Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

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Biology

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Summary

Ratiometric balizas bimoleculares (RBMBs) se pueden utilizar para los transcritos de ARN de ingeniería imagen individuales en las células vivas. Aquí se describe la preparación y purificación de RBMBs, entrega de RBMBs en las células mediante formación de microporos y la imagen fluorescente de transcritos de ARN individuales en tiempo real.

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Song, Y., Zhang, X., Huang, L., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons. J. Vis. Exp. (90), e51544, doi:10.3791/51544 (2014).

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Abstract

La creciente conciencia de que tanto la regulación temporal y espacial de la expresión génica puede tener consecuencias importantes sobre la función celular ha llevado al desarrollo de diversas técnicas para visualizar las transcripciones de ARN individuales en células vivas individuales. Una técnica prometedora que ha sido recientemente descrito utiliza una sonda de oligonucleótidos basados ​​en óptica, radiométrica faro bimolecular (rbmb), para detectar transcritos de ARN que fueron diseñados para contener al menos cuatro repeticiones en tándem de la secuencia diana rbmb en la región 3 'no traducida. RBMBs están específicamente diseñados para emitir una señal fluorescente brillante tras la hibridación con ARN complementario, pero por lo demás permanecen apagados. El uso de una sonda sintética en este enfoque permite fotoestable, desplazada al rojo, y colorantes orgánicos altamente emisivo para ser utilizado para la imagen. La unión de múltiples RBMBs a las transcripciones de ARN de ingeniería resultados en puntos discretos de fluorescencia cuando se observa bajo un microscopio de fluorescencia de campo amplio. En consecuencia, el movimiento de transcritos de ARN individuales puede ser visualizado fácilmente en tiempo real mediante la adopción de una serie temporal de imágenes fluorescentes. Aquí se describe la preparación y purificación de RBMBs, entrega en las células mediante formación de microporos y vivimos de células de formación de imágenes de transcritos de ARN individuales.

Introduction

La expresión y la regulación de las transcripciones de ARN es un proceso complejo y dinámico que es en gran parte responsable de controlar el comportamiento de las células y el destino. Aunque la importancia de ARN en función de la célula dictando ha sido conocido durante algún tiempo, a menudo es difícil establecer conexiones claras entre los dos ya que la mayoría de las herramientas de análisis de ARN carecen de la resolución espacial y temporal requerida para capturar eventos regulatorios importantes, tales como rotura de la transcripción, ARN el tráfico y el procesamiento del ARN localizada. Esto ha llevado a la llegada de varias técnicas que permiten transcritos de ARN individuales para ser visualizados en las células vivas en tiempo real 1. Quizás, la más prominente de estas técnicas utiliza una proteína de fusión GFP-MS2 al ARN diana que ha sido diseñado para contener repeticiones en tándem del sitio de unión MS2 en la 3'-UTR 2,3. Al reunir múltiples moléculas GFP en estrecha proximidad, transcripciones de ARN individuales aparecen como puntos fluorescentes brillantesa través de microscopía de fluorescencia. El sistema de GFP-MS2 ha proporcionado una visión sin precedentes sobre el comportamiento de ARN, incluyendo la visualización directa y la medición de la transcripción de ruptura de 4,5, la detección de la única localización y procesamiento 6-9 subcelular, y de imágenes en tiempo real del transporte de ARN 10. Sin embargo, a pesar del enorme potencial del sistema de GFP-MS2, proteínas de fusión GFP-MS2 no unidos pueden crear una señal fluorescente de alta de fondo que limita la flexibilidad y el rango dinámico de esta técnica. Se han desarrollado varios enfoques para limitar esta señal de fondo, incluyendo la compartimentación subcelular de GFP no unido MS2-10, proteína de fragmento de complementación 11, y las proteínas de unión de ARN alternativos y objetivos 12. Sin embargo, todos estos enfoques siguen siendo sensibles a la expresión relativa y total de la diana de ARN y la proteína de fusión GFP-MS2.

Como unaLTERNATIVA a los sistemas de GFP-MS2, balizas moleculares se han utilizado también para detectar transcritos de ARN de ingeniería con repeticiones en tándem del sitio de unión complementario en la 3'-UTR 13,14. Las balizas moleculares son sondas de oligonucleótidos de formación de horquilla que están etiquetados en un extremo con un extintor y en el otro extremo con un indicador fluorescente. Cuando no unido a ARN diana el reportero fluorescente y desactivador permanecer en estrecha proximidad, dando como resultado un estado de baja fluorescente. Tras la hibridación, el indicador fluorescente y el extintor se ven forzadas a separarse y la fluorescencia se restaura. Similar al sistema de GFP-MS2, la unión de múltiples balizas moleculares en un único transcrito de ARN resultados en una mancha fluorescente brillante que se puede identificar mediante microscopía de fluorescencia; Sin embargo, se espera que la fluorescencia de fondo a ser mucho menor, debido a la configuración de no unidos se inactivó balizas moleculares. Desafortunadamente, a pesar del mecanismo de activación inteligente que se incorpora en el mdiseño de baliza olecular, ahora hay evidencia creciente de que las balizas moleculares no hibridadas no permanecen en la conformación de horquilla cuando se introduce en las células vivas. En consecuencia, se generan una señal de falso positivo que reduce significativamente la relación señal a fondo. Para superar este inconveniente, recientemente hemos desarrollado una nueva sonda sintética de ARN de imágenes en las células vivas, ratiometric balizas bimolecular (RBMBs; Figura 1A) 15,16. RBMBs se componen de dos cadenas de oligonucleótidos 2'-O-metilo que forman una estructura híbrida con características tanto de ARN de horquilla corta (ARNhc) y balizas moleculares. El mecanismo de bucle y la activación de fluorescencia es similar a la baliza molecular, mientras que el largo dominio de doble cadena con un saliente 3 'UU es más característico de shRNA. Las características shRNA están diseñados para impulsar las exportaciones nucleares, lo que hemos encontrado incrementos vida intracelular a> 24 h, con la degradación observable mínimo, yimpide la apertura no específica del bucle. Como resultado RBMBs exhiben un fondo señal-significativamente mayor que las balizas moleculares.

Cabe señalar que RBMBs no se puede preparar utilizando oligonucleótidos de ADN, ya que las sondas basadas en el ADN no poseen las mismas capacidades de exportación nuclear como sondas basados ​​en ARN. Estructuralmente, el bucle rbmb está típicamente diseñado para ser entre 15 y 21 bases de longitud, para crear un equilibrio entre la especificidad y la selectividad al ARN hibridación. El tallo corto que se forma a partir de los dos dominios de auto-complementarias está generalmente diseñado para ser 4 bases. Si se selecciona un vástago más largo, la velocidad de hibridación entre el bucle rbmb y ARN diana se ralentiza significativamente 17,18. Por el contrario, cuando se selecciona una secuencia de tallo más corto la temperatura de fusión es a menudo demasiado bajo para sostener la estructura de tallo-bucle a 37 ° C, dando lugar a una señal de fondo. La especificidad de la rbmb también es de color rojouced como la longitud del tallo se acorta. Dado que la secuencia de la rbmb tallo-bucle también puede influir en el rendimiento rbmb, debe ser cuidadosamente seleccionado 19. En particular, las secuencias de bucle ideales deben tener un mínimo de estructura secundaria, se hibridan con las secuencias de ARN con estructura secundaria mínimo, evitar los sitios de unión a proteínas, y evitar fuera de objetivo vinculante. Las predicciones de tanto rbmb y la estructura secundaria del ARN se pueden obtener usando software tal como mfold 20. Complementarias sitios fuera de objetivo pueden identificarse utilizando un nucleótido Basic Local herramienta para asignación de Búsqueda (BLAST). Sin embargo, debido a las inconsistencias en las predicciones del modelo y la dificultad en la identificación de los sitios de proteínas de presagiar, la especificidad de todos RBMBs última instancia, debe ser validada experimentalmente.

Si se desea, un colorante de referencia unquenched que es insensible al estado de hibridación puede ser añadido a la rbmb 15. La adición de un colorante de referencia puede prOvide un marcador para la entrega de la sonda y se utiliza para la imagen radiométrica, si se requieren mediciones más precisas de la fluorescencia celular total. Los tintes de referencia permite realizar mediciones ajustadas a los diferentes antecedentes, debido a las variaciones de célula a célula en la entrega. Sin embargo, cuando la formación de imágenes individuales de ARN transcripciones del colorante de referencia no es necesario. En particular, algunos de los colorantes de referencia pueden interferir con la exportación de RBMBs desde el núcleo, dando lugar a una señal de fondo ligeramente más alto en el núcleo.

Cuando se diseñan adecuadamente, RBMBs se pueden utilizar para imagen transcritos de ARN individuo en células vivas, si el ARN diana está diseñado para contener al menos cuatro sitios de unión rbmb (Figura 1B) 16. RBMBs pueden ser entregados de manera eficiente en una amplia gama de tipos de células a través de microporos, con poco o ningún efecto sobre la viabilidad celular 21, y las mediciones cuantitativas de la expresión génica puedeadquirida en los 30 minutos. Por otra parte, la metodología es bastante insensible a niveles de concentración rbmb y ARN diana, ya que la fluorescencia de RBMBs no unidos se apaga de manera eficiente. Aquí le ofrecemos una descripción detallada de la metodología utilizada para preparar y purificar RBMBs, así como un procedimiento general para la entrega de RBMBs en células vivas a través de microporos y la imagen de las transcripciones de ARN individuales en tiempo real.

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Protocol

En este protocolo, un oligonucleótido (RBMB1) fue marcado en su extremo 5 'con un colorante indicador CF640R y tiene la secuencia: 5'mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC Mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3'. Dominios autónomos complementaria, que impulsan la formación de la estructura de horquilla, están en negrita. El segundo oligonucleótido (RBMB2) se marcó en el extremo 3 'con un extintor Iowa Negro RQ-Sp y tiene la secuencia: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3'.

1 Preparación de RBMBs

  1. Realizar un giro rápido de los tubos que contienen los oligonucleótidos RBMB1 y RBMB2, para asegurar el oligonucleótido seca es en la parte inferior del tubo, y resuspender en DNasa y RNasa libre de agua a una concentración final de 100 mM. Por ejemplo, una muestra de 10 nmol de oligonucleótido debe resuspendió en 100 l de agua.
  2. Measure la concentración exacta de muestras RBMB1 y RBMB2 acciones mediante espectroscopia UV-vis.
    1. Mezclar 3 l de la muestra con 117 rbmb mu l DPBS (sin calcio y magnesio) en un tubo de microcentrífuga.
    2. En blanco el espectrofotómetro con DPBS y medir la absorbancia 200-800 nm. Nota: Pico de las absorbancias a 260 nm y 650 nm debe ser visible.
    3. Calcular la concentración de stock de las muestras rbmb basados ​​en la absorbancia a 260 nm (o 650 nm para RBMB1), usando la ecuación:
      Stock Concentración (M) = A 260 factor de dilución * / coeficiente de extinción donde A 260 es la absorbancia a 260 nm y el factor de dilución es 40.
      Nota: El coeficiente de extinción para la rbmb se puede encontrar en la hoja de especificaciones proporcionado por el fabricante oligonucleótido. El coeficiente de extinción de CF640R a 650 nm es 103.000.
  3. Mezclar 20 l de 100 RBMB1 M, 30 l de RBMB2 100 m, 6 l 10x; Tampón fosfato (10x tampón fosfato 480 mM K 2 HPO 4, 45 mM KH 2 PO 4, 140 mM NaH 2 PO 4, pH 7,2) y 4 l de DNasa y RNasa libre de agua. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min. Nota: Esta es normalmente suficiente para aproximadamente 50 estudios.
  4. Preparar una columna de cromatografía líquida utilizando 75 prep grado Superdex de quitar cualquier oligonucleótidos RBMB2 sin hibridar. Utilice un niño de 8 ml (0,7 x 20 cm) de la columna de cromatografía de líquidos con un volumen de ~ 4 ml cama para purificar el pequeño volumen de sondas mixtas.
  5. Lavar y equilibrar la Superdex con ~ 50 ml de tampón de fosfato 1x utilizando una bomba de jeringa se ejecuta en un flujo a una velocidad de flujo de 0,6 ml / min. Antes de que todo el fluido entra en el volumen de lecho, detener la bomba de jeringa, separarla, y dejar que el líquido restante pasa por la columna por gravedad.
  6. Cargar la mezcla rbmb (60 l) en la columna de cromatografía.
    1. Después de la muestra rbmb tiene completamenteentrado en la cama, añadir lentamente otros 250 l de tampón de fosfato 1x a la parte superior de la cama para asegurarse de que toda la muestra ha entrado completamente la columna.
    2. Llene la columna a la llanta con tampón de fosfato 1x. Cierre la tapa y encienda la bomba de jeringa - la jeringa debe estar lleno de ~ 50 ml 1x PBS y se ejecute a una velocidad de flujo de 0,6 ml / min.
    3. Una vez que el rbmb se acerca a la parte inferior de la columna - la muestra rbmb típicamente puede ser visualizado fácilmente debido a que el color del colorante incorporado en la sonda - recoger el flujo a través a 2 gotas por tubo de microcentrífuga (1,5 ml). Deje de tomar la muestra una vez que el color dentro de los tubos de microcentrífuga se aclara.
  7. Combine los tubos que contienen la muestra rbmb color - típicamente 5-6 tubos - y cargarlo en un dispositivo de filtro centrífugo (10.000 MW de corte). Centrifugar la muestra a 10.000 RCF durante 20 min o hasta que el volumen deseado. Nota: Estas velocidades y tiempos típicamenteproducir un volumen final de ~ 30 l.
  8. Medir la concentración exacta de la muestra rbmb purificada mediante espectroscopia UV-Vis.
    1. Tomar 3 l de la muestra rbmb concentrada y mezclar con 117 mu l DPBS en un tubo de microcentrífuga.
    2. En blanco el espectrofotómetro con DPBS y medir la absorbancia 200-800 nm. Nota: Pico de las absorbancias a 260 nm y 650 nm debe ser visible.
    3. Calcular la concentración de stock de la rbmb hibridado basado en la absorbancia a 650 nm, usando la ecuación:
      Stock Concentración (M) = A 650 factor de dilución * / coeficiente extinto donde A 650 es la absorbancia a 650 nm, el factor de dilución es 40.
      Nota: El coeficiente de extinción para CF640R a 650 nm es de 103.000 y el coeficiente de extinción de Iowa Negro RQ es ~ 20000. Los coeficientes de extinción son aditivos y no son sensibles a la hibridación. Por lo tanto, la muestra de stock rbmb tiene un coeficiente de extinción combinada de approximately 123 000 a 650 nm.
  9. Etiquetar el tubo de manera apropiada con el nombre y la concentración y se almacenan a -20 ° C para su uso futuro.

2 Preparación de poli-D-lisina recubierto de 8 pocillos Septadas cubreobjetos

  1. Preparar una solución de 0,2 mg / ml de poli-D-lisina por disolución de 5 mg de poli-D-lisina (polvo liofilizado, irradiado-g) en 25 ml de agua esterilizada en un ambiente estéril.
  2. Añadir 200 l de la solución de poli-D-lisina 0,2 mg / ml a cada pocillo de un cubreobjetos de 8 pocillos cámaras, en un ambiente estéril.
  3. Incubar a temperatura ambiente durante 16-18 horas en la campana de cultivo de células.
  4. Aspirar el poli-D-lisina y lavar el pozo 3 veces con agua destilada estéril. Nota: Los portaobjetos de cámara recubiertas pueden almacenarse a 4 ° C.

3. Sonda Entrega

Nota: El sistema celular utilizada debe contener un constructo de gen integrado que expresa RNA con al menos 4-secuencial binding sitios para la rbmb en la región 3 'no traducida (UTR). Las secuencias diana deben ser complementarias al bucle del rbmb. Se aconseja que como control negativo, la misma línea de células por ingeniería genética para expresar la misma construcción génica, pero sin las repeticiones en tándem. En este protocolo, una línea celular de fibrosarcoma humano HT1080, fue diseñado para expresar ARN GFP con repeticiones de 96 en tándem de la secuencia diana rbmb en la 3'-UTR. La línea celular de control fue diseñado para expresar GFP de tipo salvaje ARN.

  1. Células de la placa en un matraz T25 en 40-50% de confluencia un día antes de la entrega de la sonda. Cultivar las células con medio DMEM suplementado con 1% penicilina / estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS), y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2.
  2. Al día siguiente, encender la microporator y configurar los parámetros de microporos a 950 V, 2 pulsos, 25 ms. Nota: Estos parámetros se han optimizado para las células HT1080, pero son de tipo celular dependiente y pueden ser adjusTed para otros tipos de células como se describe en las instrucciones del fabricante.
  3. Llene el tubo de microporos con 4 ml de tampón electrolítico y colocarlo en la estación de microporos.
  4. Sacar la muestra de stock de rbmb purificado y descongelarlo. Diluir varios microlitros a una concentración final de 12 mM con tampón de fosfato 1x. Se necesita 1 l para cada microporos.
  5. Pipetear 1 ml de medio de cultivo con FBS pero sin antibióticos en un tubo de microcentrífuga. Nota: Esto será utilizado para suspender las células inmediatamente después de microporos y se puede dejar de lado, cerca del dispositivo de microporos, por el momento. La inclusión de antibióticos en medios de cultivo disminuirá la viabilidad celular después de microporos.
  6. Retire el medio de cultivo celular de las células HT1080 de ingeniería (60-80% confluentes), lavar las células con 1 ml de Ca2 + y Mg2 + DPBS -Libre una vez, y se incuba con 1 ml de tripsina durante 1-2 min.
  7. Detenga el trypsinization mediante la adición de 1 ml de medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, antibióticos y sin rojo de fenol, y la transferencia de las células en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
  8. Centrifugar las células en el tubo de microcentrífuga a 200 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante, resuspender y combinar los sedimentos celulares en un volumen final de 1 ml de DPBS.
  9. Tomar 10 l de la suspensión celular bien mezclado y contar las células.
  10. Pipetear las células arriba y abajo varias veces para asegurarse de que están bien dispersos y transferir 300.000 células con DPBS en un nuevo tubo de 1.5 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min.
  11. Eliminar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular. Resuspender el precipitado en tampón de resuspensión 11 l y la pipeta arriba y abajo varias veces para asegurar que las células se dispersan bien. Asegúrese de no generar burbujas de aire. Nota: Las burbujas de aire causarán una chispa durante microporación y dar lugar a la entrega rbmb pobres y la muerte celular.
  12. Añadir 1 l de la rbmb diluido (12 M) y mezclar bien pipeteando arriba y abajo varias veces. Una vez más tener cuidado de no generar burbujas de aire.
  13. Aspirar 10 l de la mezcla de células rbmb con la pipeta de microporos, e inserte la pipeta en el tubo de microporos. Presione el botón de inicio para iniciar el microporación. Nota: No debe haber burbujas de aire visibles en la punta.
  14. Cuando la pantalla del microporator muestra la terminación, retirar la pipeta de la estación, expulsar la mezcla de 10 l en el tubo de microcentrífuga que se preparó anteriormente, con medio de cultivo con 1 ml de FBS, pero sin antibióticos. Mezclar suavemente oscilando el tubo de lado a lado varias veces.
  15. Haga girar las células a 200 xg durante 5 minutos y se lavan las células dos veces más, en 1 ml de fenol medio de cultivo libre de rojo con FBS pero sin antibióticos, para eliminar cualquier RBMBs que no fueron entregados a las células. Resuspender con 400 l de fenol medio de cultivo libre de rojo con FBS pero sinantibióticos.
  16. Placa de las células microporos en el cubreobjetos recubiertos de 8 pocillos cámaras en 200 l por pocillo o en la confluencia deseada poli-D-lisina.
  17. Opcional: Si es deseable a la imagen del núcleo, añadir Hoescht 33.342 a las células a una concentración final de 0,01 mg / ml.
  18. Coloca los cubreobjetos con cámaras en una incubadora de cultivo celular. Se incuban las células durante 1-2 horas antes de la imagen, de modo que las células tengan suficiente tiempo para asentarse en la superficie cubreobjetos. Nota: Imaging puede realizarse tan pronto como 30 minutos después de la formación de microporos.

4. Image Acquisition

  1. Encienda el sistema de incubación de la etapa superior de células vivas y equilibrar hasta que llegue a 37 ° C, 5% de CO 2, y 75% de humedad.
  2. Encienda la fuente de luz del microscopio y fluorescente y abrir el software Metamorph. Nota: Otros paquetes de software similares para el control de microscopio y de adquisición de imágenes también se pueden utilizar.
  3. Aplique aceite Immersol a laobjetivo.
  4. Transferir el cubreobjetos cámaras con células microporos al sistema de incubación superior etapa de células vivas. Incubar el sistema de etapa superior hasta que la temperatura y los niveles de CO2 se estabilicen.
  5. Abra la ficha Adquirir, en el software Metamorph. Haga clic en el botón Show en vivo para encontrar el campo, ajustar el foco con luz blanca y haga clic en el botón Detener en vivo.
  6. En la ficha Adquirir, hacer clic y abrir el botón emergente de adquisición corriente, y establecer los parámetros de adquisición de películas deseadas. Adquirir 150 fotogramas utilizando el filtro de Cy5 / CF640R y guardar las imágenes en el disco duro.

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Representative Results

Poco después de la formación de microporos de las células HT1080 en presencia de RBMBs, transcripciones de ARN individuales que fueron diseñados para contener múltiples sitios de unión rbmb en su 3'-UTR aparecen como puntos fluorescentes brillantes cuando reflejada por el amplio campo de la microscopía de fluorescencia (Figura 2). Mientras que las transcripciones de ARN individuales con sitios de unión tan sólo cuatro rbmb se pueden obtener imágenes en las células vivas, más sitios en la 3'-UTR vinculante rbmb, el la señal fluorescente fuerte. Por otra parte, los más RBMBs que están enlazados a cada transcrito más largo es el ARN se pueden visualizar antes de que se pierda la señal debido a fotoblanqueo. En este protocolo, el ARN fue diseñada para contener repeticiones de 96 en tándem de la secuencia diana rbmb en la 3'-UTR. La adquisición de imágenes de transmisión permite que las transcripciones de ARN individuales para obtener imágenes en tiempo real (vídeo 1). Individuales transcripciones de ARN pueden ser fácilmente vistos moviéndose dentro del citoplasma y núcleo of las células. Si bien la mayoría de los lugares parecen sufrir movimientos browniano o sub-difusivos, en casos raros un ARN de someterse transporte dirigido se observará (Movie 2). Tesis transcritos de ARN típicamente se mueven rápidamente a lo largo de una trayectoria recta (Figura 3); Sin embargo, algunos ARN no siga trayectorias curvas o hacer cambios bruscos de dirección. Estos movimientos están en marcado contraste con los movimientos browniano, que son de naturaleza aleatoria y presentan pequeños desplazamientos generales dentro de los breves plazos adquiridos aquí (es decir, <1 min). Los movimientos de ARN dirigidas son coherentes con el transporte de ARN a lo largo de los microtúbulos y microfilamentos. Estos experimentos indican que RBMBs proporcionan una herramienta versátil y robusto para obtener imágenes de los transcritos de ARN en las células vivas individuales.

Figura 1
Figura1. esquemática de RBMBs y la metodología de la imagen utilizado transcritos de ARN en las células vivas individuales. A) RBMBs en presencia y en ausencia de ARN diana complementario. En ausencia o ARN diana, la fluorescencia rbmb se apaga. En presencia de ARN diana, la fluorescencia rbmb se restaura. B) Múltiples RBMBs unen cada transcripción de ARN crear una mancha fluorescente brillante que puede ser detectado por microscopía de fluorescencia de campo amplio. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. imagen representativa de células HT1080 que expresan establemente ARN con A) 96 repeticiones en tándem o B) 4 repeticiones en tándem del sitio de unión en rbmbla 3'-UTR, tras la administración intracelular de RBMBs. La presencia de repeticiones en tándem de 96 permite que los transcritos de ARN individuales aparecen como puntos fluorescentes brillantes. ARN que contiene sólo 4 repeticiones en tándem también se puede visualizar, pero la intensidad de las manchas fluorescentes es muy tenue y con frecuencia sólo detectable en las zonas de fondo excepcionalmente bajo. El pequeño número de manchas particularmente brillantes corresponde al ARN que no se mueve. Barra de escala:. 10 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3 Montaje de un transcrito de ARN transportados dirigida. La trayectoria de la transcripción se muestra en el panel de más a la izquierda. La trayectoria se superpone sobre una sola frame de la serie temporal. Barra de escala:. 2,5 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 1. película Representante de células HT1080 que expresan establemente ARN con repeticiones en tándem de 96-el sitio de unión rbmb en la 3'-UTR, tras la administración intracelular de RBMBs. Individuales transcritos de ARN aparecen como puntos fluorescentes brillantes. Barra de escala:. 10 m Haga clic aquí para ver el video.

Movie 2. película Representante de una transcripción de ARN de someterse transporte dirigido. Barra de escala:. 10 m Haga clic aquí para ver el video.

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Discussion

La capacidad de las transcripciones de ARN de ingeniería imagen individuales en las células vivas usando un microscopio de campo amplio convencional requiere una señal fluorescente brillante y fotoestable de estar asociado con cada una transcripción de ARN y un fondo fluorescente bajo que emana de sondas fluorescentes no unidos. En este método, una señal fluorescente brillante se logra mediante la hibridación de múltiples (hasta 96) sondas fluorescentes basados ​​en oligonucleótidos, es decir, RBMBs, en cada transcrito de ARN. Sin embargo, tan sólo cuatro sitios de enlaces son suficientes 16. Las señales colectivos como resultado una mancha fluorescente brillante que puede rastreado en tiempo real. La presencia de múltiples sondas también permite tiempos más largos de formación de imágenes, ya que una fracción sustancial de los colorantes fluorescentes se debe photobleached antes de que se pierde la señal colectiva. Se prevé que esta técnica proporcionará visión única de la biología ARN y permitir el estudio de una amplia gama de comportamientos de ARN que van desde la medición ªe respuesta de la trata de ARN a diversos estímulos externos, observando los patrones de localización subcelular únicas de ARN objetivo, estudiar el destino y la duración de ARN, y proporcionando información sobre la regulación de ARN. Además, puede ser posible para seguir los cambios (es decir, arriba y abajo de la regulación) en la expresión de ARN. Aunque esta capacidad aún no ha sido validado, hemos demostrado previamente que el número de copias de ARN se puede cuantificar con bastante precisión para un máximo de 24 h en células vivas 22. Además, RBMBs no parecen afectar el nivel de expresión génica. En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia inicial de que los cambios en la expresión génica durante este período fueron rastreados con precisión, en una base de celda por celda, y que RBMBs no condujo a un aumento en la estabilidad del ARN o ralentizado la degradación del ARN. Sin embargo, no está claro en qué medida la expresión del gen cambia realmente durante este tiempo en todo caso.

En general, esespera que cualquier aumento en la expresión génica se identifica fácilmente; debido a la abundancia de rbmb no unida en la celda que es libre de unirse transcripciones recién formadas. Sin embargo, lo que es menos claro es cómo RBMBs disocian de ARN durante la traducción y de la degradación y si hay algún desfase entre la expresión del ARN / degradación y la formación de imágenes de estas transcripciones. Todavía se requieren estudios adicionales para comprender mejor rendimiento rbmb en estos escenarios.

Varios enfoques alternativos a las imágenes transcritos de ARN individuales se han reportado previamente. Los primeros estudios incluyeron el etiquetado fluorescente aislados transcripciones de ARN y la re-introducción de estas transcripciones en las células, por lo general mediante microinyección 23,24. La relación señal-fondo de este enfoque es muy alta, debido a la capacidad de quitar cualquier tintes fluorescentes no consolidados, pero hay preocupaciones sobre si el comportamiento observado ARN representa con precisión truprocesamiento del ARN e. La solución más común a esta deficiencia ha participado transgenes de ingeniería con repeticiones en tándem en la 3'-UTR que se pueden unir por un reportero fluorescente, de forma análoga al enfoque rbmb que aquí se presenta. Reporteros fluorescentes anteriores han incluido pequeñas moléculas que sólo emiten fluorescencia tras la unión aptámeros de ARN, comúnmente conocida como la espinaca 25, y GFP. Espinaca aún no se ha utilizado para la formación de imágenes transcritos de ARN individuales, pero se ha utilizado para la expresión de la imagen global. En contraste, GFP se ha utilizado para la imagen con éxito los transcritos de ARN individuales. En este enfoque, un reportero GFP se fusiona a la proteína de cubierta de MS2 fago bacteriano (GFP-MS2) y se une a un ARN de ingeniería construir con repeticiones en tándem del sitio de unión MS2 en la 3'-UTR 2,10. Si bien este enfoque es muy similar al enfoque descrito aquí, RBMBs ofrecen varias ventajas. Por ejemplo, RBMBs permiten fluoróforos orgánicos que pueden usarse para formación de imágenes, que proporciona un amplio diversidad de opciones con fotoestabilidad superior y un brillo superior en comparación con las proteínas fluorescentes. Además, hay muchos fluoróforos orgánicos comercialmente disponibles que emiten en el extremo de infrarrojo cercano. La ventaja de elegir los colorantes con espectros de emisión desplazadas al rojo se deriva de la autofluorescencia celular inferior observado en estas longitudes de onda. Dado que los altos niveles de autofluorescencia pueden ahogarse fácilmente cualquier señales fluorescentes asociados con la hibridación de ARN, la capacidad de reducir drásticamente la autofluorescencia proporciona un impulso importante en la relación señal a fondo. Otra ventaja importante del uso de RBMBs es que la señal de las sondas no unidas se apaga de manera significativa. Aunque, se han adoptado diversos enfoques para reducir la fluorescencia de fondo de GFP no unido en el enfoque de GFP-MS2, por ejemplo, el uso de señales de localización nuclear, el control de los niveles de expresión de GFP, GFP y dividir complementación 1,10,11,26,27, la presencia de un moie temple realdad en el diseño rbmb proporciona a los usuarios una mayor flexibilidad experimental. Por ejemplo, el enfoque rbmb es relativamente insensible a tanto el nivel relativo y total de la expresión de ARN y la concentración de la sonda. De hecho, los transcritos individuales se pueden obtener imágenes con concentraciones rbmb que abarcan un orden de magnitud. Las ventajas combinadas de más alta fotoestabilidad, la señal más brillante, y el fondo inferior hacen en tiempo real los experimentos de imagen de ARN con RBMBs mucho más accesibles para los usuarios de microscopía con experiencia limitada.

Quizás, la más notable desventaja del uso de sondas exógenos tales como RBMBs, en contraste con un reportero molecular tal como GFP, es la necesidad de la administración intracelular. Afortunadamente, un número de opciones existen, por ejemplo, la microinyección 28, 29 agentes de transfección, péptidos penetrantes de células 30, y estreptolisina O (SLO) 31. Personalmente, hemos encontrado que es microporaciónel amable y versátil opción más usuarios, por lo general resulta en> 95% de viabilidad y eficiencia de la entrega 21. Esto es probablemente porque el proceso de electroporación microlitro volumen exhibe una reducción en los muchos eventos nocivos asociados a menudo con la electroporación, incluyendo la generación de calor, metal disolución de iones, la variación del pH y la formación de óxido. Es importante destacar que, de microporos también es susceptible de alto rendimiento estudios, ya que RBMBs pueden ser entregados en> 100.000 células en un solo experimento.

A pesar de las muchas ventajas de utilizar RBMBs a ARN imagen localización y el movimiento en las células vivas, una serie de limitaciones y retos que aún permanecen. Tal vez, el mayor desafío es la incapacidad para realizar un seguimiento de ARN durante más de unos minutos bajo una exposición continua. Esto es una consecuencia tanto de photobleaching y la capacidad de ARN a moverse fuera del plano de formación de imágenes focal. Tintes brillantes y más fotoestables pueden ayudar alleviate tanto de estas deficiencias, al aumentar el número de veces que cada colorante se puede excitar y permitiendo que los puntos fluorescentes discretos en ser fotografiado a mayores distancias del plano focal. Un enfoque prometedor para aumentar la fotoestabilidad implica el uso de colorantes de autocuración, que utilizan-estado triplete extintores en la proximidad del fluoróforo orgánico para extender su vida útil 32. Otra opción puede ser el uso de polímeros conjugados fluorescentes de amplificación, que se componen de un gran número de fluoróforos conectados que no lo hacen auto-enfriamiento rápido. Estos polímeros pueden ser muchas veces más brillante que los fluoróforos orgánicos individuales y aún así ser apagado de manera eficiente por un solo resto atenuador 33,34; Sin embargo, todavía es necesario seguir trabajando en este ámbito. Cabe señalar que la imagen intermitente, con una velocidad de fotogramas> 1 cuadro por segundo, no se puede realizar a una única imagen de transcrito de ARN durante largos períodos de tiempo, ya que es difícil asegurar que es tél mismo transcrito de ARN está realizando un seguimiento de fotograma a fotograma. Por supuesto, la evaluación cuantitativa de la expresión génica a nivel de células individuales es todavía posible durante largos plazos, a través del recuento de manchas fluorescentes individuales en una base por célula 16,35,36. En este caso, no es necesario seguir la pista de los transcritos individuales. En general, se cree que RBMBs son capaces de proporcionar información importante sobre la función del ARN y permite la obtención de imágenes de los transcritos de ARN de ingeniería individuales con equipamiento convencional de microscopía y experiencia limitada.

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Disclosures

Dr. Mark Behlke y el Dr. Ling Huang son empleados de IDT que ofrece oligonucleótidos en venta similares a algunos de los compuestos descritos en el manuscrito. IDT es, sin embargo, no es una empresa que cotiza en bolsa y que personalmente no posee acciones / capital en IDT.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia Premio CARRERA (0953583) y el Instituto Nacional de Salud NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nuclease-free water Life Technologies AM9932 no DEPC-treated
DPBS Life Technologies 14190-144 No Ca2+ and Mg2+
Cary 100 UV-Vis spectrophotometer Agilent Technologies
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P284-500
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific S381-500
Microcentrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 ml
Chromatography column Kimble Chase Life Science 420400-0720 0.7 x 20 cm
Superdex 75 prep grade GE healthcare 17-1044-01
Syringe pump Braintree Scientific BS-300
Syringe BD 301035 60 ml, Luer-lok tip
Centrifugal filter units Millipore UFC501096 MW 10,000 cutoff
Centrifuge 5418 Eppendorf
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P7280-5MG lyophilized powder, g-irradiated
8-well chambered coverglass Fisher Scientific 155409 Working volume 0.2-0.5 ml
HT1080 ATCC CCL-121 Human Fibrosarcoma cell line
Cell culture flask Corning 430639 25 cm2
DMEM Life Technologies 11965084 High glucose
DMEM without phenol red Life Technologies 21063029 High glucose
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500ML
Penecillin/streptomycin Life Technologies 15140122
Trypsin Life Technologies 25300054 0.05% Trypsin-EDTA
Neon transfection system Life Technologies MPK5000
Neon transfection system kit Life Technologies MPK1096
Hemacytometer Fisher Scientific 02-671-10
Hoescht 33342 Life Technologies H1399
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus
SOLA light engine Lumencor
Metamorph Molecular Devices Software controlling microscope
Immersol oil 518F Fisher Scientific 12-624-66B

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References

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