A Step Beyond BRET: Fluorescenza da Unbound eccitazione di luminescenza (FUEL)

1Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, Imagopole, Institut Pasteur, 2Department of Radiation Oncology, Stanford School of Medicine, 3Service Hospitalier Frédéric Joliot, Institut d'Imagerie Biomédicale, 4Vanderbilt School of Medicine, 5The Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research, 6Unité INSERM U786, Institut Pasteur, 7Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur
Published 5/23/2014
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Bioengineering
 

Summary

Ampliare la fondazione e l'applicabilità di fluorescenza da Unbound eccitazione da luminescenza (FUEL) attraverso la rilevazione dei principi rilevanti e dimostrando la sua compatibilità con un gran numero di fluorofori e condizioni di anticorpi mirati.

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Dragavon, J., Sinow, C., Holland, A. D., Rekiki, A., Theodorou, I., Samson, C., et al. A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL). J. Vis. Exp. (87), e51549, doi:10.3791/51549 (2014).

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Abstract

Fluorescenza da Unbound eccitazione da luminescenza (FUEL) è un processo di eccitazione-emissione radiativa che produce un aumento del segnale e contrast enhancement in vitro e in vivo. Condivide COMBUSTIBILE molti dei principi sottesi al trasferimento bioluminescenza Resonance Energy (BRET), ma differiscono notevolmente nelle distanze di lavoro accettabili tra la sorgente luminescenti e l'entità fluorescente. Mentre BRET è efficacemente limitato ad un massimo di 2 volte il raggio Förster, comunemente inferiore a 14 nm, CARBURANTE può verificarsi a distanze fino a pm o addirittura cm in assenza di un assorbitore ottico. Qui ci espandiamo sul fondamento e l'applicabilità di FUEL rivedendo pertinenti principi alla base del fenomeno e dimostrare la sua compatibilità con una vasta gamma di fluorofori e nanoparticelle fluorescenti. Inoltre, l'utilità di FUEL anticorpo mirato è esplorato. Gli esempi qui riportati forniscono la prova che il carburante può essere utilizzato per applICATIONS dove BRET non è possibile, riempiendo il vuoto spaziale che esiste tra Bret e tradizionale complesso di imaging animali.

Introduction

La modificazione genetica degli organismi, quali virus 1, 2, 3, batteri o piccoli mammiferi 4 a uno indurre o bioluminescenza costitutivamente espresso, ha avuto molto successo ed ampiamente dimostrata 5-7. Bioluminescenza, una reazione chemiluminescente in vivo coinvolge reagenti presenti naturalmente, ha il vantaggio di produrre luce senza la necessità di una fonte di luce esterna. Come tale, l'imaging bioluminescente non soffre degli inconvenienti comuni di segnale-auto e non specifico trovati da imaging di fluorescenza 8. Di conseguenza, bioluminescenza ha un significativo rapporto segnale-rumore in quanto qualsiasi segnale rilevato proviene esclusivamente dalla sorgente destinata. Mentre molti modelli hanno sfruttato l'operone lux da luminescens Photorhabdus (massimo di emissione centrato tra 480 e 490 nm) in vitro e in vivo applicazioni 9, il suo uso in piccola mammals è problematico a causa della natura stessa delle condizioni di imaging; l'esistenza pervade di assorbitori ottici, come emoglobina e agenti di dispersione, come tessuti e ossa, influisce fortemente blu a lunghezze d'onda giallo 3. L'espressione di una lucciola luciferasi allestita (massimo di emissione a 617 nm), è stato recentemente sviluppato e integrato, fornendo uno strumento che supera notevolmente l'assorbimento ottico 10, ma è ancora soggetto ad effetti di scattering.

In risposta, ci sono stati diversi tentativi di red-shift del segnale emesso nella finestra ottica desiderata di 650-900 nm, una regione di assorbimento ridotto al minimo e dispersione, utilizzando la risonanza bioluminescenza trasferimento di energia (BRET) 11-13. Come strumento per migliorare la rilevazione del segnale, BRET, che utilizza una sorgente bioluminescente come donatore e un fluoroforo aggiunto come accettore, ha trovato un successo limitato. Come un esempio fondamentale di questo fenomeno, "punti quantici auto-illuminante4; (SIQDs) 14 costituiti modificato Renilla reniformis luciferases legati allo strato di polimero-lisina esterno punti di commercialmente disponibile quantici (QD). Su substrato Inoltre, la reazione di bioluminescenza risultante induce l'emissione di fluorescenza dai QD, generando una significativa produzione di fotoni rossi. Tuttavia, questi SIQDs hanno limitato l'applicabilità di visualizzazione in vivo di eventi fisiologicamente rilevanti. Questa limitata applicabilità è probabilmente dovuto alla difficoltà di collegare la sonda doppia all'organo, cella o gene di interesse, poiché i SIQDs non possono essere geneticamente codificati e richiedere pertanto una modifica secondario del guscio di polimero. Per migliorare la loro applicabilità, SIQDs alternativi, dove i luciferasi sono tenuti direttamente al core luminescenti, recentemente sono stati impiegati 15. Costruendo fuori del concetto SIQD, un sistema di BRET più applicabile stata ottenuta collegando Cypridina luciferasi in undocyanine tintura 16, che era specificamente diretta tumori nei topi mentre produce un cambiamento sostanziale rosso da 460 nm a 675 nm. Per sottoporsi trasferimento di energia non radiativo, BRET segue gli stessi vincoli primari come la sua controparte fluorescente: ci deve essere una forte sovrapposizione spettrale tra l'emissione del donatore e l'accettore spettri di eccitazione e la distanza di lavoro tra le due porzioni devono essere dell'ordine del raggio Förster (5-14 nm a seconda della coppia donatore-accettore, con un efficace distanza massima pari al doppio del raggio Förster 17). Questa dipendenza distanza limita notevolmente le tipologie di eventi che possono essere osservati con BRET come un mezzo per migliorare il rilevamento.

Recentemente un nuovo approccio è stato identificato e dimostrato sotto sia in vitro che in condizioni in vivo. Costruire fuori la fondazione di BRET, Fluorescenza da Unbound eccitazione di luminescenza (FUEL) 18, 19 Escherichia coli che esprimono l'operone lux e QD 18, 19. Mentre sperimentalmente simile alle SIQDs, esiste una differenza fondamentale: nel carburante, non è necessario per la sorgente luminescente di essere fisicamente legato al fluoroforo, che permette for codifica genetica della sonda luminescente. A causa della rilevazione di successo CARBURANTE tra batteri luminescenti e QD, è possibile che questa tecnica può essere applicata sia superficiale (pelle) e dei tessuti profondi (polmone, fegato) infezioni come Staphylococcus aureus e Klebsiellia pneumoniae.

Dalla relazione del suo significato sperimentale, CARBURANTE è evoluto per includere un modello matematico robusto 20 che può essere utilizzato per prevedere luminescente accettabile e coppie fluorescenti, e le sue applicazioni sono estese e comprendono l'utilizzo in identificazione delle caratteristiche fotofisiche come resa quantica. Descriviamo qui di seguito alcune delle tecniche di base di FUEL. In primo luogo, vi mostriamo le prove di questo fenomeno sia su breve (micron) e lunga (cm) distanze di lavoro, che distingue fondamentalmente carburante dal BRET. In secondo luogo, ci espandiamo sulle possibili coppie COMBUSTIBILE esaminando una vasta gamma di fluorofori e nanoparticelle fluorescenti. Third, applicazioni carburante sono indagato confrontando coppie COMBUSTIBILE mirati e non mirati.

Protocol

1. Reagenti

  1. Acquisto o sviluppare batteri luminescenti e terreni di coltura appropriati, come modificato Escherichia coli che esprime il ABCDE lux 21, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22.
  2. Preparare soluzione fisiologica (0.9% NaCl) e soluzioni di coltura dei media secondo le ricette standard. E. coli e K. pneumoniae sono state coltivate in Luria Bertani (LB) a 37 ° C, e V. fischeri e Photobacterium sp in LB integrate con 0,5 M NaCl a 22 ° C.
  3. Acquistare o acquisire sonde fluorescenti come Q-tracker 705 (40 nm di diametro, denominato QD705), Q-tracker 800 (40 nm di diametro, denominato QD800), fluorescente (diametro 40 nm) e microsfere di polistirene non fluorescenti ( 48 nm di diametro), e coloranti fluorescenti convenzionali.
  4. Preparare i reagenti necessari per l'etichettatura batterica.
  5. Garantire l'accesso allaun intero imager bioluminescenza animale, come un IVIS Spectrum, che è in grado di rilevare il segnale in un'ampia gamma di lunghezze d'onda di emissione e tempi di esposizione. Un lettore di micropiastre in grado di misurazioni bioluminescenza sarà sufficiente per la maggior parte degli esperimenti qui descritti.

2. Riepilogo base di FUEL

  1. A partire dalle colonie individuali su piastre di coltura standard, avviare colture durante la notte di batteri luminescenti. Qui, V. sono stati utilizzati fischeri.
  2. Il giorno di sperimentazione, avviare sottoculture freschi e permettere loro di progredire fino a raggiungere un diametro esterno 600 di 1-1,5. Per produrre risultati comparabili è meglio usare batteri negli stati di crescita simili in cui si producono segnali intensi. Questo può essere assicurata mantenendo la OD 600 costante.
  3. Combinare aliquote di 100 microlitri da ogni sia con 5 ml di QD705 o soluzione salina fisiologica (PS), e poi aggiungere a 895 ml di PS in standaCuvette rd spettroscopiche. Mettere le cuvette riempiti nel IVIS Spectrum e prendere le misure sotto gli appositi set di filtri. Qui, è stato utilizzato il filtro di emissione 710-730 nm.

3. FUEL Oltre distanze variabili

  1. Riempire due volume ridotto (1 ml) cuvette fotometriche di plastica sia con 50 ml di QD705 o 97,2 ml di non fluorescenti 48 nm microsfere di polistirolo in un volume totale di 1 ml PS. Questo garantisce simile superficie solida per volume totale tra le due entità.
  2. Preparare una cuvetta sorgente luminosa racchiudendo una terza cuvetta con nastro nero standard o qualche altro materiale opaco capace di bloccare la luce. Preparare accuratamente due finestre ottiche identiche sui lati opposti della cuvetta.
  3. Collocare le cuvette precedentemente riempiti direttamente su entrambi i lati della cuvetta sorgente luminosa. Aggiungere una aliquota 1 ml di V. cultura fischeri o altro (cioè luminescenti E. coli o Photobacterium sp) da una subcultura fresche nella cuvetta sorgente luminosa e coprire con un materiale opaco, come carta nera per ridurre qualsiasi contaminazione luce.
  4. Visualizzare i tre cuvette sotto i filtri di emissione adeguate come la luce totale e 710-730 filtri di emissione nm, con tempi di esposizione di 10, 30 e 30 secondi rispettivamente.
  5. Riposizionare entrambe le cuvette esterni a distanze maggiori equivalenti dal cuvetta centrale, e quindi visualizza di nuovo. Ripetere l'operazione fino ad ottenere una distanza finale faccia-a-faccia (centrale a volume ridotto cuvetta) di 3cm. Ad ogni passo, acquisire una immagine di fluorescenza (450-480 nm di eccitazione, 710-730 nm di emissione) per convalidare la posizione QD705.

4. Indagare coppie CARBURANTE potenziali

  1. Riempire due cuvette volume ridotto con soluzioni 1 ml contenenti sia un fluoroforo o una nanoparticella fluorescente di interesse in una, e PS o PS con nanoparticelle non fluorescenti come controllo negativo nell'altro. In the lavoro ha dimostrato qui, una serie di potenziali fluorofori carburante disponibile in commercio e nanoparticelle fluorescenti sono stati studiati come indicato nella Tabella 1.
  2. Aggiungere un'aliquota 1 ml di V. fresco fischeri o altri batteri luminescenti ad un terzo cuvetta oscurati contenente due finestre ottiche fisicamente uguali situati da parti opposte. Coprire la cuvetta con una sostanza opaca come un pezzo di carta nera.
  3. In un luogo distanza breve ma uguali i due cuvette volume ridotto su entrambi i lati della vaschetta black-out e visualizzare sotto i filtri appropriati. Qui, è stata utilizzata una distanza di 0,7 cm. Ripetere con gli altri fluorofori.

5. FUEL mirata

  1. Preparare anticorpi biotinilati specifici ai batteri luminescenti. Ad esempio, gli anticorpi primari specifici qui per K. pneumoniae (α-Kp) sono stati biotinilato utilizzando una soluzione contenente EZ-Link solfo-NHS-LC-biotina. Rimuovere l'eccesso di reagente da anticorpi utilizzando colonne dissalazione sotto centrifugazione (1500 xg) per 2 minuti.
  2. Utilizzare un saggio standard di Bradford per determinare la concentrazione di proteine ​​e determinare il grado di anticorpo biotinylation mediante saggio HABA.
  3. Ottenere l'anticorpo biotinilato α-Kp-Biot (AB) lotti miscelando 100 microlitri (10 mM, disciolto in PBS 1x) con 40 microlitri di anticorpo α-Kp, risultando in un grado finale di sostituzione di 16 residui biotina per Ab e una finale concentrazione proteica di 10 mg ml -1.
  4. Utilizzando aerei durante la notte replicare culture, bersaglio i batteri lavati con gli anticorpi di cui sopra seguenti il ​​protocollo appropriato.
    1. In particolare, lavare il K. pneumoniae in 1x PBS e risospendere in 1x PBS ad un diametro esterno di 4 (ca. 4 x 10 8 CFU ml -1 OD -1).
    2. Per ogni replica, incubare 100 microlitri di PBS, α -Anticorpi kp (10 microlitri α-Kp-biotB o 10 microlitri di PBS per il controllo) e 100 cellule microlitri per 90 min a 30 ° C. Lavare le cellule tre volte in 1x PBS e risospendere in 196 microlitri di PBS.
  5. Etichettare le cellule con il coniugato QD705 streptavidina e dividerli in due volumi equivalenti.
  6. Lavare un'unica soluzione tre volte e poi risospendere in volume appropriato.
  7. Distribuire 100 ml di soluzioni lavate e non lavate in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti nero. Misurare la luminescenza risultante con la luce totale, 490-510 nm e 710-730 nm filtri. Concentrazione fluoroforo può essere determinata utilizzando 450-480 nm di eccitazione e di emissione 710-730 nm.

Representative Results

Resonance Energy Transfer (RET) è una interazione non radiativo tra un donatore luminescente e un accettore fluorescente, per cui l'energia dal donatore uscito è in grado di indurre una risposta di fluorescenza dal accettore attraverso una forte interazione dipolo-dipolo 13. RET, che è stata descritta utilizzando fluorescente 23, 24 chemiluminescenza, e bioluminescenti 13 donatori, richiede principalmente: 1 sovrapposizione spettrale forte tra l'emissione del donatore e accettore spettri di eccitazione;. 2 adeguato allineamento di rotazione tra le due entità.; e 3. A distanza di lavoro non superiore a 0,5 a 2 volte il raggio Förster, R 0, tra il donatore e l'accettore 17. In contrasto con RET, CARBURANTE si verifica quando una sorgente luminescente, come batteri bioluminescenti, emette un fotone che viene assorbita e riemessa da una seconda entità, ad esempio un fluoroforo o una nanoparticella fluorescente, rosso-spostando la SPECT emissionerum della fonte luminescenti originale. Così, CARBURANTE segue un processo di eccitazione-emissione norma simile a epifluorescente condizioni normali, ma senza l'uso di un concentrato di eccitazione. Prova di questo può essere facilmente osservato dal semplice miscela di batteri luminescenti e punti quantici altamente fluorescenti. In presenza del Vibrio sp, un significativo aumento del segnale rosso si osserva quando QD705 erano anche in soluzione rispetto ad un non fluorescente controllo polistirolo microsfere (Figura 1A). I componenti necessari per creare bioluminescenza, essenzialmente substrato aldeide, luciferasi, e ATP, sono tutti prodotti e contenuti all'interno del citoplasma. Inoltre, la produzione enzimatica luminoforo avviene nel citoplasma batterico (Figura 1B). Come è stato riportato altrove, la distanza tra la membrana interna ed esterna dei batteri è tipicamente maggiore di 30 nm 25-27, una distanza che non consente di significativi RETa verificarsi. Così, le nanoparticelle fluorescenti non attraversano nel citoplasma batterico non essendoci endocitosi o altri mezzi di captazione. Insieme, questi vincoli indicano che FUEL è il fenomeno di eccitazione-emissione dominante, che si verifica quando i batteri luminescenti sono mescolati con nanoparticelle fluorescenti.

Come già è stato indicato, FUEL esiste oltre la gamma di RET. Per studiare la dipendenza del carburante sulla distanza, volume ridotto cuvette spettrofotometro standard possono essere utilizzati, con uno contenente una soluzione fluoroforo, un secondo contenente un controllo appropriato che può controllare per dispersione, e il terzo contenente una aliquota di soluzione luminescente fresco. È essenziale che la cuvetta centrale essere avvolto con del nastro nero o altro materiale opaco, salvo per almeno due finestre ottiche identici disposti su facce opposte, per ridurre qualsiasi contaminazione potenziale luce dalla sorgente luminescente. Inoltre, le due cuvette restanti devonoessere posizionato equidistante su entrambi i lati della cuvetta centrale. Infine, una soluzione luminescente fresco, utilizzando batteri o chemiluminescenza, deve essere usato con ogni esperimento per garantire la massima produzione di luce. Al momento del posizionamento del caso, acquisire il segnale di luminescenza sotto i filtri desiderati. Luce totale e 710-730 nm filtri sono stati usati in questo caso, anche se solo i dati provenienti da questi ultimi viene mostrata. Dopo ogni acquisizione, aumentare gradualmente la distanza faccia a faccia tra 1,0 cm e 3 cm (Figura 2). Infine, normalizzare tutti i dati verso il punto più luminoso. Negli esempi qui utilizzati, ciò si è verificato alla distanza più breve (D = 1 cm) tra la sorgente luminescente e la cuvetta contenente la QD705. Usando questo approccio, segnale CARBURANTE praticabile può essere osservato fino all'acquisizione finale suggerendo che, in assenza di qualsiasi assorbitore ottico, CARBURANTE può verificarsi a distanze superiori a qualsiasi eventuale trasferimento di energia di risonanza e può essere spiegato solo essere un puramente radiativoeffetto. Lato i dati rivelano una diminuzione del segnale in funzione della distanza D a seguito di una D -1 a D -2 dipendenza. A seconda della configurazione geometrica, il primo corrisponde alla distanza dipendenza condensatore e quest'ultimo alla legge dell'inverso del quadrato per sorgenti puntiformi. Questo risultato è quindi coerente con la nostra configurazione complessiva acquisizione, date le dimensioni dell'apertura cuvetta e la distanza tra la sorgente luminescente e il fluoroforo.

CARBURANTE vale non solo per punti quantici, ma può anche essere osservato utilizzando un'ampia gamma di fluorofori che vanno dalla serie Alexa di microsfere fluorescenti (Tabella 2). Per essere paragonabile al controllo, uguali concentrazioni dei differenti fluorofori dovrebbero essere utilizzate e la superficie totale delle nanoparticelle mantenuti costanti (Tabella 1). Confrontando i fluorofori e nanoparticelle ai loro adeguati controlli (PS o PS con non fluorescentemicrosfere di polistirene), un significativo aumento del segnale è osservata nella massima di emissione di ciascuna entità fluorescente. Il più grande aumento relativo segnale è stato riscontrata dove la massima emissione fluorescente è più lontana dalla massima emissione luminescente. Questo è probabilmente dovuto alla maggiore specificità del segnale di fluorescenza rispetto ad ampio spettro di emissione della sorgente luminescente. Al contrario, il segnale CARBURANTE meno affidabile è stato trovato quando i due massimi di emissione non erano ben separati. È interessante notare che un segnale CARBURANTE distinguibile stato trovato con le microsfere gialli anche se la differenza spettrale è minimo, dovuto molto probabilmente alla quantità sostanziale del fluoroforo presente al tallone (350 equivalenti fluoresceina). I risultati mostrati qui indicano che in condizioni appropriate CARBURANTE può essere realizzato con una varietà di fluorofori, che consente la personalizzazione delle sonde scelti per le applicazioni più rilevanti sia sotto in vitro e in condizioni in vivo. Il significato del segnale CARBURANTE osservata è stata determinata utilizzando il t-test standard di Student a due code. Come tale, solo il Alexa555 è risultato essere incompatibile con la sorgente luminescente utilizzata.

Al fine di esplorare gli effetti di targeting FUEL, anticorpi biotinilati sono stati usati per indirizzare i batteri luminescenti e QD streptavidina-linked. È importante che i batteri o fonte luminescenza forniscono uno strato di spessore sufficiente a minimizzare la possibilità di RET tra il luminoforo e la corrispondente fluoroforo. Dopo incubazione e lavaggio per rimuovere gli anticorpi non legati, i batteri marcati con biotina vengono poi esposti sia QD705 streptavidina coniugata o QD705 non funzionalizzato come controllo, le soluzioni divisi e una serie esposta ad ulteriori lavaggi per eliminare eventuali non rispettate QD705. Qui, per tutte e quattro le condizioni, la luminescenza risultante è stata osservata sotto luce totale, 490-510 nm, und 710-730 nm filtri, anche se solo le ultime due filtri sono utilizzati per l'analisi dei dati. La presenza del QD705 è stato confrontato con 450-480 nm di eccitazione e filtri di emissione 710-730 nm. Dopo alcune indagini abbiamo trovato poca o nessuna differenza nel segnale rosso-spostato quando le soluzioni sono state lasciate in uno stato non lavato (Figura 3). Il segnale di fluorescenza risultante in questa condizione si trova anche ad essere abbastanza simile, suggerendo che un numero uguale di QD705 era presente sotto sia stato mirati e non mirati. Tuttavia, lavando i campioni per eliminare ogni QD705 non legato fornisce un aumento di quasi due volte in rosso segnale relativo per i batteri mirati rispetto al loro controllo non mirati. Esame da fluorescenza può essere utilizzato per verificare la presenza o assenza del QD705. Comparativamente, la condizione lavato mirato comportato una intensità di fluorescenza che era quasi tre volte meno rispetto alla condizione non lavato, ma il conseguente red-shift diminuito solo30%, suggerendo che in condizioni puramente legati l'orientamento dei batteri comporta un aumento delle emissioni spostata verso il rosso. Questo implica fortemente l'utilità di FUEL mirati per applicazioni future.

Figura 1
Figura 1. A COMBUSTIBILE interazione tra batteri luminescenti e punti quantici disponibili in commercio porta ad un aumento della produzione di fotoni rosso. Due cuvette spettrofotometrici sono stati riempiti con soluzioni contenenti aliquote di 100 microlitri di V. fresco cultura fischeri con un OD 600 di 1-1,5, 895 ml di PS, e sia 5 microlitri di QD705 o soluzione salina fisiologica (PS), prima di essere immessi in un IVIS Spectrum e lo spettro di emissione acquisita. Un aumento significativo segnale rosso è ottenuto grazie alla presenza diil QD705, come si può notare dalla crescita dei fotoni rivelati • sec -1 • cm -2 (p • sec -1 • cm -2) rispetto al controllo sotto il filtro di emissione 710-730 nm (A). Qui, la doppia membrana dei batteri esclude l'interazione delle molecole luminescenti (cerchi blu) e il QD705 (cerchi neri). I primi si trovano solo nel citoplasma batterico mentre il secondo è liberamente distribuito nella soluzione bulk (B). N = 3 per ogni soluzione batterica. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Perdita di carburante che si verificano su distanze completely escluso trasferimento di energia di risonanza. cuvette spettrofotometrici sono stati riempiti con soluzioni contenente 50 ml di QD705 e 950 ml di soluzione fisiologica (PS) o 97,2 pl di non fluorescenti 48 nm microsfere di polistirolo e 902.8 ml di PS, e posizionati in modo equidistante su lati opposti di una cuvetta nero centrale contenente 1 ml di fresca luminescenti Photobacterium sp ad un OD 600 di 1-1,5. La cuvetta centrale aveva due finestre ottiche identiche consentono ai fotoni emessi per disperdere liberamente. L'acquisizione di immagini a distanze (D) che vanno da 1,0 cm a 3 cm produzione osservata di luce rossa diminuisce in funzione della distanza che dimostri che COMBUSTIBILE può verificarsi a distanze non ottenibili mediante risonanza trasferimento di energia. L'intensità sembrava avere D -2 dipendenza, simile alla legge dell'inverso del quadrato (a sinistra). Lo stesso protocollo è stato seguito per E. coli (a destra). Le linee di tendenza risultanti tengono forma al concetto that i batteri agiscono come sorgenti puntiformi di luce. Un totale di tre misure di distanza indipendenti sono stati acquisiti con l'utilizzo di una sottocultura unica. Sono presenti le barre di errore in ogni punto. In alcuni casi, le barre di errore sono più piccoli dei simboli utilizzati che indicano l'intensità normalizzata. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Confronto tra mirata (specifica) e non mirati (soluzione bulk) CARBURANTE. K. pneumoniae sono stati funzionalizzati con anticorpi biotinilati e quindi esposti a uno streptavidina marcata (mirato) o non marcato (non mirati) QD705. Le soluzioni risultanti erano ugualmente divided e un set lavate tre volte con PBS prima di essere risospeso nel suo volume iniziale in PBS. Le soluzioni sono state poi erogate in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti nero e la bioluminescenza osservato sotto i filtri di emissione 490-510 nm (500 nm) e 710-730 nm (720 nm) (indicate come barre blu). Il p • s • -1 cm -2 trovata dal filtro 720 nm per ogni pozzetto è stato normalizzato dal rispettivo p • s • -1 cm -2 intensità bioluminescenza da 500 nm dello stesso bene. L'intensità di fluorescenza relativa risultante da un'eccitazione epifluorescente stata determinata utilizzando 450-480 nm di eccitazione e filtri di emissione 710-730 nm (indicato come barre rosse). Poca o nessuna differenza nel segnale bioluminescente o fluorescenti è stato osservato nelle condizioni di non lavate (non mirati Unwashed e mirati non lavate). Questo suggerisce che il limite e liberamente fluttuante QD705 erano ugualmente eccitati dai fotoni bioluminescenti. Al lavaggio, npresto una differenza di due volte in rosso segnale relativo è stato osservato per i batteri QD705-etichettati (mirate lavati) rispetto al controllo (non-mirata lavato). L'assenza di QD705 nel non-mirata Lavato è stata confermata dalla mancanza di segnale fluorescente e verificato l'etichettatura QD705 nello stato lavato mirato. Il dato è da quattro culture indipendenti di K. pneumoniae. Per chiarezza, la leggenda indica la fonte dell'eccitazione QD705. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

width: 108px; "> Alexa 700 height: 22px; width: 108px; "> QD800
Fluoroforo Concentrazione pl PS (pl) λ max franco / em (nm) Emission Filter (n m)
Alexa 555 37.2 micron 4.77 995,23 555/565 570-590
Alexa 568 37.2 micron 4.77 995,23 578/603 590-610
Alexa 633 37.2 micron 4.77 995,23 632/637 650-670
37.2 micron 4.77 995,23 702/723 710-730
Non fluorescente 2.62% di solidi 9.72 990,28
μSph Rosa 5% di sostanza 4.77 995,23 580/605 610-630
μSph Giallo 5% di sostanza 4.77 995,23 505/515 510-530
QD705 2 pM 5 995 465/705 710-730
2 pM 5 995 465/705 790-810

Tabella 1. Proprietà dei fluorofori utilizzati nel corso delle manifestazioni di carburante.

<td> 6.05 x 10 4
Controllo filtro fluoroforo Controllo valore p
p · sec -1 · cm -2 SD p · sec -1 · cm -2 SD
A555 PS 580 1,08 x 10 7 3.31 x 10 6 9.09 x 10 6 1,75 x 10 6 0.233
A568 PS 600 8,47 x 10 6 4.23 x 10 6 4,49 x 10 6 9.71 x 10 5 0.094
A633 PS 660 2,40 x 10 6 1.25 x 10 6 7.85 x 10 5 2.39 x 10 5 0.046
A700 PS 720 5,53 x 10 5 2.46 x 10 5 1,54 x 10 5 0.026
MSPH Giallo μspheres non fluorescenti 520 1,19 x 10 8 4,85 x 10 7 5,79 x 10 7 1,99 x 10 7 0.057
MSPH Rosa μspheres non fluorescenti 620 2,37 x 10 7 1,36 x 10 7 2.16 x 10 6 8,00 x 10 5 0.026
QD705 μspheres non fluorescenti 720 1.76 x 10 7 7.33 x 10 6 2.08 x 10 5 7.16 x 10 4 0.007
QD800 μspheres non fluorescenti 800 7,79 x 10 6 4,72 x 10 6 3,60 x 10 4 1.52 x 10 4 0.023

Tabella 2. Identificazione dei fluorofori e nanoparticelle fluorescenti compatibili con FUEL.

Discussion

La manifestazione fondamentale del carburante può essere realizzato semplicemente mescolando batteri luminescenti con nanoparticelle fluorescenti o QD. Le due entità saranno fisicamente separati e restano là di ogni efficiente distanza RET. Più difficile è l'ottimizzazione del segnale FUEL sia in vitro che in vivo. In condizioni in vitro, con e senza un assorbitore ottico presenti, di solito l'aggiunta di un eccesso di fluoroforo sarà sufficiente a massimizzare la risposta del combustibile. Tuttavia, a concentrazioni elevate fenomeni come quenching statico o collisione può portare ad una perdita di segnale fluorescente. L'esecuzione di una serie di diluizioni variando autonomamente la concentrazione della sorgente luminescente e il fluoroforo aiuterà ad ottimizzare le concentrazioni desiderate. La creazione e l'ottimizzazione di carburante in concentrazioni vivo è molto più difficile e deve essere affrontato caso per caso. Può essere difficile creare un condition dove l'entità fluorescente può essere letta otticamente dalla sorgente luminescente. In quanto tale, a cominciare da co-iniezioni dirette delle due frazioni in grado di fornire informazioni riguardanti il ​​successo di FUEL in condizioni ottimali.

Esistono protocolli standard per i batteri di etichettatura e cellule eucariotiche con entità fluorescenti come la serie Alexa e QD. Spesso questo richiede funzionalizzazione superficiale o attivazione con anticorpi, che può portare ad effetti indesiderati come la vitalità cellulare ridotta o attività metabolica alterata. Per ovviare a questo, è importante determinare la quantità ottimale di anticorpo o l'agente di attivazione necessario che minimizza perturbazioni cellulari massimizzando la marcatura fluorescente. L'uso di QD è vantaggioso a causa della loro caratteristicamente ampio spettro di eccitazione, spettri di emissione stretta e sintonizzabile, e la possibilità di un grande spostamento di Stokes. Tuttavia, QD possono essere citotossici e non possono essere desiderabile in alcuni casi.

13 ed è applicabile ad una varietà di fonti luminescenti e fluorescenti. Fino ad ora, i fotoni derivanti da CARBURANTE sono stati considerati il ​​prodotto di interazioni non specifiche o un segnale di fondo sfortunato risultanti da esperimenti BRET mal progettati. E 'solo con il tipo di esperimenti hanno dimostrato qui che siamo stati in grado di identificare l'utilità di questo segnale non desiderato. Negli esempi illustrati, i batteri luminescenti agiscono come fonte di eccitazione diffusa in grado di suscitare una risposta fluorescente standard da una grande varietà di entità fluorescenti. Inoltre, a causa della notevole distanza di lavoro, è lecito concludere che mentre il carburante può essere costruito senza il verificarsi di BRET, in BRET generale, non può essere osservato senza il contributo di FUEL. È importante sottolineare che, a causa della mancanza di un requisito di targeting, carburante può essere utilizzata per coprire il gap spaziale esistente tra BRET ectecniche di imaging intero animale onventional.

Disclosures

Gli autori dichiarano concorrenti interessi finanziari. JD, SB, KLR e SLS contribuito a EP10290158.4 europeo dei brevetti e la World Intellectual Property Organization domanda di brevetto WO/2011/117847.

Acknowledgements

Gli autori desiderano estendere la loro gratitudine per il sostegno finanziario della Fondazione Pasteur di New York (JD, CS, CS), l'EU-FP7 programma "Automation" (SLS), il Programma di Carnot Institut 11 (JD, AH , AR, RT, SLS) e Project Imnos (a RT, SLS), la Fondazione di beneficenza Conny-Maeve (SLS), il Master Europeo in Imaging Molecolare (a IT), i programmi Regione Ile de France MODEXA (SLS), SESAME (SLS) e DimMalInf (SLS, RT), l'ANR Programma Grandes Investissement de l'avenir Infrastrutture Nationales en Biologie-Santé: Francia LifebioImaging (FLI) Francia Vita Imaging (RT, SLS), Francia Bioimmagini (JD, SLS) e il Institut Pasteur di Parigi. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare, José Bengoechea e Herbert Schweizer per i reagenti. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare Cindy Fevre che ha generato gli anticorpi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon  kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145  52145 is a serotype K2 reference strain
Luria Bertani (LB)  standard growth media
Q-Tracker 705  Life Sciences Q21061MP
Q-Tracker 800 Life Sciences Q21071MP
Alexa 555 Life Sciences S21381
Alexa 568 Life Sciences S11226
Alexa 633 Life Sciences S21375
Alexa 700 Life Sciences S21383
Non-fluorescent microspheres Polysciences, Inc 15913
Pink microspheres Life Sciences F8887 40 nm diameter
Yellow microspheres Life Sciences F8888 40 nm diameter
Ivis Spectrum PerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific Pierce 21425
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Scientific Pierce 21425
HABA assay kit  Thermo Scientific Pierce 28005
Bradford assay Bio-Rad 500-0201

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