A Step Beyond BRET: Fluorescens av Unbound Eksitasjon fra luminescens (drivstoff)

1Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, Imagopole, Institut Pasteur, 2Department of Radiation Oncology, Stanford School of Medicine, 3Service Hospitalier Frédéric Joliot, Institut d'Imagerie Biomédicale, 4Vanderbilt School of Medicine, 5The Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research, 6Unité INSERM U786, Institut Pasteur, 7Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur
Published 5/23/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Utvide grunnlaget og anvendbarhet av fluorescens ved Unbound Eksitasjon fra luminescens (drivstoff) med å kartlegge de relevante prinsipper og demonstrere sin kompatibilitet med en rekke fluoroforene og antistoff-målrettet forhold.

Cite this Article

Copy Citation

Dragavon, J., Sinow, C., Holland, A. D., Rekiki, A., Theodorou, I., Samson, C., et al. A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL). J. Vis. Exp. (87), e51549, doi:10.3791/51549 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fluorescens ved Unbound Eksitasjon fra luminescens (drivstoff) er et strålingspådriv eksitasjon-utslipp prosessen som produserer økt signal og kontrastoppladning in vitro og in vivo. DRIVSTOFF deler mange av de samme underliggende prinsipper som Bioluminesens Resonance Energy Transfer (BRET), men skiller seg mye i de akseptable arbeidsavstander mellom selvlysende kilde og fluorescerende enhet. Mens BRET er effektivt begrenses til maksimum to ganger Förster radius, vanligvis mindre enn 14 nm, kan FUEL oppstå ved avstander opp til mikrometer eller enda cm i fravær av en optisk absorber. Her vi utvide på grunnlaget og anvendbarhet av FUEL ved å gjennomgå de relevante prinsippene bak fenomenet og demonstrere sin kompatibilitet med et bredt utvalg av fluoroforene og fluorescerende nanopartikler. Videre er nytten av antistoff-målrettet FUEL utforsket. De som er vist her eksempler gir bevis for at FUEL kan utnyttes for Applications der BRET ikke er mulig, fylle den romlige tomrommet som eksisterer mellom BRET og tradisjonelle hele dyr bildebehandling.

Introduction

Genmodifisering av organismer, som virus 1, 2, bakterier tre, eller små pattedyr fire til enten indusere eller konstitutivt uttrykte Bioluminescens, har vært svært vellykket, og mye viste 5-7. Bioluminescence, en in vivo kjemiluminescerende reaksjon som involverer naturlig forekommende reagenser, har fordelen av å produsere lys uten bruk av en ekstern lyskilde. Som sådan, bioluminescent avbildning ikke lider av de vanligste ulemper ved auto-og ikke-spesifikt signal ble funnet fra fluorescens-avbildning 8.. Følgelig har bioluminescens et betydelig signal-til-støy-forhold, siden en hvilken som helst detektert signal stammer utelukkende fra den tiltenkte kilden. Mens mange modeller har utnyttet lux operon fra Photorhabdus luminescens (maksimal emisjon sentrert mellom 480 og 490 nm) for in vitro-og in vivo-applikasjoner 9, dens bruk i små mammals har vært problematisk på grunn av selve innholdet av imaging forhold; pervading eksistensen av optiske absorbenter, slik som hemoglobin, og spredningsmidler, så som vev og bein, sterkt påvirker blå til gul 3 bølgelengder. Ekspresjon av en konstruert ildflue luciferase (maksimum emisjon ved 617nm) er nylig blitt utviklet og tatt, noe som gir et verktøy som i stor grad overvinner optisk absorpsjon 10, men er fremdeles gjenstand for spredningseffekter.

Som svar, har det vært flere forsøk på å rød-skifte den slippes ut signalet til den optiske vinduet på 650-900 nm, en region av minimert absorpsjon og scatter, bruker Bioluminescens resonans energioverføring (BRET) 11-13. Som et verktøy for å forbedre signaldeteksjon, Bret, som bruker en bioluminescent kilde som donor og en tilleggs fluoroforen som akseptor, har funnet begrenset suksess. Som en banebrytende eksempel på dette fenomenet, "selvlysende kvanteprikker4; (SIQDs) 14 består av modifisert Renilla reniformis luciferases bundet til den eksterne polymer-lysin lag av kommersielt tilgjengelig kvanteprikker (QDs). Ved substrat tillegg induserer den resulterende bioluminescent reaksjons fluorescensemisjon fra QDs, genererer en betydelig produksjon av røde fotoner. Imidlertid har disse SIQDs begrenset anvendbarhet for in vivo synliggjøring av fysiologisk relevante arrangementer. Denne begrensede anvendbarhet er sannsynlig på grunn av vanskeligheten med å knytte den doble probe til organet, cellen eller genet av interesse, ettersom de SIQDs ikke kan genetisk kodet og vil derfor kreve en sekundær modifisering av polymer-skall. For å forbedre deres anvendbarhet, alternative SIQDs, hvor luciferases er bundet direkte til den luminescerende kjernen, har nylig blitt benyttet 15. Bygge ut av SIQD konseptet, ble et mer aktuelt BRET system oppnådd ved å koble Cypridina luciferase til en idocyanine fargestoff 16, som var i stand til spesifikt rettet mot tumorer i mus mens produsere en betydelig red overgangen fra 460 nm til 675 nm. For å gjennomgå en ikke-strålingsenergi-overføring, slik Bret de samme primære begrensninger som den fluoriserende motstykke: det må være en sterk spektral overlapping mellom donor-og akseptor-utslipp magnetisering spektra og arbeidsavstanden mellom de to molekyldelene må være i størrelsesorden av Förster radius (5-14 nm, avhengig av donor-akseptor-par, med en effektiv maksimal avstand på to ganger Förster radius 17). Denne avstanden avhengighet i stor grad begrenser hvilke typer hendelser som kan observeres ved hjelp BRET som et middel til å forbedre gjenkjenning.

Nylig ble en ny tilnærming ble identifisert og demonstrert under både in vitro og in vivo-betingelser. Bygging av grunnlaget for BRET, fluorescens etter Unbound Eksitasjon fra luminescens (FUEL) 18, 19 Escherichia coli uttrykker lux operon og QDs 18, 19. Mens eksperimentelt lik SIQDs, eksisterer det en fundamental forskjell: i FUEL, er det ikke nødvendig for den luminescerende kilden for å være fysisk bundet til fluoroforen, som tillater for genetisk koding av selvlysende sonde. På grunn av den vellykkede påvisning av FUEL mellom selvlysende bakterier og QDs, er det mulig at denne teknikken kan brukes til både overfladisk (huden) og dype vev (lunge, lever) infeksjoner som Staphylococcus aureus og Klebsiellia pneumoniae.

Siden rapporten fra sin eksperimentelle betydning, har FUEL utviklet seg til å omfatte en robust matematisk modell 20 som kan brukes til å forutsi akseptable selvlysende og fluorescerende par, og dets anvendelser er utvidet til å omfatte anvendelse i identifikasjon av photophysical egenskaper som kvanteutbytte. Vi beskriver nedenfor noen av de grunnleggende teknikkene for drivstoff. Først viser vi bevis for dette fenomen over både korte (mikrometer) og lang (cm) arbeider avstander, som fundamentalt skiller FUEL fra BRET. For det andre, vi ekspandere på de mulige FUEL parene ved å undersøke en rekke fluoroforer og fluorescerende nanopartikler. Third, er drivstoff applikasjoner undersøkt ved å sammenligne målrettede og ikke-målrettede FUEL parene.

Protocol

En. Reagenser

  1. Kjøpe eller utvikle selvlysende bakterier og egnede vekstmedium som endret Escherichia coli uttrykker lux ABCDE 21, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22.
  2. Forbered fysiologisk saltvann (0,9% NaCl) og kulturmedie løsninger i henhold til standard-oppskrifter. E. coli og K. pneumoniae ble dyrket i Luria Bertani (LB) ved 37 ° C, og V. fischeri og Photobacterium sp i LB supplert med 0,5 M NaCl ved 22 ° C.
  3. Kjøpe eller skaffe fluorescerende prober som Q-tracker 705 (40 nm diameter, referert til som QD705), Q-tracker 800 (40 nm diameter, referert til som QD800), lysrør (40 nm diameter) og ikke-fluorescerende polystyren sfærer ( 48 nm diameter) og konvensjonelle fluorescerende fargestoffer.
  4. Klargjør de nødvendige reagenser for bakteriell merking.
  5. Sikre tilgang tilet helt dyr Bioluminescens kamera, slik som et IVIS spektrum, som er i stand til å detektere signaler i henhold til et bredt spekter av utslippsbølgelengder og eksponeringstider. En plate leseren i stand til bioluminesens målingene vil være tilstrekkelig for de fleste av forsøkene beskrevet her.

2. Basic Recapitulation av FUEL

  1. Starter fra enkelte kolonier på standard kultur plater, starter over natten kulturer av selvlysende bakterier. Her, V. fischeri ble brukt.
  2. Dagen for eksperimentering, initiere nye subkulturer og tillate dem å utvikle seg til en OD 600 på 1-1,5 oppnås. For å kunne gi sammenlignbare resultater er det best å bruke bakterier i lignende veksttilstander hvor de produserer intense signaler. Dette kan sikres ved å holde OD 600 konstant.
  3. Kombiner porsjoner av 100 mL fra hver med enten 5 mL av QD705 eller fysiologisk saltvann (PS), og deretter legge til 895 mL av PS til standard spektroskopiske kyvetter. Plasser de fylte kyvetter inn i IVIS Spectrum og ta målinger under riktig filter sett. Her ble 710 til 730 nm emisjonsfilter benyttes.

Tre. FUEL Over varierende avstander

  1. Fyll to redusert volum (1 ml) av plast fotometriske kyvetter med enten 50 pl QD705 eller 97,2 pl av ikke-fluorescerende 48 nm polystyren-mikrosfærer i et totalt volum på 1 ml PS. Dette sikrer lignende faststoff flateareal pr totalvolum mellom de to enhetene.
  2. Tilbered en lyskilde kyvette ved å kapsle inn et tredje kyvette med standard svart tape eller annet ugjennomsiktig materiale i stand til å blokkere lys. Nøye forberede to identiske optiske vinduer på hver sin side av kyvetten.
  3. Plasser de tidligere fylte kyvetter direkte på hver side av lyskilden kyvetten. Legg en 1 ml delmengde av V. fischeri eller annen kultur (dvs. selvlysende E. coli eller Photobacterium sp) fra en fersk subkultur til lyskilden kyvetten og dekke den med et ugjennomsiktig materiale, slik som sort papir for å redusere eventuelle lette forurensninger.
  4. Visualisere de tre kyvetter under riktig emisjonsfiltre som Total Lys og 710-730 nm emisjonsfiltre, med eksponeringstider på 10, 30, og 30 sek, henholdsvis.
  5. Omplassere både eksterne kyvetter på tilsvarende lengre avstander fra det sentrale kyvette, og deretter visualisere igjen. Gjenta til en endelig ansikt-til-ansikt-(central til redusert volum kyvette) avstand på 3 cm oppnås. På hvert trinn, skaffe seg en fluorescens bilde (450-480 nm eksitasjon, 710-730 nm utslipp) for å validere QD705 plassering.

4. Gransker Potensielle FUEL Pairs

  1. Fyll to reduserte volum kyvetter med 1 ml oppløsninger inneholdende enten en fluorofor eller et fluorescerende nanopartikkel av interesse i en og PS eller PS med ikke-fluoriserende nanopartikler som negativ kontroll i det andre. I the arbeid demonstrert her, en rekke potensielle kommersielt tilgjengelige FUEL fluoroforene og fluorescerende nanopartikler ble undersøkt som beskrevet i tabell 1.
  2. Til en 1 ml aliquot av frisk V. fischeri eller andre selvlysende bakterier til en mørk tredje kyvette inneholder to fysisk like optiske vinduer som ligger på hver sin side. Dekk til kyvetten med en opak substans, for eksempel et stykke sort papir.
  3. På et kort, men lik avstand sted de to redusert volum kyvetter på hver side av den mørk kyvette og visual under egnede filtre. Her ble en avstand på 0,7 cm anvendes. Gjenta med de andre fluorophores

5. Målrettet FUEL

  1. Forbered biotinylerte antistoffer som er spesifikke for de selvlysende bakterier. For eksempel, her primære antistoffer som er spesifikke for K. pneumoniae (α-Kp) ble biotinylert ved bruk av en oppløsning inneholdende EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin. Fjern overskuddet av reagens fra antistoffer ved hjelp av avsalting kolonner i henhold til sentrifugering (1500 x g) i 2 min.
  2. Bruk en standard Bradford assay for å bestemme proteinkonsentrasjonen og bestemme graden av antistoff biotinylering av HABA-analysen.
  3. Skaff α-Kp-biot biotinylert antistoff (AB) batcher ved å blande 100 ul (10 mM, oppløst i 1 x PBS) med 40 pl α-Kp-antistoff, noe som resulterer i en endelig grad av substitusjon av 16 biotin-rester per Ab og en avslutt proteinkonsentrasjon på 10 mg ml-1.
  4. Ved hjelp av flere over natten replikere kulturer, rettet mot de vaskede bakterier med de nevnte antistoffer etter den aktuelle protokoll.
    1. Nærmere bestemt, vaske K. pneumoniae i 1x PBS, og resuspender i 1x PBS til en OD av fire (ca. 4 x 10 8 CFU ml -1 OD -1).
    2. For hver replikere, inkuber 100 mL PBS, α -Kp antistoff (10 ul α-Kp-biotB eller 10 ul PBS for kontrollgruppen) og 100 ul celler i 90 min ved 30 ° C. Vask cellene tre ganger i 1x PBS, og resuspender i 196 mL PBS.
  5. Merke celler med QD705 streptavidin konjugat og dele dem inn i to tilsvarende volumer.
  6. Vask en oppløsning tre ganger, og deretter resuspendere det i det riktige volum.
  7. Fordel 100 pl av den vaskede og uvaskede løsninger i individuelle brønner i en sort 96-brønners plate. Mål den resulterende luminescens under Total Light, 490-510 nm, og 710-730 nm filtre. Fluoroforen konsentrasjonen kan bestemmes ved hjelp av 450-480 nm eksitasjon og 710-730 nm utslipp.

Representative Results

Resonance Energy Transfer (RET) er en ikke-strålingen interaksjon mellom et luminescerende donor og en fluorescerende akseptor, hvorved energi fra gått ut donor er i stand til å indusere en fluorescens svar fra akseptor gjennom en sterk dipol-dipol-interaksjoner 13.. RET, som har blitt beskrevet ved hjelp av fluorescerende 23, kjemiluminescerende 24 og bioluminescent 13 donorer, krever i hovedsak: en Strong spektral overlapping mellom donor-utslipp og accepter eksitasjon spektra;. 2 Passende rotasjons justering mellom de to enhetene.; og 3.. En arbeidsavstanden ikke er større enn 0,5 til 2-ganger Förster radius, R, 0, mellom donor-og akseptor 17. Som kontrast til RET, oppstår FUEL når et luminescerende kilde, for eksempel en bioluminescent bakterier, avgir et foton som absorberes og re-emitteres av en andre enhet, slik som en fluorofor eller en fluoriserende nanopartikler, røde forskyve utslipps spectrum av den opprinnelige luminescerende kilden. Dermed følger FUEL en standard eksitasjon-emisjonsprosessen beslektet med standard epifluorescent betingelser, men uten anvendelse av en fokusert eksitasjon. Bevis på dette kan lett observeres ved enkel blanding av luminescerende bakterier og svært fluorescerende kvante prikker. I nærvær av Vibrio sp, blir en betydelig økning i rødt signal observert når QD705 var også i løsning sammenlignet med en ikke-fluoriserende polystyren mikrosfære-kontroll (figur 1A). De deler som er nødvendige for å opprette bioluminescens, i hovedsak aldehydet substrat, luciferase, og ATP, er alle fremstilt og inneholdt i cytoplasma. Videre skjer den enzymatiske luminoforen produksjon innenfor den bakterielle cytoplasmaet (figur 1B). Som det har blitt rapportert andre steder, er avstanden mellom det indre og ytre membran av bakterier typisk større enn 30 nm 25 til 27, en avstand som ikke tillater vesentlig RETkan utføres. I tillegg, har de fluoriserende nanopartikler er ikke komme inn i det bakterielle cytoplasmaet, siden det ikke er noen endocytose eller andre midler for opptak. Sammen utgjør disse begrensningene indikerer at FUEL er den dominerende eksitasjon-utslipp fenomen som oppstår når selvlysende bakterier er blandet med fluorescerende nanopartikler.

Slik det tidligere er vist, foreligger FUEL utenfor rekkevidden av RET. For å undersøke FUEL avhengighet av avstanden, kan standard redusert volum spektrofotometriske kyvetter brukes, med en som inneholder en fluorofor-løsning, en annen inneholdende en passende kontroll som kan kontrollere for spredning, og den tredje inneholder en porsjon av frisk luminescerende løsning. Det er viktig at den sentrale kyvette bli innhyllet ved hjelp av svart bånd eller annet ugjennomsiktig materiale, lagre for minst to identiske optiske vinduer plassert på motsatte sider, for å redusere eventuelle lette forurensninger fra den luminescerende kilden. Videre er de to resterende kyvetter måvære plassert i like avstander på hver side av den sentrale kyvette. Til slutt, en frisk luminescerende løsning, ved hjelp av bakterier eller kjemiluminescens, bør benyttes med hvert eksperiment for å sikre maksimal lys-produksjon. Ved riktig plassering, erverve luminescence signalet under de ønskede filtre. Total-Lys og 710-730 nm filter ble brukt i dette tilfelle, selv om det bare data fra den sistnevnte er vist. Etter hvert kjøp, øke gradvis ansikt-til-ansikt avstand fra 1,0 cm til 3 cm (figur 2). Til slutt, normalisere alle data til det lyseste punktet. I eksemplene er brukt her, dette skjedde ved den korteste avstanden (D = 1 cm) mellom det luminescerende kilden og kyvetten inneholder QD705. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan levedyktig FUEL signal observeres opp til den endelige oppkjøpet som tyder på at, i fravær av en optisk absorber, kan FUEL oppstå på avstander utover enhver mulig resonans energioverføring og kan bare forklares å være et rent strålingeneffekt. Montering av data avslører en reduksjon av signal som en funksjon av avstanden D følge en D -1 til D -2 avhengighet. Avhengig av den geometriske konfigurasjon, de tidligere tilsvarer kondensatoren avstand avhengighet og den sistnevnte til den kvadrert for punktkilder. Dette resultatet er derfor i samsvar med den samlede anskaffelses oppsett, gitt størrelsen på kyvetten åpningen og avstanden mellom den luminescerende kilden og fluoroforen.

FUEL gjelder ikke bare quantum prikker, men også kan observeres ved hjelp av en lang rekke fluoroforer som strekker seg fra den Alexa serie til fluorescerende mikrosfærer (tabell 2). For å kunne sammenlignes med kontroll, bør like konsentrasjoner av de forskjellige fluoroforer brukes, og det totale overflateareal av nanopartikler holdt konstant (Tabell 1). Ved å sammenligne de fluoroforer og nanopartikler til sine riktige kontroller (PS eller PS med ikke-fluorescerendepolystyren-mikrokuler), blir en betydelig økning i signal observert ved utslipp maksimalt hver fluorescerende enhet. Den største relative økning i signal ble funnet å forekomme hvor fluorescensemisjonen maksimum var lengst fra den luminescerende utslipps maksimum. Dette er mest sannsynlig på grunn av økt spesifisitet av det fluorescerende signal i forhold til den brede emisjonsspektrum fra den luminescerende kilden. Tvert imot, er den minst pålitelige FUEL signal funnet ved de to utslipps maxima ikke var godt separert. Interessant nok var en merkbar FUEL signal funnet med den gule sfærer selv om den spektrale forskjellen er minimal, skyldes mest sannsynlig til den betydelige mengden av Fluoroforen stede per perle (350 fluoriscerende ekvivalenter). De vises her Resultatene indikerer at under passende betingelser FUEL kan oppnås med en rekke fluoroforer, som muliggjør tilpasning av prober som er valgt for mer relevante anvendelser under både in vitro og in vivo-betingelser. Betydningen av den observerte FUEL signal ble bestemt ved anvendelse av en standard to-tailed Student t-test. Som sådan, ble bare Alexa555 funnet å være uforenlig med selvlysende kilde som brukes.

For å undersøke effekten av målretting på drivstoff, ble biotinylerte antistoffer brukes til å målrette selvlysende bakterier og streptavidin-linked QDs. Det er viktig at bakteriene eller luminescens kilde gi et lag tykt nok til å minimalisere muligheten for RET mellom luminoforen og den tilsvarende fluoroforen. Etter inkubering og vasking for å fjerne ubundet antistoff, er biotin-merkede bakterier så eksponert for enten streptavidin-konjugert QD705 eller ikke-funksjonalisert QD705 som kontroll, de løsninger som er delt og ett sett utsatt for ytterligere vaskinger for å fjerne eventuelle ikke-holdt QD705. Her, for alle fire forholdene ble den resulterende luminescens observert under Total Light, 490-510 nm, end 710-730 nm filtre, men bare de to sistnevnte filtrene brukes for dataanalyse. Tilstedeværelsen av QD705 ble sammenlignet ved hjelp av 450-480 nm eksitasjon og 710-730 nm emisjonsfiltre. Ved undersøkelse er det funnet liten eller ingen forskjell i red-forskjøvet signal når løsningene ble etterlatt i en uvasket tilstand (fig. 3). Den resulterende fluorescens-signalet under slike forhold er også funnet å være ganske like, noe som tyder på at et likt antall QD705 var tilstede under både den målrettede og ikke-målrettet tilstand. Imidlertid vasking av prøvene for å fjerne eventuelt ubundet QD705 gir en nesten to ganger økning i relativ rødt signal for målrettede bakterier sammenlignet med sine ikke-målrettet kontroll. Undersøkelse av fluorescens kan benyttes til å bekrefte tilstedeværelse eller fravær av den QD705. Relativt, resulterte den målrettede vasket tilstand i et fluorescens-intensitet som var nesten tre ganger mindre enn den uvaskete tilstand, men den resulterende rød-skift redusert med bare30%, noe som tyder på at under utelukkende bundet betingelser målretting av bakterier vil resultere i en økning i rødt forskjøvet emisjons. Dette impliserer sterkt nytten av målrettet FUEL for fremtidige søknader.

Figur 1
Figur 1. A FUEL interaksjon mellom luminescerende bakterie og kommersielt tilgjengelige kvanteprikker fører til en økning i rødt fotonproduksjon. To spektrofotometriske kuvetter ble fylt med oppløsninger inneholdende 100 mL alikvoter av frisk V. fischeri kultur med en OD 600 på 1-1,5, 895 mL av PS, og enten 5 mL av QD705 eller fysiologisk saltvann (PS), før det blir satt inn en IVIS Spectrum og utslipp spektrumet. En betydelig økning i rødt signal oppnås på grunn av tilstedeværelsen avden QD705, som kan noteres av økningen i oppdagede fotoner • sek -1 • cm -2 (p • sek -1 • cm -2) sammenlignet med kontrollgruppen under 710-730 nm utslipp filter (A). Her, den doble membran av bakterier utelukker samspillet av de selvlysende moieties (blå sirkler) og QD705 (svarte sirkler). Den tidligere finnes bare i det bakterielle cytoplasmaet mens de sistnevnte fritt fordelt i bulkløsning (B). N = 3 for hver bakteriell løsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 2
Figur 2. Bevis på FUEL fore over avstander kompletely unntatt resonans energioverføring. Spektrofotometriske kuvetter ble fylt med oppløsninger inneholdende enten 50 ul av QD705 og 950 pl fysiologisk saltvann (PS) eller 97,2 pl av ikke-fluorescerende 48 nm polystyren-mikrokuler og 902,8 ul av PS, og plassert med innbyrdes samme avstand på motsatte sider av en sentral svart kyvette inneholder en ml fersk selvlysende Photobacterium sp på en OD 600 på 1-1,5. Den sentrale kyvette hadde to identiske optiske vinduer slik at de slippes ut fotoner å fritt spre. Anskaffelse av bilder med avstander (D) som strekker seg fra 1,0 cm til 3 cm, det observert produksjon av rødt lys ble redusert som en funksjon av avstanden som viser bevis på at drivstoffet kan skje på avstander ikke er oppnåelige ved resonans energioverføring. Intensiteten syntes å ha D -2 avhengighet, lik den kvadrert (til venstre). Den samme protokollen ble fulgt for E. coli (høyre). De resulterende trendlinjer holder skjema til begrepet that bakteriene opptrer som punktkilder for lys. I alt tre uavhengige avstandsmålinger ble kjøpt med hver bruker et unikt subkultur. Feilfelt er til stede på hvert punkt. I noen tilfeller feilfeltene var mindre enn symbolene som indikerer normalisert intensitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. En sammenligning mellom målrettet (spesifikk) og ikke-målrettet (bulkløsning) BRENSEL. K. pneumoniae ble funksjonalisert med biotinylerte antistoffer og deretter utsettes for enten streptavidin-merket (Målrettet) eller ikke-merket (ikke-målrettet) QD705. De resulterende løsninger ble like utbytteded og ett sett vasket tre ganger med PBS før de ble resuspendert i sin opprinnelige volum i PBS. Oppløsningene ble deretter fordelt i individuelle brønner i en sort 96-brønners plate og Bioluminescens observert under 490-510 nm (500 nm) og 710-730 nm (720 nm) emisjonsfiltre (indikert som Søylene). Den p • sek -1 • cm -2 funnet fra 720 nm filter for hver brønn ble normalisert med det respektive p • sek -1 • cm -2 Bioluminescens intensiteten fra 500 nm på samme brønn. Den relative fluorescens intensitet som følge av en epifluorescent eksitasjon ble bestemt ved hjelp av 450-480 nm eksitasjon og 710-730 nm emisjonsfiltre (angitt som røde søyler). Lite eller ingen forskjell i selvlysende eller fluorescerende signal ble observert under uvaskede forhold (ikke-målrettede Uvasket og målrettet Uvasket). Dette tyder på at det bundne og frittflytende QD705 var like begeistret av selvlysende fotoner. Ved vasking, ntidlig en to-fold forskjell i forhold rødt signal ble observert for de QD705-merket bakterier (Målrettet vasket) sammenlignet med kontrollgruppen (Non-Målrettet Vasket). Fraværet av QD705 i Non-Målrettet Vasket ble bekreftet av mangel på fluorescerende signal og verifisert QD705 merking i Målrettet Vasket tilstand. Dataene er fra fire uavhengige kulturer av K. pneumoniae. For klarhet, indikerer legenden kilden til QD705 eksitasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

width: 108px; "> Alexa 700 høyde: 22px; width: 108px; "> QD800
Fluoroforen Konsentrasjon mL PS (mL) λ maks ex / em (nm) Emission Filter (n m)
Alexa 555 37,2 mikrometer 4.77 995,23 555/565 570-590
Alexa 568 37,2 mikrometer 4.77 995,23 578/603 590-610
Alexa 633 37,2 mikrometer 4.77 995,23 632/637 650-670
37,2 mikrometer 4.77 995,23 702/723 710-730
Nonfluorescent 2,62% tørrstoff 9.72 990,28
μSph Pink 5% faststoff 4.77 995,23 580/605 610-630
μSph Gul 5% faststoff 4.77 995,23 505/515 510-530
QD705 2 mikrometer 5 995 465/705 710-730
2 mikrometer 5 995 465/705 790-810

Tabell 1. Egenskaper av fluoroforene brukes i hele drivstoffet demonstrasjoner.

<td> 6.05 x 10 4
Kontroll filter fluoroforen Kontroll p-verdi
p · sek -1 · cm -2 SD p · sek -1 · cm -2 SD
A555 PS 580 1,08 x 10 7 3,31 x 10 6 9,09 x 10 6 1,75 x 10 6 0.233
A568 PS 600 8,47 x 10 6 4,23 x 10 6 4,49 x 10 6 9,71 x 10 5 0.094
A633 PS 660 2,40 x 10 6 1,25 x 10 6 7,85 x 10 5 2,39 x 10 5 0.046
A700 PS 720 5,53 x 10 5 2,46 x 10 5 1,54 x 10 5 0.026
MSph Gul ikke-fluorescerende μspheres 520 1.19 x 10 8 4,85 x 10 7 5,79 x 10 7 1,99 x 10 7 0.057
MSph Pink ikke-fluorescerende μspheres 620 2,37 x 10 7 1,36 x 10 7 2,16 x 10 6 8,00 x 10 5 0.026
QD705 ikke-fluorescerende μspheres 720 1,76 x 10 7 7.33 x 10 6 2,08 x 10 5 7.16 x 10 4 0.007
QD800 ikke-fluorescerende μspheres 800 7,79 x 10 6 4.72 x 10 6 3.60 x 10 4 1.52 x 10 4 0.023

Tabell 2. Identifikasjon av fluoroforene og fluorescerende nanopartikler som er kompatible med FUEL.

Discussion

Den grunnleggende demonstrasjon av FUEL kan oppnås bare ved å blande selvlysende bakterier med fluorescerende nanopartikler eller QDs. De to enhetene vil være fysisk atskilt og forbli hinsides enhver effektiv RET avstand. Vanskeligere er det FUEL signal optimalisering både in vitro og in vivo. Under in vitro-betingelser, både med og uten en optisk absorber tilstede, som regel tilsetning av overskudd av fluoroforen vil være tilstrekkelig til å maksimalisere FUEL respons. Men ved høye konsentrasjoner fenomener som statisk eller collisional bråkjøling kan føre til et tap av fluoriserende signal. Utføre en fortynningsrekke ved uavhengig å variere konsentrasjonen av det luminescerende kilden og fluoroforen vil bidra til å optimalisere de ønskede konsentrasjoner. Etablering og optimalisering av FUEL henhold in vivo konsentrasjoner er mye mer vanskelig og må tas opp på et sak-til-sak grunnlag. Det kan være vanskelig å skape en condition hvor den fluorescerende enhet kan nås optisk av det selvlysende kilde. Som sådan, kan begynner med direkte co-injeksjoner av de to moieties gi informasjon om hvor vellykket FUEL under optimale forhold.

Standard protokoller finnes for merking av bakterier og eukaryote celler med selvlysende enheter som Alexa serien og QDs. Ofte krever dette overflaten funksjon eller aktivering med antistoffer, som kan føre til uønskede effekter som redusert celle levedyktighet eller endret metabolsk aktivitet. For å bøte på dette, er det viktig å fastslå den optimale mengde av antistoff eller aktiveringsmiddel som trengs som reduserer cellulære forstyrrelser samtidig maksimere det fluorescerende merking. Bruken av QDs er fordelaktig på grunn av deres karakteristiske brede eksitasjon spektra, smale og avstembar emisjonsspektra, og muligheten for en stor Stokes skift. Imidlertid kan QDs være cytotoksiske og kan ikke være ønskelig i enkelte tilfeller.

13 og kan anvendes på en rekke selvlysende og fluorescerende kilder. Fram til nå har de fotoner som følge av FUEL regnes som produkt av ikke-spesifikke interaksjoner eller en uheldig bakgrunn signal som følge av dårlig utformet BRET eksperimenter. Det er bare med typen av eksperimenter demonstrerte her at vi var i stand til å identifisere nytten av denne uønskede signal. I de viste eksemplene er luminescerende bakterie opptrer som en diffus eksitasjon kilde i stand til å utløse en standard fluoriserende respons fra en rekke forskjellige fluorescerende enheter. Videre, på grunn av den betydelige arbeidsavstand, er det trygt å konkludere med at selv FUEL kan konstrueres uten forekomst av Bret, generelt Bret ikke kan observeres uten bidrag fra BRENNSTOFF. Viktigere, på grunn av mangelen på en målsøkende krav, FUEL kan benyttes til å dekke den romlige gap som eksisterer mellom Bret og conventional hel-dyr avbildningsteknikker.

Disclosures

Forfatterne erklærer konkurrerende økonomiske interesser. JD, SB, KLR og SLS bidratt til European Patent EP10290158.4 og World Intellectual Property Organization patentsøknad WO/2011/117847.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å utvide sin takknemlighet for økonomisk støtte fra Pasteur Foundation of New York (til JD, CS, CS), EU-FP7 Program "Automation" (til SLS), Institut Carnot Program 11 (til JD, AH , AR, RT, SLS) og Prosjekt IMNOS (til RT, SLS), den Conny-Maeve Charitable Foundation (SLS), European Masters i Molecular Imaging (til IT), regionen Ile de France programmer MODEXA (SLS), Sesam (SLS) og DimMalInf (SLS, RT), ANR Program Grandes Invest de l'Avenir Infrastructures Nation no Biologie-Santé: Frankrike LifebioImaging (FLI) Frankrike Livet Imaging (RT, SLS), Frankrike Bioimaging (JD, SLS) og Institut Pasteur, Paris. Videre vil forfatterne takke, José Bengoechea og Herbert Schweizer for reagenser. Videre vil Forfatterne takke Cindy Fevre som genererte antistoffer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon  kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145  52145 is a serotype K2 reference strain
Luria Bertani (LB)  standard growth media
Q-Tracker 705  Life Sciences Q21061MP
Q-Tracker 800 Life Sciences Q21071MP
Alexa 555 Life Sciences S21381
Alexa 568 Life Sciences S11226
Alexa 633 Life Sciences S21375
Alexa 700 Life Sciences S21383
Non-fluorescent microspheres Polysciences, Inc 15913
Pink microspheres Life Sciences F8887 40 nm diameter
Yellow microspheres Life Sciences F8888 40 nm diameter
Ivis Spectrum PerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific Pierce 21425
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Scientific Pierce 21425
HABA assay kit  Thermo Scientific Pierce 28005
Bradford assay Bio-Rad 500-0201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, K., et al. A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer. J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).
  2. Contag, C. H., et al. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).
  3. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  4. Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).
  5. Condeelis, J., Weissleder, R. In Vivo Imaging in Cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. (2010).
  6. Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).
  7. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. 10, (2010).
  8. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).
  9. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. Luminescent probes and visualization of bioluminescence. Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).
  10. Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light. Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).
  11. Saito, K., et al. Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging. Nat Commun. 3, 1262 (2012).
  12. Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).
  13. Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. The BRET technology and its application to screening assays. Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).
  14. So, M. -K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).
  15. Wu, Q., Chu, M. Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes. Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).
  16. Wu, C., et al. In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).
  17. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
  18. Dragavon, J., et al. in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. 790210-790219 (2011).
  19. Dragavon, J., et al. In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).
  20. Holland, A. D., et al. In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer. Methods. (2013).
  21. Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).
  22. Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations. Infect Immun. 31, 71-77 (1981).
  23. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications. J Microsc. 247, 119-136 (2012).
  24. Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).
  25. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria. Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).
  26. Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles. Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).
  27. Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods. Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats