使用Y恒力实验。接吻相互作用的动力学,但是,必须使用强制跳转方法测定。在图12a所示为典型的跳跃力试验28。在3 PN,整个RNA的折叠。上的力,然后迅速升温至22 PN和保持恒定。几秒钟后,整个RNA通过扩展〜30纳米的突然增加扩展成单链,为明显。上的力,然后升温至30 PN进一步伸展的RNA,然后将其降低到13 PN。折叠的发夹后,该力迅速下降到8 PN。接吻复合物的形成是通过缩短延伸通过〜7-8毫微米的指示。通过收集许多这样的寿命测量的,unkissing和亲吻动力学恒定的力可以被计算出来。

在所有实验条件下,亲吻复杂总是展开第一。在部队的发夹不稳定本身,接吻互动离子保护发夹结构的展开。这样的限速效果还透露强行跳转实验。如图所示,在图12b中 28中,当力被跃升至16 PN,该分子的扩展在很大程度上仍然不变几秒钟,接着是解折叠增加的延伸由〜20纳米。在扩展的变化表明较弱的七碱基对发夹是展现权后破坏接吻复杂。发夹的亚稳态是显而易见的寿命。一旦接吻被打破,发夹快速折叠和展开状态之间的过境;的寿命是小于1秒。从本质上讲,这种观察是一种定力实验展开的发夹。与此相反,它需要在10秒内打破接吻复杂随着发夹。类似地,力被上升到17.7 PN( 图12c),在其全部的RNA被扩展成单链,如明显的中打折的〜30 nm的扩展。大,11个碱基对的发夹结构的双稳性可以看作是两个值之间的分机啤酒花。同样,发夹的寿命短形成鲜明对比其长寿命的亚稳态。使用武力的斜坡和跳跃力实验,热力学和个人的动力学展开/折叠步骤的组合可以测量28。接吻复杂的断裂和形成的直接观测,使我们能够分析侧翼基地,以最小的接吻复杂的34作出积极贡献,并测量了盐的互动接吻45依赖性。

图1
图1 RNA的结构相对于所施加的力。 a)根据张力的发夹。 二)拉两基线对接吻复杂。两个发夹环被着色为红色和黄色。

图2
图2实验装置的 RNA结构是由两个DNA / RNA的手柄两侧。通过在手柄的端部的化学修饰时,整个分子可连接到一对蛋白涂覆的微米尺寸的珠子。其中一个珠子是由可控,测力光阱举行。另一种是放置在微管,它是由压电正截面阶段驱动。该图不是按比例绘制。

图3
图3。总体方案合成RNA分子带手柄的手柄上,手柄B,和T通过PCR从用克隆的RNA序列的质粒所产生ranscription模板。手柄A由digoxigenins(DIG)在3'末端修饰。手柄B具有生物素修饰的一条链的5'末端。的全长RNA被从转录模板转录。 RNA和修饰的手柄混合和退火。的正确分子可以是栓系到一对胎圈包被链霉亲和抗地高辛抗体。该图不是按比例绘制。

图4
图钓由视频捕获的两个胎圈之间的单分子的4图像卡,其中一个胎圈放置在微管抽吸的前端。另一种是持有,由测力光阱转向。的陷阱运动的方向用箭头表示。被困珠第一运动垂直走向上的微珠。一旦接触,被困珠向上移动。如果系绳珠粒之间建立的珠分离拉动的分子和力随着分子被延长。如果两个胎圈不受任何分子相连,在回缩运动不产生力。

图5
图5捕获的珠的布朗运动的功率谱。实线是适合于洛伦兹方程(方程1),在插入物所示。的凝汽阀的弹簧常数可从拐角频率(公式2)来计算。

图6
图6中的斯托克斯定律试验的一个例子。

图7
图7,甲流室如何运用眼线改变。一)六个孔 ​​,每个直径为2毫米,钻成2号玻璃盖用激光雕刻。 二)三及2mm宽的狭缝切割成双面聚酰亚胺胶带。 三)仔细看在含微量和两个旁路管的试验区。从顶部和底部的通道的珠粒通过各自的旁路管(蓝色和绿色)的CEN遍历按箭头指示的方向二尖瓣通道。 四)通过匹配射流孔装入流体室在金属框架上。 五)三通道室连接到流管。中央通道,用于拉动的RNA。顶端(蓝色)和底部(绿色)信道被用于传送珠。实验区是由一个红色方块表示。

图8
图8组匝道。 a)在力延伸机械展开发夹的曲线。拉动以蓝色显示和放松的红色。发夹的展开/折叠用箭头表示。 二)展开(蓝色)和折叠的发夹(红色)的力量分布。下图是改编自稿子39。


图9。下恒力一种RNA发夹。 A)图的实验。陷阱的位置,通过反馈改变,以保持对发夹,B A恒力部队和位置与时间的发夹UN /折叠。由于力保持恒定,陷阱的位置在两个值之间波动,显示出在力量发夹双稳态。陷阱分布的二项分布产生于发夹展开19.4±0.2纳米的延伸变化。下图是改编自稿子39。

图10
图发夹的10被动模式。一) 二)部队和扩展与在被动模式发夹的时间。

图11
图11力斜面的两碱基对接吻的RNA。在机械张力。B A双碱基对接吻RNA 的)分层折叠力扩展曲线。结构转换由箭头C)时的最低压力定为10 PN防止接吻相互作用力-伸展率曲线表示。该网络gure适于与从杂志美国化学学会34权限。

图12
两个碱基对接吻的RNA图12强制跳跃。 a)在力跳/下降周期来衡量unkissing和亲吻寿命在两个不同的势力。前面板显示武力的时间轨迹。底部面板显示了该分子的相对延伸。该部队首先从3 PN跃升至22 PN测量接吻复杂的生命周期在22 PN。该unkissing由在分机由〜30nm的快速上升显示,表示被展开成单链的全部RNA。在放松,力斜坡下降至14 PN让这两个发夹重新折叠。该部队随后回落至8 PN。接吻的相互作用形成了下降延〜7-8处表示, 二)由于力跃升至16 PN,时间延长跟踪显示,它需要几秒钟的亲吻复杂和七个碱基对发夹展开,在此之后,发夹展开和再折叠迅速。 三)整个接吻是复杂展开成单链的力量后,几秒钟的时间跃升至17.7 PN。剩下的跟踪显示11个碱基对发夹的双稳态。在每一个展开的接吻RNA的结构转变具有鲜明的X的数字是改编自科学28国家科学院院刊许可。

试剂 微升
的质粒(10毫微克/毫升) 10
底漆T7F(100毫米) 10
底漆溴(100毫米) 10
dNTP混合物(各25毫摩尔) 10
10倍PCR缓冲液 100
H 2 O 850
Taq DNA聚合酶 10

注意:用于合成3千碱基的DNA的典型热循环为:95℃45秒53℃1分钟,72℃3分钟。

表1 PCR方法合成的转录模板的一个例子。

试剂 微升
模板(> 200毫微克/毫升) 8
国家结核病防治规划图8(各2毫升)中
10X反应缓冲液 2
T7 RNA聚合酶 2
20

注意:孵育反应物在37℃下overniGHT。

表2在体外转录。

试剂 微升
处理(〜10毫克) 50
生物素11UTP 5
T4聚合酶反应缓冲液 5
BSA溶液 1
T4 DNA聚合酶 5
66

注意:在室温下孵育反应20分钟。灭活通过加热酶在70℃下保持20分钟,随后缓慢冷却至室温。

表3引物延伸反应。

试剂 微升
甲酰胺 800
EDTA(0.5M,pH8.0)中 2
管(1M,pH值6.3) 40
氯化钠(5M) 80
922

表4配方退火缓冲。

试剂
生物素HA 千NG
DIG-HB 千NG
RNA 千NG
退火缓冲液 80毫升

注:在退火典型的热循环为:95℃10分钟,62℃1小时后,52℃1小时,然后通过抬高到4℃。

表5退火的RNA与手柄。

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Discussion

修改和故障排除中如何运用眼线改变样品的制备

选择克隆载体 。尽管此处描述的一般方案( 图3),不需要特殊的克隆载体,该载体优选的是不具有固有的T7或T3启动子进行转录的便利性,使得启动子可通过PCR在所需的位置被引入。

序列和手柄的长度 。有没有具体的时序要求的手柄。然而,接近GC与AT比例是首选,而应避免的均聚和高度重复序列。在出版的著作中,两个把手被保持为类似的长度,使得感兴趣的RNA结构被粗略地放置在中间。先前的工作表明,该手柄的总长度为500〜10,000碱基对变化微妙影响所测量的动力学46,47。

ve_content 的退火混合物的 “> 质量检查和定量 。除此之外,期望的RNA用手柄,在最终产品中还含有未退火的DNA手柄和的RNA,以及其他人,这是困难和不经济的净化如何运用眼线改变分子。相反,退火混合物可直接用于如何运用眼线改变,因为只有适当退火的核酸可以被拴两个表面被覆的珠。适当退火的产物,也难以从把手和在琼脂糖凝胶上电泳RNA区分开来。最好的方式来测试质量和量化的退火产物的浓度来对镊子进行测试,但它是有用的检查和定量PCR和转录产物中使用的各种分子生物学技术的每个步骤。

替代方法系绳的RNA来珠 。有许多可以想到的方法的RNA分子链接的表面共价或非共价48

单对多分子系绳 。一对strep-和DIG-珠可以由多个分子联系起来。梳理出多个分子圈养珠这样的可能性,力 - 距离曲线,需要进行仔细检查。单分子系绳显示蠕虫状链弹性4是一般看不见的多分子系绳。针对每个系统的附加的对照实验,可能需要用于确认单分子系绳。

在Minitweezers改进

快速和慢速数据记录 。该Minitweezers有一个内置的数据采集,记录多达21个参数的仪器在200赫兹的电脑的速度,这将被称为作为操作电脑了这项工作。然而,一些APPLICATI附件和校准需要快速的数据采集速率。为此,力和距离的电子信号被分割以被记录在一个新的计算机中,“快速记录”计算机,除了在操作计算机的数据采集。在快速记录计算机通过一个单独的数据采集卡和软件,它允许多个频道以高达1 MHz的读取数据。新的计算机和数据采集不干扰仪器,它完全是由操作计算机控制的操作。在一项实验中,数据被同时记录在两台计算机以不同的速率上。通过比较相应的数据文件中的数据的分析,进行时间同步。

视频图像记录 。显卡和图像处理软件都安装在快速记录电脑上捕捉到的反应实时图像,并分析视频图像。这种发展使得它可以实现吨他像素大小和距离的校准,如上所述。

限制和方法的应用前景

方法精确操控和测量单个RNA分子的构象变化进行了讨论。这种能力使得能够实时监测RNA链的结构重排。此外,力可被用来影响RNA结构和折叠途径,允许稀有和/或小于最佳结构来进行折叠。

但是,也有机械的方法的局限性。最重要的是,扩展名,它是用来解释的构象变化,是在三维结构中的一维投影。这是可能的一些构象变化,不能测定49-52,和/或运动障碍是隐藏的,从观察53。还有各种仪器的影响和限制了可以在ffect所观察到的热力学和动力学44,46,47。

光学镊子已用于研究RNA结构的有限数量的,相比之下,通过全基因组调查54表明大量的转录。该技术将被用于研究不同的结构基序和大的RNA。此外,该方法会发现在RNA的研究新的应用程序。例如,RNA结合的配体和蛋白质可稳定或改变RNA的结构,其可以使用机械方法来测定。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minitweezers Steven B. Smith Engineering http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card National Instruments USB-6351
Video card National Instruments PCI-1407
Labview programming software National Instruments
NI Vision Builder National Instruments
Laser engraver Epilogue laser systems Zing-16
PCR purification kit Qiagen 28104
MEGAscript T7 kit Life Technologies AM1334
MEGAclear kit Life Technologies AM1908
Biotin-11-UTP Thermo Fisher FERR0081
T4 DNA polymerase New England Labs M0203
Streptavidin coated microsphere Spherotech SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere Spherotech DIGP-20-2
Size standard microspheres Spherotech PPS-6K
Kapton tape Kaptontape.com KPPTDE-1
No. 2 cover glass Thermo Fisher 12-543D

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