הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

משואות bimolecular ratiometric (RBMBs) יכולות לשמש לתעתיקים בודדים תמונה מהונדסת RNA בתאים חיים. כאן, אנו מתארים את ההכנה וטיהור של RBMBs, מסירה של RBMBs לתוך תאים על ידי microporation ודימות פלואורסצנטי של מולקולות RNA אחת בזמן אמת.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Song, Y., Zhang, X., Huang, L., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons. J. Vis. Exp. (90), e51544, doi:10.3791/51544 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ההבנה הגוברת ששתי הרגולציה של הזמן ומרחב של ביטוי גנים יכולה להיות השלכות חשובות על תפקוד תאים הובילה לפיתוחן של טכניקות מגוונות לדמיין תעתיקי רנ"א פרט בתאי חיים בודדים. טכניקה מבטיחה אחת לאחרונה כי תוארה מנצלת בדיקה מבוססת oligonucleotide אופטי, ratiometric משואת bimolecular (RBMB), כדי לזהות מולקולות RNA שהונדסו כדי להכיל לפחות ארבעה חוזרים טנדם של רצף יעד RBMB באזור 3'-מתורגם. RBMBs נועד במיוחד כדי לפלוט אות ניאון בוהקת על הכלאה לRNA המשלים, אבל חוץ מזה נשאר הרווה. השימוש בבדיקה סינתטית בגישה זו מאפשרת photostable, אדום העביר, וצבעים אורגניים emissive מאוד לשמש הדמיה. כריכה של RBMBs מרובה לתוצאות תעתיקי רנ"א המהונדסים במקומות דיסקרטיים הקרינה כאשר מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום. כתוצאה מכך, התנועה של מולקולות RNA בודדות יכולה להיות דמיין בקלות בזמן אמת על ידי לקיחת סדרת זמן של תמונות ניאון. כאן אנו מתארים את ההכנה וטיהור של RBMBs, משלוח לתאים על ידי microporation ולחיות תאי הדמיה של מולקולות RNA בודדות.

Introduction

הביטוי והרגולציה של מולקולות RNA הוא תהליך מורכב ודינמי שהוא אחראי במידה רבה לשליטה בהתנהגות תא וגורל. למרות חשיבותו של RNA בתפקוד תא מכתיב כבר ידועה לכמה זמן, הוא לעתים קרובות קשה לצייר קשרים ברורים בין השניים שכן רוב כלי ניתוח RNA חסרי הרזולוציה המרחב ובזמן הנדרשת כדי ללכוד אירועי רגולציה חשובים כגון התפוצצות שעתוק, RNA סחר, ועיבוד RNA מקומי. זה הוביל להופעתו של מספר טכניקות שתאפשרנה תעתיקי רנ"א בודדים להיות דמיינו בתאים חיים בזמן אמת 1. אולי, הבולט ביותר של טכניקות אלה מנצל חלבון היתוך GFP-MS2 למקד RNA שתוכנן כדי להכיל חוזר טנדם של האתר מחייב MS2 ב3'-UTR 2,3. על ידי הבאת מולקולות GFP מרובות לתוך סמיכות, תעתיקי רנ"א בודדים מופיעים כתמים בהירים כמו ניאוןבאמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מערכת GFP-MS2 סיפקה תובנה חסרת תקדים לתוך RNA התנהגות, כוללים הדמיה ישירה ומדידות של תעתיק מתפוצצת 4,5, זיהוי של לוקליזציה משנה הסלולר ייחודית ועיבוד 6-9, והדמיה של רנ"א תחבורה 10 בזמן אמת. עם זאת, למרות הפוטנציאל העצום של מערכת GFP-MS2, חלבוני היתוך GFP-MS2 מאוגדים יכולים ליצור אות ניאון גבוה רקע שמגבילה את הגמישות וטווח דינמי של טכניקה זו. מספר גישות פותחו כדי להגביל את אות רקע זה, לרבות מידור subcellular של GFP-MS2 מאוגד 10, שלמת בר חלבון 11, וחלבוני RNA מחייב חלופיים ומטרות 12. עם זאת, כל הגישות הללו יישארו רגישים לביטוי היחסי ומוחלט של יעד RNA וחלבון היתוך GFP-MS2.

כlternative למערכות GFP-MS2, משואות מולקולריות יש גם משמשות לאיתור תעתיקי רנ"א מהונדס עם חוזר טנדם של האתר הקישור משלים ב3'-UTR 13,14. משואות מולקולריות הן בדיקות oligonucleotide יוצרי סיכת ראש שמסומנות בקצה אחד עם מרווה ובקצה השני עם כתב ניאון. כאשר אינו מחויבים למקד RNA כתב הניאון ומרווה להישאר בסמיכות, וכתוצאה מכך מדינה נמוכה ניאון. על הכלאה, הכתב ומרווית הניאון נאלצים לגזרים והקרינה משוחזרת. בדומה למערכת GFP-MS2, את הכריכה של משואות מולקולריות מרובות על תוצאות תעתיקי הרנ"א יחידים במיקום ניאון בהיר שיכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי; עם זאת, הקרינה הרקע צפויה להיות נמוכים בהרבה, בשל התצורה הרווה של משואות מולקולריות מאוגדים. למרבה הצער, למרות מנגנון ההפעלה המתוחכם שהוא שולב מ 'עיצוב משואת olecular, עכשיו יש ראיות הולכות ומצטברות כי unhybridized משואות מולקולריות לא נשאר בקונפורמציה סיכת הראש בעת שהוכנס לתאים חיים. כתוצאה מכך, הם מייצרים אות חיובית שגויה שמפחיתה את האות לרקע באופן משמעותי. כדי להתגבר על חסרון זה, לאחרונה פיתח בדיקה סינתטית חדשה לRNA הדמיה בתאים חיים, משואות bimolecular ratiometric (RBMBs; איור 1 א) 15,16. RBMBs מורכב משני גדילי oligonucleotide 2'-O-מתיל היוצרים מבנה היברידי עם תכונות משני RNA הקצר סיכת הראש (shRNA) ומשואות מולקולריות. מנגנון הלולאה והפעלת הקרינה דומה למגדלור המולקולרי, ואילו תחום פעמיים התקועות הארוך עם הסככה 3'-UU הוא יותר אופייני לshRNA. תכונות shRNA נועדו להסיע את היצוא גרעיני, שבו אנו מוצאים עליות חיים תאיים ל> 24 שעות, עם השפלה נצפית מינימאלית, ומונע פתיחה הלא ספציפית של הלולאה. כתוצאת RBMBs תערוכת רקע אות לגבוה יותר באופן משמעותי ממשואות מולקולריות.

יש לציין כי RBMBs לא יכול להיות מוכן באמצעות oligonucleotides DNA, מאז בדיקות מבוססות DNA לא להחזיק את אותן יכולות יצוא גרעיניות כמו בדיקות מבוססות RNA. מבחינה מבנית, RBMB הלולאה נועדה בדרך כלל להיות בין 15 ו21 בסיסים ארוכים, כדי ליצור איזון בין הספציפיות וסלקטיביות על הכלאת RNA. הגבעול הקצר שיוצר מהתחומים שני עצמי משלים בדרך כלל נועד להיות 4 בסיסים. אם גזע כבר נבחר, השיעור של הכלאה בין לולאת RBMB וRNA היעד מואט באופן משמעותי 17,18. לעומת זאת, כאשר רצף גזע קצר יותר נבחר טמפרטורת ההתכה היא לעתים קרובות נמוכה מדי כדי לקיים את מבנה גזע הלולאה על 37 מעלות צלזיוס, מה שמוביל לאות רקע גבוהה. את הספציפיות של RBMB היא גם אדומותuced כאורך הגזע מתקצר. מאז הרצף של גזע הלולאה RBMB גם יכול להשפיע על תפקוד RBMB, זה חייב להיות שנבחר בקפידה 19. בפרט, צריכים להיות רצפי לולאה אידיאליים מבנה המשני מינימאלי, להכליא רצפי הרנ"א עם מבנה משני מינימאלי, להימנע מאתרי קישור של חלבון, ולהימנע מחוץ יעד מחייב. ניתן להשיג את תחזיות של שני RBMB ומבנה משני RNA באמצעות תוכנה כגון mfold 20. משלימים אתרים מחוץ היעד יכולים זוהו באמצעות כלי נוקלאוטיד יסוד מקומי חיפוש הקצאה (תפציץ). עם זאת, בשל חוסר עקביות בתחזיות מודל ואת הקושי בזיהוי אתרי מכבדי חלבון, את הספציפיות של כל RBMBs חייבות סופו של דבר להיות מאומתות בניסוי.

אם רצוי, צבע התייחסות unquenched שאינו רגיש למדינת ההכלאה ניתן להוסיף לRBMB 15. התוספת של צבע התייחסות יכולה יחסי הציבורovide סמן למסירת בדיקה ולשמש הדמיה ratiometric, אם מדידות מדויקות יותר של הקרינה סלולרית בסך הכל נדרשות. צבעי ההתייחסות מאפשר מדידות להיות מותאמות להבדלים ברקע בשל וריאציות תא אל התא במשלוח. עם זאת, כאשר ההדמיה RNA הבודד תמלילי צבע ההתייחסות הוא לא הכרחי. יש לציין, צבעים מסוימים התייחסות יכולים להפריע ליצוא של RBMBs מהגרעין, שהוביל לאות רקע מעט גבוהה יותר בגרעין.

כאשר מתוכנן כראוי, יכול לשמש RBMBs לתעתיקי רנ"א הבודד תמונה בתאי חיים בודדים, אם RNA היעד מתוכנן להכיל לפחות ארבעה אתרי RBMB מחייבים (איור 1 ב) 16. RBMBs יכול להיות מועבר בצורה יעילה למגוון רחב של סוגי תאים באמצעות microporation, עם לא מעט השפעה על תא כדאיות 21, ומדידות כמותיות של ביטוי גנים יכולות להיותרכש בתוך 30 דקות. יתר על כן, המתודולוגיה היא די רגישה לרמות ריכוז RBMB וRNA היעד, שכן הקרינה מRBMBs מאוגד הוא הרווה ביעילות. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של המתודולוגיה המשמשת להכנה ולטהר RBMBs, כמו גם נוהל כללי לאספקת RBMBs לחית תאים באמצעות microporation וההדמיה של מולקולות RNA אחת בזמן אמת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בפרוטוקול זה, oligonucleotide אחד (RBMB1) היה כותרת ב5'-end שלה עם צבע כתב CF640R ויש רצף: 5'- mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3 ". תחומים עצמי משלימה, אשר כונן את ההיווצרות של מבנה סיכת הראש, הם באותיות מודגשות. Oligonucleotide השני (RBMB2) היה כותרת ב3'-end עם מרווה איווה השחור RQ-Sp ויש רצף: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 ".

.1 הכנת RBMBs

  1. לבצע סיבוב מהיר של הצינורות המכילים oligonucleotides RBMB1 וRBMB2, על מנת להבטיח את oligonucleotide המיובש הוא בחלק התחתון של הצינור, והגלול בDNase ומים RNase חינם לריכוז סופי של 100 מיקרומטר. לדוגמא, מדגם nmole 10 של oligonucleotide יש resuspended במים 100 μl.
  2. Measיור הריכוז המדויק של דגימות RBMB1 ומניית RBMB2 ידי ספקטרוסקופיה UV מול.
    1. לערבב 3 μl של מדגם RBMB עם 117 DPBS μl (ללא סידן ומגנזיום) בצינור microcentrifuge.
    2. בלנק ספקטרופוטומטר עם DPBS ולמדוד את הספיגה 200-800 ננומטר. הערה: שיא absorbances ב 260 ננומטר ו650 ננומטר צריך להיות גלוי.
    3. חשב את ריכוז המניות של דגימות RBMB מבוססות על הספיגה ב 260 ננומטר (או 650 ננומטר לRBMB1), תוך שימוש במשוואה:
      ריכוז מניות (M) = 260 גורם לדילול * / מקדם הכחדה בי 260 היא את הספיגה ב 260 ננומטר והגורם לדילול היא 40.
      הערה: ניתן למצוא מקדם ההכחדה לRBMB בגיליון המפרט הניתן על ידי יצרן oligonucleotide. מקדם ההכחדה של CF640R ב650 ננומטר הוא 103,000.
  3. מערבבים 20 μl של 100 RBMB1 מיקרומטר, 30 μl של RBMB2 100 מיקרומטר, 6 μl 10x; חיץ פוספט (10x חיץ פוספט: 480 מ"מ K 2 4 HPO, 45 מ"מ KH 2 PO 4, 140 מ"מ לאא 2 PO 4, pH 7.2) ו4 DNase μl ומים RNase חינם. דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. הערה: זה בדרך כלל מספיק עבור כ 50 לימודים.
  4. הכן עמודה כרומטוגרפיה נוזלית באמצעות הכיתה Superdex 75 הכנה כדי להסיר כל oligonucleotides RBMB2 unhybridized. השתמש ב8 מ"ל (0.7 x 20 סנטימטר) עמודה כרומטוגרפיה נוזלית עם ~ 4 מ"ל מיטת נפח לטהר את הנפח הקטן של מעורבות בדיקות.
  5. לשטוף ולאזן Superdex עם ~ 50 מ"ל של חיץ פוספט 1x באמצעות משאבת מזרק פועלת בזרימה בקצב זרימה של 0.6 מ"ל / דקה. לפני כל הנוזל נכנס למיטת הנפח, לעצור את משאבת המזרק, לנתק אותו, ולתת את הנוזל שנותר לעבור את העמודה על ידי כוח הכבידה.
  6. טען את תערובת RBMB (60 μl) על טור כרומטוגרפיה.
    1. אחרי מדגם RBMB יש לחלוטיןנכנס למיטה, לאט להוסיף עוד 250 μl של חיץ פוספט 1x לחלק העליון של המיטה על מנת להבטיח שכל המדגם נכנס לטור לחלוטין.
    2. מלא את העמודה לשפה עם חיץ פוספט 1x. סגור את החלק העליון, ולהתחיל את משאבת מזרק - המזרק צריך להיות מלא עם ~ 50 מ"ל 1x PBS ולרוץ בקצב זרימה של 0.6 מ"ל / דקה.
    3. ברגע שRBMB מתקרב תחתית הטור - מדגם RBMB יכול בדרך כלל להיות דמיינו בקלות בשל הצבע של הצבע שולב בחללית - לאסוף את הזרימה דרך ב2 טיפות לכל צינור microcentrifuge (1.5 מ"ל). לחדול מגביית המדגם פעם הצבע בתוך צינורות microcentrifuge מתבהר.
  7. מערבבים את הצינורות המכילים מדגם RBMB הצבעוני - בדרך כלל 5-6 צינורות - ולטעון לתוך מכשיר צנטריפוגלי מסנן (10,000 MW הפסקת). צנטריפוגה המדגם ב 10,000 RCF עבור 20 דקות או עד שהנפח הרצוי. הערה: מהירויות וזמנים אלה יהיו בדרך כללתניב נפח סופי של ~ 30 μl.
  8. למדוד את הריכוז של מדגם RBMB המטוהר על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis המדויק.
    1. קח 3 μl של מדגם RBMB המרוכז ולערבב עם 117 DPBS μl בצינור microcentrifuge.
    2. בלנק ספקטרופוטומטר עם DPBS ולמדוד את הספיגה 200-800 ננומטר. הערה: שיא absorbances ב 260 ננומטר ו650 ננומטר צריך להיות גלוי.
    3. חשב את ריכוז המניות של RBMB הכלאה מבוססת על הספיגה ב 650 ננומטר, באמצעות המשוואה:
      ריכוז מניות (M) = 650 גורם לדילול * / מקדם נכחד בי 650 היא את הספיגה ב 650 ננומטר, גורם לדילול הוא 40.
      הערה: מקדם ההכחדה לCF640R ב650nm הוא 103,000 ומקדם ההכחדה לאיווה השחור RQ הוא ~ 20,000. מקדמי ההכחדה הם תוסף ואינם רגישים להכלאה. לכן, יש לו את מדגם RBMB המניה מקדם הכחדה משולבת של approximately 123,000 ב650 ננומטר.
  9. תווית הצינור כראוי עם שם וריכוז וחנות ב -20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

2 הכנת פולי-D-ליזין מצופה 8 היטב Chambered coverglass

  1. הכן פתרון 0.2 מ"ג / מ"ל ​​של פולי-D-ליזין על ידי המסת 5 מ"ג של פולי-D-ליזין (אבקת lyophilized, g-מוקרן) ב25 מ"ל מים מעוקרים בסביבת סטרילית.
  2. הוסף 200 μl של / פתרון פולי-D-ליזין מ"ל 0.2 מ"ג היטב בכל coverglass 8 היטב chambered, בסביבת סטרילית.
  3. דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 16-18 במכסת מנוע תרבית תאים.
  4. לשאוב פולי-D-ליזין ולשטוף היטב 3 פעמים עם מים מזוקקים סטריליים. הערה: ניתן לאחסן השקופיות קאמריות מצופים ב 4 ° C..

משלוח .3 Probe

הערה: מערכת התא המשמשת צריך להכיל מבנה גן משולב המבטא RNA עם לפחות 4-רציף לאגדing אתרים לRBMB באזור 3'-מתורגם (UTR). רצפי היעד צריכים להיות משלימים ללולאה של RBMB. זה מומלץ כי כביקורת שלילית, באותו קו התא להיות מהונדס לבטא אותו מבנה הגן, אך ללא חוזר טנדם. בפרוטוקול זה, שורת תאי פיברוסרקומה אנושית, HT1080, הייתה שהונדסה RNA GFP עם חזרות 96-טנדם של רצף יעד RBMB ב3'-UTR. שורת תאי שליטה תוכננה כדי להביע RNA GFP wild-type.

  1. פלייט תאים בבקבוק T25 בconfluency 40-50% יום לפני מסירת בדיקה. תרבות תאים עם תקשורת DMEM בתוספת עט 1% / סטרפטוקוקוס ו10% בסרום שור העובר (FBS), ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2.
  2. למחרת, להדליק את microporator ולהגדיר את הפרמטרים microporation ל950 V, 2 פעימות, 25 אלפית שניים. הערה: פרמטרים אלו עברו אופטימיזציה עבור HT1080 תאים, אבל הם תאים מסוג תלויים ויכולים להיות adjusטד לסוגי תאים אחרים, כמתואר בהוראות היצרן.
  3. מלא את צינור microporation עם חיץ אלקטרוליטי 4 מ"ל ומניח אותו על תחנת microporation.
  4. קח את מניית המדגם של RBMB מטוהר ולהפשיר אותו. לדלל כמה מיקרוליטר לריכוז סופי של מיקרומטר 12 עם חיץ פוספט 1x. 1 μl נחוץ עבור כל microporation.
  5. פיפטה 1 מ"ל של מדיום התרבות עם FBS אבל בלי אנטיביוטיקה לתוך צינור microcentrifuge. הערה: זה ישמש להשעות את התאים מייד לאחר microporation וניתן להפריש, סמוך למכשיר microporation, לעת עתה. ההכללה של אנטיביוטיקה בתקשורת והתרבות תקטין את כדאיות התא לאחר microporation.
  6. הסר את המדיה תרבות תא מהתאים המהונדסים HT1080 (מחוברות 60-80%), לשטוף את התאים עם 1 מ"ל Ca 2 + וMg 2 + DPBS -חינם פעם אחת, ודגירה עם טריפסין 1 מ"ל ל1-2 דק '.
  7. לעצור את trypsinization על ידי הוספת 1 מ"ל תקשורת DMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברי, ללא אנטיביוטיקה ופנול אדום, ולהעביר את התאים לשני 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge.
  8. ספין למטה התאים בצינור microcentrifuge ב XG 200 למשך 5 דקות. הסר את supernatant, resuspend ולשלב את כדורי התא בנפח סופי של 1 מ"ל DPBS.
  9. קח 10 μl מהשעית התא המעורבת היטב ולספור את התאים.
  10. פיפטה את התאים למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לוודא שהם מפוזרים היטב ולהעביר 300,000 תאים עם DPBS לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש וספין למטה XG 200 במשך 5 דקות.
  11. הסר את supernatant, נזהר שלא להפריע תא גלולה. Resuspend גלולה במאגר 11 μl resuspension ופיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לוודא שהתאים מפוזרים היטב. הקפד לא ליצור בועות אוויר. הערה: בועות אוויר תגרום ניצוץ במהלך microporation ולגרום למסירת RBMB עניה ומוות של תאים.
  12. הוסף 1 μl של RBMB המדולל (מיקרומטר 12) ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. שוב להיזהר שלא ליצור בועות אוויר.
  13. לשאוב 10 μl של תערובת RBMB התאים, באמצעות פיפטה microporation, והכנס את פיפטה לתוך צינור microporation. לחץ על הכפתור התחל כדי להתחיל את microporation. הערה: לא צריך להיות שום בועות אוויר נראות לעין בקצה.
  14. כאשר המסך של microporator תערוכות השלמה, להסיר את פיפטה מהתחנה, לגרש את תערובת 10 μl לתוך צינור microcentrifuge שהוכן קודם לכן, עם מדיום תרבות מ"ל 1 עם FBS אבל בלי אנטיביוטיקה. מערבבים בעדינות על ידי נדנדה מספר פעמים מצד לצד צינור.
  15. ספין התאים ב XG 200 למשך 5 דקות ולשטוף את התאים פעמיים נוספות, ב1 בינוני תרבות החופשית אדומה מ"ל פנול עם FBS אבל בלי אנטיביוטיקה, כדי להסיר כל RBMBs שלא נמסרו לתוך התאים. Resuspend עם מדיום תרבות אדום חינם 400 פנול μl עם FBS אבל בליאנטיביוטיקה.
  16. צלחת תאי microporated לפולי-D-ליזין המצופה coverglass חדרי 8 היטב ב200 μl בכל טוב או בconfluency הרצוי.
  17. אופציונאלי: אם רצוי תמונת הגרעין, להוסיף Hoescht 33342 לתאים בריכוז סופי של 0.01 מ"ג / מ"ל.
  18. הנח את coverglass החדרים לחממת תרבות תא. דגירה התאים עבור 1-2 שעות לפני ההדמיה, כך שהתאים יש מספיק זמן להתיישב על פני השטח coverglass. שים לב: הדמיה יכולה להתבצע בהקדם 30 דקות שלאחר microporation-.

.4 תמונת רכישה

  1. הפעל את מערכת הדגירה העליונה שלב תא החי ולאזן אותו עד שהוא מגיע 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ולחות 75%.
  2. הפעל את מקור אור מיקרוסקופ והניאון ולפתוח את תוכנת Metamorph. הערה: ניתן להשתמש גם חבילות תוכנה דומות אחרות לשליטת מיקרוסקופ ורכישת תמונה.
  3. החל שמן Immersol למטרה.
  4. העבר את coverglass חדרים עם תאי microporated למערכת הדגירה העליונה שלב תא החי. דגירה המערכת העליונה שלב עד שהטמפרטורה וCO 2 רמות התייצבו.
  5. פתח את הכרטיסייה לרכוש, בתוכנת Metamorph. לחץ על לחצן Live Show כדי למצוא את השדה, לשנות את הפוקוס תחת אור לבן ולחץ על לחצן עצירה חי.
  6. תחת הלשונית לרכוש, לחץ ולפתוח את הכפתור המוקפץ רכישת זרם, ולהגדיר את הפרמטרים לרכישת סרט הרצויים. לרכוש 150 מסגרות באמצעות מסנן Cy5 / CF640R ושמור את התמונות בכונן הקשיח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זמן קצר לאחר microporation של HT1080 תאים בנוכחות RBMBs, תעתיקי רנ"א אדם שהונדסו כדי להכיל אתרי RBMB מחייב מרובים ב3'-UTR שלהם מופיעים כתמים בהירים כמו ניאון כאשר צילמו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב (איור 2). בעוד תעתיקי רנ"א אדם עם אתרי קישור כמה כמו ארבעה RBMB ניתן הדמיה בזמן אמת תאים, יותר RBMB אתרי קישור ב3'-UTR, אות הניאון חזקה. יתר על כן, RBMBs יותר, המאוגדים לכל תמליל ארוך יותר RNA יכול להיות דמיין לפני האות הולכת לאיבוד בשל photobleaching. בפרוטוקול זה, RNA היה מהונדס להכיל חזרות 96-טנדם של רצף יעד RBMB ב3'-UTR. הרכישה של תמונות הזרמה מאפשרת תעתיקי רנ"א בודדים להיות צילמו בזמן אמת (סרט 1). אפשר בקלות לראות תעתיקי רנ"א עצמם ינועו בתוך הציטופלסמה לבין גרעין of התאים. בעוד שרוב הכתמים מופיעים לעבור תנועות בראונית או תת diffusive, במקרים נדירים RNA עובר תחבורה בבימויו יקויימו (סרט 2). תזות תעתיקי רנ"א בדרך כלל לנוע במהירות לאורך נתיב ישר (איור 3); עם זאת, כמה RNA אין מעקב נתיבים מעוקלים או לבצע שינויים פתאומיים בכיוון. תנועות אלה הן בניגוד חד לתנועות בראונית, שהם אקראיים בטבע ולהציג התקות הכוללות קטנות בתוך הפרק זמן הקצר רכשו כאן (כלומר <1 דקות). תנועות RNA בבימויו עולות בקנה אחד עם ההובלה של RNA יחד microtubules וסיבים מיקרוסקופים. ניסויים אלה מצביעים על כך שRBMBs לספק כלי תכליתי וחזק להדמית תעתיקי רנ"א בודדים בתאים חיים.

איור 1
איור.1 סכמטי של RBMBs ותעתיקי רנ"א פרט תמונה המשמשת המתודולוגיה בתאים חיים.) RBMBs בנוכחות והיעדרות של RNA היעד המשלים. בRNA ההיעדרות או היעד, הקרינה RBMB הוא הרווה. בנוכחותו של RNA היעד, הקרינה RBMB משוחזרת. B) RBMBs מרובה לאגד כל תעתיקי הרנ"א יצירת נקודת ניאון בהיר שיכול להיות מזוהות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
2 תמונת נציג איור של תאי HT1080 יציבות להביע RNA עם) חוזר 96-טנדם או B) חוזר 4 טנדם-של האתר מחייב RBMB ב3'-UTR, בעקבות המסירה תאית של RBMBs. הנוכחות של חזרות 96-בד בבד מאפשרת תעתיקי רנ"א בודדים להופיע ככתמים בהירים ניאון. יכול גם להיות דמיין RNA המכיל רק חוזר על 4 טנדם-, אבל האינטנסיביות של כתמי הניאון היא מאוד עמומה ולעתים קרובות לזיהוי רק באזורים של רקע נמוך במיוחד. המספר הקטן של נקודות בהירות במיוחד מתאים לRNA כי הוא לא זז. סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
Montage איור 3 של תעתיקי הרנ"א עובר בבימוי תחבורה. מסלולו של התמליל מוצג בפינה השמאלית ביותר בלוח. המסלול הוא שיכסה f אחתrame של סדרת הזמן. סרגל קנה מידה:. 2.5 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סרט 1 סרט נציג של תאי HT1080 יציבות להביע RNA עם חזרות 96-טנדם של אתר קישור RBMB ב3'-UTR, בעקבות המסירה תאית של RBMBs. תעתיקי רנ"א בודדים מופיעים כתמים בהירים כמו ניאון. סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר לחץ כאן לצפייה בוידאו.

סרט 2 סרט נציג של תעתיקי הרנ"א עוברים תחבורה בבימויו. סרגל קנה מידה:. 10 מיקרומטר לחץ כאן לצפייה בוידאו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יכולת תמלילים יחידים תמונה מהונדסת RNA בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב קונבנציונלי דורשת אות ניאון בהירה וphotostable להיות מזוהה עם כל תעתיקי הרנ"א ורקע ניאון נמוך הנובע מבדיקות ניאון מאוגדים. בשיטה זו, אות ניאון בהירה מושגת על ידי הכלאה מרובה (עד 96) בדיקות ניאון מבוסס oligonucleotide, RBMBs כלומר, על כל תעתיקי הרנ"א. עם זאת, כמה כמו ארבעה אתרי איגודים מספיקים 16. האותות הקולקטיביים לגרום לנקודת אור ניאון שיכול לעקוב בזמן אמת. הנוכחות של בדיקות מרובות גם מאפשרת פעמים הדמיה עוד, מאז חלק ניכר מצבעי הניאון יש photobleached לפני האות הקולקטיבית הולכת לאיבוד. הוא חזה כי טכניקה זו תספק תובנה ייחודית ביולוגיה RNA ולאפשר ללימוד מגוון רחב של התנהגויות RNA הנע בין מדידת התגובת דואר סחר RNA לגירויים חיצוניים שונים, התבוננות דפוסי לוקליזציה subcellular ייחודיים של RNA היעד, לומדים את הגורל וחיים שלמים של RNA, ומספק תובנה הרגולציה RNA. בנוסף ייתכן שניתן לעקוב אחר שינויים (כלומר למעלה ולמטה רגולציה) בביטוי RNA. למרות שיכולת זו עדיין לא אומתה, שהראינו בעבר כי עותק RNA מספר ניתן לכמת בצורה מדויקת למדי לתקופה של עד 24 שעות בתאים חיים 22. יתר על כן, RBMBs אינו מופיע כדי להשפיע על הרמה של ביטוי גנים. בשילוב, תוצאות אלו מספקות הוכחה ראשונית ששינויים בביטוי גנים במהלך תקופת זמן זו אותרו במדויק, על בסיס תא אחר תא, ושRBMBs לא הובילה לעלייה ביציבות RNA או האט השפלה RNA. עם זאת, לא ברור למה ביטוי גנים במידה למעשה השתנה בתקופה זו, אם בכלל.

באופן כללי, זה הואצפוי כי כל עלייה בביטוי גנים הייתה להיות מזוהות בקלות; בשל השפע של RBMB מאוגד בתא כי הוא חופשי להיקשר תמלילים שהוקמו זה עתה. עם זאת, מה שפחות ברור הוא איך RBMBs לנתק מRNA במהלך תרגום והשפלה ואם יש פיגור מסוים בין ביטוי RNA / השפלה וההדמיה של תמלילים אלה. מחקרים נוספים עדיין נדרשים כדי להבין את ביצועי RBMB בתרחישים אלה טובים יותר.

כמה גישות חלופיות להדמית תעתיקי רנ"א אחת כבר דיווחו בעבר. המחקרים המוקדמים המעורבים fluorescently תיוג תעתיקי רנ"א מבודדים ומחדש החדרת תמלילים אלה לתאים, בדרך כלל על ידי microinjection 23,24. האות לרקע של גישה זו היא גבוהה מאוד, בשל היכולת להסיר כל צבעי ניאון מאוגדים, אבל יש חששות לגבי השאלה האם התנהגות RNA הנצפית מייצגת במדויק את Truעיבוד RNA דואר. הפתרון הנפוץ ביותר לחסרון זה היה כרוך בtransgenes הנדסה עם חוזר טנדם ב3'-UTR שיכול להיות מחויב על ידי כתב ניאון, מקביל לגישת RBMB שהוצגה כאן. כתבי ניאון קודמים כללו מולקולות קטנות שלזרוח רק על כריכת aptamers RNA, המכונית גם 25 תרד, וGFP. התרד עדיין לא היה בשימוש להדמית תעתיקי רנ"א בודדים, אך כבר בשימוש לביטוי גלובלי תמונה. בניגוד לכך, GFP נעשה שימוש כדי תמונה בהצלחה תעתיקי רנ"א יחידים. בגישה זו, כתב GFP הוא התמזגו לחלבון המעיל של MS2 חיידקי הפאג (GFP-MS2) ונקשר לרנ"א מהונדס לבנות עם חוזר טנדם של האתר מחייב MS2 ב3'-UTR 2,10. בעוד גישה זו דומה מאוד לגישה שתוארה כאן, RBMBs מציע מספר יתרונות. לדוגמא, RBMBs לאפשר fluorophores האורגני לשמש להדמיה, המספק div רחב יותרersity של אפשרויות עם photostability מעולה ובהירות מעולה בהשוואה לחלבוני ניאון. יתר על כן, יש fluorophores האורגני זמין מסחרי רב הפולטים בהרבה לאינפרא אדום קרוב. היתרון של בחירת צבעים בספקטרום פליטת אדום העביר נובע מautofluorescence הסלולרי נמוך יותר נצפה באורכי גל אלה. מאז רמות גבוהות של autofluorescence יכולות בקלות להטביע את כל אותות ניאון הקשורים לכלת RNA, את היכולת להפחית באופן דרמטי autofluorescence מספקת דחיפה חשובה באות לרקע. יתרון חשוב נוסף של שימוש בRBMBs הוא שהאות מחיישנים פזורים הוא הרווה באופן משמעותי. אמנם, ננקטו גישות שונות על מנת לצמצם את הקרינה הרקע של GFP מאוגד בגישת GFP-MS2, למשל, שימוש באותות לוקליזציה גרעיניים, שליטה ברמות הביטוי של GFP, ושלמת GFP פיצול 1,10,11,26,27, נוכחות של moie מרווה בפועלty בתוך עיצוב RBMB מספק למשתמשי גמישות ניסיונית הרבה יותר גדולה. לדוגמא, גישת RBMB היא רגישה יחסית לשניהם ברמה היחסית ומוחלטת של ביטוי RNA וריכוז בדיקה. למעשה, ניתן הדמיה תעתיקי אדם עם ריכוזי RBMB כי היקף בסדר גודל. היתרונות בשילוב של photostability גבוה יותר, אות בהירה, ורקע נמוך יותר לעשות ניסויי הדמיה RNA בזמן אמת עם RBMBs הרבה יותר נגיש עבור משתמשים במיקרוסקופ עם מומחיות מוגבלת.

אולי, החסרון הבולט ביותר של שימוש בבדיקות אקסוגניים כגון RBMBs, בניגוד לכתב מולקולרי כגון GFP, הוא את הצורך במשלוח תאיים. למרבה המזל, מספר האפשרויות קיימות, למשל, microinjection 28, סוכני transfection 29, פפטידים תא חודר 30, וstreptolysin O (SLO) ביום 31 ב. באופן אישי, מצאנו כי microporation הואידידותית ותכליתית האפשרות ביותר למשתמש, בדרך כלל כתוצאה מכך> 95% יעילות כדאיות ומשלוח 21. זה ככל הנראה משום שתהליך electroporation microliter הנפח מציג ירידה באירועים הרבים המזיקים קשורים לעתים קרובות עם electroporation, כוללים דור חום, פירוק יון מתכת, וריאציה pH והיווצרות תחמוצת. חשוב לציין, microporation הוא גם נוח ללימודי תפוקה גבוהה, מאז RBMBs יכול להיות מועבר לתוך> 100,000 תאים בניסוי אחד.

למרות יתרונות הרבים של שימוש בRBMBs ללוקליזציה RNA התמונה ותנועה בתאים חיים, מספר המגבלות והאתגרים עדיין נותר. אולי, האתגר הגדול ביותר הוא חוסר היכולת לעקוב אחר RNA ליותר מכמה תחת חשיפה ממושכת דקות. זוהי תוצאה של שני photobleaching והיכולת של RNA לצאת ממטוס ההדמיה מוקדי. צבעים בהירים וphotostable יותר יכולים לעזור אלleviate שני חסרונות אלה, על ידי הגדלת המספר של פעמים בכל צבע יכול להיות נרגש ומאפשר כתמים הבדידים ניאון להיות צילמו במרחקים גדולים יותר ממישור המוקד. גישה מבטיחה אחת כדי להגדיל את photostability כרוך בשימוש בצבעים ריפוי עצמי, אשר מנצלים שלישיית מדינת quenchers בסמיכות לfluorophore האורגני להארכת חייהם 32. אפשרות נוספת עשויה להיות השימוש בפולימרי הגברה מצומדות ניאון, אשר מורכבים ממספר רב של fluorophores המחובר, שלא להרוות עצמי. פולימרים אלו יכולים להיות פעמים רבות בהירות יותר fluorophores האורגני אחת, ובכל זאת עדיין להיות הרווה ביעילות על ידי מחצית מרווה יחידה 33,34; עם זאת, עבודה נוספת בתחום זה עדיין יש צורך. יש לציין כי הדמיה לסירוגין, עם קצב פריימים> 1 מסגרת לשנייה, לא ניתן לבצע לתמונת תעתיקי הרנ"א יחיד על פני תקופות זמן ארוכות משום שקשה להבטיח שזה לאהוא זהה תעתיקי הרנ"א במעקב ממסגרת אל מסגרת. כמובן, הערכה כמותית של ביטוי גנים ברמת התא הבודד עדיין אפשרית על מסגרות זמן ארוכות, באמצעות ספירת מקומות מסוימות ניאון על בסיס לכל תא 16,35,36. במקרה זה, אין צורך לעקוב אחר תמלילים בודדים. בסך הכל, הוא האמין כי RBMBs מסוגל לספק תובנה חשובה לתפקוד RNA ומאפשר ההדמיה של תעתיקי רנ"א מהונדסים יחידים עם ציוד מיקרוסקופי קונבנציונלי ומומחיות מוגבלת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד"ר מארק Behlke וד"ר לינג הואנג מועסקים על ידי IDT אשר מציעים oligonucleotides למכירה דומה לחלק מהתרכובות שתוארו בכתב היד. IDT, עם זאת, לא חברה ציבורית, והם באופן אישי לא בעלי מניות כלשהן / הון בIDT.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על קרן מדע קריירת הפרס הלאומי (0953583) והמכון הלאומי לבריאות NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766 על ידי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nuclease-free water Life Technologies AM9932 no DEPC-treated
DPBS Life Technologies 14190-144 No Ca2+ and Mg2+
Cary 100 UV-Vis spectrophotometer Agilent Technologies
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P284-500
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific S381-500
Microcentrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 ml
Chromatography column Kimble Chase Life Science 420400-0720 0.7 x 20 cm
Superdex 75 prep grade GE healthcare 17-1044-01
Syringe pump Braintree Scientific BS-300
Syringe BD 301035 60 ml, Luer-lok tip
Centrifugal filter units Millipore UFC501096 MW 10,000 cutoff
Centrifuge 5418 Eppendorf
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P7280-5MG lyophilized powder, g-irradiated
8-well chambered coverglass Fisher Scientific 155409 Working volume 0.2-0.5 ml
HT1080 ATCC CCL-121 Human Fibrosarcoma cell line
Cell culture flask Corning 430639 25 cm2
DMEM Life Technologies 11965084 High glucose
DMEM without phenol red Life Technologies 21063029 High glucose
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500ML
Penecillin/streptomycin Life Technologies 15140122
Trypsin Life Technologies 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Neon transfection system Life Technologies MPK5000
Neon transfection system kit Life Technologies MPK1096
Hemacytometer Fisher Scientific 02-671-10
Hoescht 33342 Life Technologies H1399
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus
SOLA light engine Lumencor
Metamorph Molecular Devices Software controlling microscope
Immersol oil 518F Fisher Scientific 12-624-66B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6, (5), 331-338 (2009).
  2. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, (4), 437-445 (1998).
  3. Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30, (12), 621-626 (2012).
  4. Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16, (10), 1018-1025 (2006).
  5. Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109, (19), 7350-7355 (2012).
  6. Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102, (42), 15110-15115 (2005).
  7. Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13, (14), 1159-1168 (2003).
  8. Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11, (2), 251-262 (2006).
  9. Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315, (7), 1142-1147 (2009).
  10. Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13, (2), 161-167 (2003).
  11. Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4, (5), 413-419 (2007).
  12. Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4, (8), 633-636 (2007).
  13. Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
  14. Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102, (47), 17008-17013 (2005).
  15. Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38, (14), e148 (2010).
  16. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. (2013).
  17. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30, (19), 4208-4215 (2002).
  18. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31, (4), 1319-1330 (2003).
  19. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
  20. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31, (13), 3406-3415 (2003).
  21. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36, (12), e69 (2008).
  22. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41, (15), e152 (2013).
  23. Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123, (2), 431-441 (1993).
  24. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20, (7), 380-390 (2010).
  25. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333, (6042), 642-646 (2011).
  26. Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23, (16), 3346-3355 (2004).
  27. Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4, (5), 421-427 (2007).
  28. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35, (16), e105 (2007).
  29. Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2, (4), 315 (2009).
  30. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32, (6), e58 (2004).
  31. Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32, (6), e57 (2004).
  32. Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9, (1), 68-71 (2012).
  33. Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101, (20), 7511-7515 (2004).
  34. Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44, (17), 2572-2576 (2005).
  35. Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37, (14), e100 (2009).
  36. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, (10), e309 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics