पृथक रक्त perfused चूहा फेफड़े तैयारी में एकल microvessel पारगम्यता बढ़ाता

Biology

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Summary

पृथक खून से perfused फेफड़ों तैयारी फेफड़ों सतह पर microvessel नेटवर्क कल्पना करने के लिए यह संभव बनाता है. यहाँ हम वास्तविक समय प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग कर अलग फेफड़ों में एकल microvessels की पारगम्यता यों के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन.

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Kandasamy, K., Parthasarathi, K. Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation. J. Vis. Exp. (88), e51552, doi:10.3791/51552 (2014).

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Abstract

पृथक खून से perfused फेफड़ों तैयारी व्यापक रूप से कल्पना और एकल microvessels में संकेतन परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. वास्तविक समय इमेजिंग के साथ इस तैयारी युग्मन, यह व्यक्ति फेफड़े microvessels में पारगम्यता परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए संभव हो जाता है. इस के साथ साथ हम चूहे फेफड़ों को अलग करने और ऑटोलॉगस रक्त के साथ उन्हें छिड़कना के लिए कदम का वर्णन. तो, हम एक छोटे से फेफड़ों के क्षेत्र में एक Microcatheter के माध्यम से fluorophores या एजेंटों को बढ़ावा कदम रूपरेखा. वर्णित इन प्रक्रियाओं का उपयोग करना, हम बैक्टीरियल lipopolysaccharide की सुई लेनी के जवाब में चूहे फेफड़ों microvessels में पारगम्यता बढ़ जाती है निर्धारित की. डेटा lipopolysaccharide दोनों venular और केशिका microvessel क्षेत्रों में तरल पदार्थ लीक है कि वृद्धि का पता चला. इस प्रकार, इस विधि यह संभव संवहनी वर्गों के बीच पारगम्यता प्रतिक्रियाओं की तुलना करने और इस प्रकार, जवाब में किसी भी विविधता को परिभाषित करने के लिए बनाता है. फेफड़ों पारगम्यता को परिभाषित करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों फेफड़ों के ऊतकों के नमूनों की postprocessing की आवश्यकता होती हैवास्तविक समय इमेजिंग का उपयोग वर्तमान पद्धति से स्पष्ट रूप में इस आवश्यकता को अनावश्यक. इस प्रकार, वास्तविक समय इमेजिंग के साथ संयुक्त पृथक फेफड़ों तैयारी फेफड़ों microvascular पारगम्यता निर्धारित करने के लिए पारंपरिक तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है, अभी तक विकसित करने और लागू करने के लिए एक सरल तरीका है.

Introduction

फेफड़ों में वृद्धि हुई microvascular पारगम्यता वायुकोशीय शोफ और समझौता गैस विनिमय का विकास होता है और गंभीर फेफड़ों की चोट (अली) 1-3 की एक प्रमुख विशेषता है. इस प्रकार, संवहनी पारगम्यता के अनुमान फेफड़ों की चोट और प्रस्तावित उपचारात्मक उपायों की प्रभावकारिता की हद को परिभाषित करने में महत्वपूर्ण हैं. ऐसे रक्त मुफ्त फेफड़ों गीला करने वाली शुष्क अनुपात और microvascular निस्पंदन गुणांक के रूप में gravimetric विश्लेषण व्यापक रूप से पारगम्यता 4,5 अनुमान लगाने के लिए तरीकों का इस्तेमाल कर रहे हैं. अन्य तरीकों फेफड़े के ऊतकों 6-8 में रेडियोधर्मी या फ्लोरोसेंट जांच की अवधारण बढ़ाता शामिल हैं. हालांकि, ऊपर तरीकों पारगम्यता डेटा elucidating की ओर फेफड़े के ऊतकों के नमूनों की postexperiment प्रसंस्करण की आवश्यकता है. एक जानवर एक ही इलाज के प्रोटोकॉल के लिए ही इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि इसके अलावा, बड़े जानवर संख्या एक पूरा अध्ययन के लिए आवश्यक हो सकता है. ऊपर तरीकों का एक आम लक्षण है कि वे के लिए मतलब संवहनी पारगम्यता निर्धारित करता हैऊतक नमूना भीतर सभी रक्त वाहिकाओं. हालांकि, यह अच्छी तरह से फेफड़े के सूक्ष्म और स्थूल वाहिकाओं 9 phenotypically अलग कर रहे हैं स्थापित है. इसलिए, पारगम्यता प्रतिक्रियाओं के साथ 9,10 विभिन्न पोत क्षेत्रों के बीच विषम हो सकती है. इस प्रकार, एक ऊतक के नमूने में सब फेफड़े वाहिकाओं का मतलब पारगम्यता बढ़ाता पर्याप्त रूप से इस विविधता को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है.

पृथक खून से perfused फेफड़ों तैयारी में, फेफड़ों की सतह पर रक्त वाहिकाओं एक ईमानदार माइक्रोस्कोप 4,11,12 से देखे जा सकते हैं. इस प्रतिक्रियाओं 13 में किसी भी विविधता को संबोधित करते हुए इस प्रकार एकल वाहिकाओं में निस्र्पक प्रतिक्रियाओं सक्षम बनाता है और. इसके अलावा, microvessels के प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करके, प्रतिदीप्ति आधारित assays शामिल किया जा सकता है. इसके अलावा, एक बाएं आलिंद Microcatheter रक्त वाहिकाओं 11,14 में एजेंटों और प्रतिदीप्ति जांच देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Microcatheter एक छोटे से फेफड़ों के क्षेत्र के लिए वितरण सीमा है, इस प्रकार पूर्वसंचार एजेंटों और fluorophores को क्षेत्र के भीतर ही रक्त वाहिकाओं प्रस्तुत. यह वही फेफड़ों के भीतर कई छोटे क्षेत्रों एक अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों में एक समग्र कमी करने के लिए अग्रणी, अलग प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है.

वास्तविक समय इमेजिंग संवहनी और पृथक फेफड़ों तैयारी की एकल microvessels की extravascular प्रतिदीप्ति में गतिशील परिवर्तन का कब्जा सक्षम बनाता है. इस प्रकार, एक छवि क्षेत्र के भीतर प्रत्येक microvessel के लिए, fluorophores और washoff के निषेचन के दौरान प्रतिदीप्ति में परिवर्तन दर्ज की गई, और ऑफ़लाइन 14 मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. अधिकतम और अवशिष्ट संवहनी प्रतिदीप्ति के मूल्यों का प्रयोग, इमेजिंग क्षेत्र के भीतर प्रत्येक microvessel के लिए एक पारगम्यता सूचकांक निर्धारित किया जा सकता है. भड़काऊ या हानिकारक एजेंटों के जवाब में पारगम्यता परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए, वांछित एजेंट पहले प्रशासित किया जा सकता है और फिर पारगम्यता सूचकांक निर्धारित की. इसके अलावा, छवि क्षेत्र से संचार फेफड़ों के क्षेत्र के भीतर कहीं भी स्थापित किया जा सकता हैMicrocatheter, इस प्रकार वांछित संवहनी नेटवर्क के चयन में लचीलेपन की एक उच्च डिग्री सक्षम करने से. इस प्रकार, वास्तविक समय इमेजिंग के साथ मिलकर में पृथक खून से perfused फेफड़ों तैयारी एकल फेफड़ों microvessels में पारगम्यता यों के लिए एक आकर्षक प्रयोगात्मक मॉडल उपलब्ध कराता है.

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Protocol

टेनेसी स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित के रूप में पशुओं पर प्रदर्शन सभी प्रयोगों थे.

Perfusing चूहा फेफड़े की तैयारी के लिए 1. ट्यूबिंग

  1. चित्र 1 में दिखाया के रूप में दबाव transducers (P23XL) कनेक्ट. रक्त छिड़काव के लिए Tygon टयूबिंग (# 18) के साथ एक ट्यूबिंग प्रणाली तैयार है और खुर्दबीन मंच पर ट्यूबिंग जगह है.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान तापमान सेट
  3. फेफड़ों के इनलेट कनेक्ट और Tygon टयूबिंग के साथ अस्थायी रूप से दुकान.

चित्रा 1
चित्रा 1. रक्त छिड़काव ट्यूबिंग. योजनाबद्ध पृथक फेफड़ों तैयारी के माध्यम से रक्त संचार के लिए इस्तेमाल किया ट्यूबिंग सेटअप पता चलता है. इसके अलावा जुड़े घटक हैं जो संकेत के माध्यम से ट्यूबिंग मैंएस कराई. दिल और फेफड़ों का एक योजनाबद्ध ट्यूबिंग और फेफड़े के धमनी (पीए) के बीच संबंध की साइटों को दिखाने के लिए शामिल है, और आलिंद (ला) प्रवेशनी (ब्लू लाइन धराशायी) को छोड़ दिया जाता है.

पृथक चूहा फेफड़ों के 2. तैयारी

  1. Ketamine (80-100 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ और xylazine (5-10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ, चूहों (250-300 ग्राम पुरुष Sprague-Dawley चूहों) anesthetize. संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान सुनिश्चित करने के बाद, एक लापरवाह स्थिति में जानवरों की जगह.
  2. Tracheostomy प्रदर्शन करना, एक सांस की नली प्रवेशनी (पीई 90) डालें और शल्य सीवन के साथ सुरक्षित.
  3. हृदय पंचर (21 जी तितली सुई) द्वारा हृदय में हेपरिन (100-200 यू) दिखे, 60 सेकंड और रक्तहीन रक्त (~ 12-15 मिलीलीटर रक्त) के लिए प्रतीक्षा करें.
  4. दो cannulas (4 सेमी लंबा, Tygon टयूबिंग, 3 मिमी व्यास एक छोर पर flared) तैयार करें और नमक के साथ भरें.
  5. एक thoracotomy प्रदर्शन करना. सही वेंट्रिकल पर एक चीरा (3 मिमी) और फेफड़े की ओर चीरा में एक प्रवेशनी की flared अंत स्लाइडधमनी. सर्जिकल sutures के साथ फेफड़े के धमनी को प्रवेशनी सुरक्षित.
  6. बाएं वेंट्रिकल की एपेक्स (3 मिमी) काटकर अलग कर देना और चीरा में दूसरा प्रवेशनी की flared अंत स्लाइड. बाएं आलिंद में प्रवेशनी गाइड. एक नाल टेप (2 मिमी चौड़ाई) के साथ बाएं वेंट्रिकल को प्रवेशनी सुरक्षित.
  7. किसी भी संयोजी ऊतक काटना, और संलग्न cannulas के साथ मिलकर फेफड़े और दिल को हटा दें. एक पेट्री डिश पर फेफड़े और दिल को रखें. Diaphragmatic सतह शीर्ष पर है कि इतनी फेफड़ों का स्थान बदलें. तीन cannulas एक ही दिशा का सामना करना चाहिए.
  8. XY दिशाओं में हेरफेर किया जा सकता है कि एक मंच पर फेफड़ों तैयारी रखें. एक खुर्दबीन के साथ आता है कि किसी भी स्तर ट्यूबिंग या यदि आवश्यक हो तो, निर्मित एक कस्टम निर्मित चरण पकड़ करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

पृथक चूहा फेफड़ों के 3. रक्त छिड़काव

  1. एक बराबर मात्रा एल्बुमिन (5%) समाधान के साथ exsanguinated रक्त मिक्स और जलाशय में जोड़ें. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप शुरू और प्रवाह आर सेट14 मिलीग्राम / मिनट के लिए खा लिया. रक्त ट्यूबिंग भरने की अनुमति.
  2. अलग धकेलना के साथ खुला, अस्थायी फेफड़ों इनलेट दुकान कनेक्टर को हटा दें. क्रमशः, फेफड़ों इनलेट और आउटलेट को फेफड़े के धमनी और बाएं आलिंद प्रवेशनी देते हैं. ट्यूबिंग में कोई हवाई बुलबुले हैं सुनिश्चित करें.
  3. एक तिहाई दबाव transducer (P23XL) को सांस की नली प्रवेशनी कनेक्ट करें. सांस की नली प्रवेशनी के माध्यम से 30% ऑक्सीजन के साथ फेफड़ों में हवा और 5 सेमी एच 2 ओ पर दबाव बनाए रखने के
  4. फेफड़ों के छिड़काव शुरू करने के लिए एक क्लैंप के साथ अलग धकेलना बंद करें. फेफड़े के धमनी और क्रमश: 10 और 3 सेमी एच 2 ओ ~ पर बाएं आलिंद के दबाव बनाए रखें.

4. माईक्रवैस्कुलर आसव के लिए फेफड़ों की तैयारी

  1. फेफड़ों और सुरक्षित के स्तर से ऊपर कैथेटर के लिए विस्तार ट्यूबिंग के पीछे के अंत उठाएँ.
  2. एक ~ 30 सेमी लंबे PE90 टयूबिंग में एक 40 सेमी लंबा PE10 ट्यूबिंग के बारे में 30 सेमी डालने से एक प्रेरणा कैथेटर तैयार करें. एक सुई (30 ग्राम) पर करने के लिए PE10 टयूबिंग के उजागर अंत कनेक्टएक सिरिंज (1 सीसी) को tached.
  3. विस्तार ट्यूबिंग का उठाया पीछे के अंत में कैथेटर संयोजन डालें. यह प्रतिरोध मिलता है जब तक बाएं आलिंद के माध्यम से और फेफड़ों में कैथेटर संयोजन गाइड. यह प्रतिरोध मिलता है तो जब तक, फेफड़ों में आगे अकेले PE10 कैथेटर धक्का. कैथेटर डालने जबकि अत्यधिक बल लागू करने के फेफड़ों घायल पड़ेगा.
  4. घंटी समाधान के साथ 1 सीसी सिरिंज भरें और एक सिरिंज पंप के लिए देते हैं. 10 μl / मिनट के लिए अर्क दर निर्धारित करें.
  5. आसव साइट फेफड़ों के बाकी की तुलना में पीला हो जाएगा.
  6. नमक के साथ फेफड़ों गीला और खुला आसव साइट को छोड़ने के लिए एक काफी बड़े छेद के साथ प्लास्टिक की चादर के साथ फेफड़ों को कवर किया.
  7. एक O-अंगूठी (कस्टम बनाया) के तल पर कुछ पानी निकलने की टोंटी तेल झाड़ू और O-अंगूठी के तल पर एक गिलास coverslip (# 1.5, 22 मिमी व्यास) रखें. धीरे आसव साइट पर coverslip के साथ O-अंगूठी की स्थिति. एक मानक परखनली hol साथ O-अंगूठी सुरक्षितडेर. हाल ही में 15 रिपोर्ट में coverslip / O-अंगूठी संयोजन, इसे नीचे वायुकोशीय संरचनाओं बिगाड़ना नहीं है.
  8. O-अंगूठी के ऊपर एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का एक उद्देश्य (20X) की स्थिति और फेफड़ों की सतह पर ध्यान केंद्रित.

Microvessels के माध्यम से 5. इमेजिंग फ्लोरोसेंट dextran ट्रांजिट

  1. इमेजिंग FITC पुष्पन के लिए माइक्रोस्कोप तैयार करें.
  2. Imaged किया जा करने के लिए एक क्षेत्र का चयन करें और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 1/minute की दर से प्राप्त चित्रों के.
  3. सिरिंज पंप का उपयोग कर FITC-dextran 20 केडी (0.5 मिलीग्राम / एमएल) की जान फूंकना शुरू करो. रक्त वाहिकाओं में प्रतिदीप्ति धीरे - धीरे बढ़ाने के लिए और एक अधिकतम तक पहुंच जाएगा. 60 मिनट के लिए अर्क जारी.
  4. फिर luminal प्रतिदीप्ति बंद धोने के लिए घंटी निषेचन के लिए स्विच. पर 10 मिनट के लिए अर्क बनाए रखें. धोने के बंद के दौरान 1/min पर छवि अधिग्रहण जारी.

6. छवि विश्लेषण

  1. छवि अधिग्रहण फ़ाइल खोलें.
  2. प्लेस क्षेत्रोंछवि सीमा के भीतर microvessels से अधिक ब्याज की.
  3. छवि फ़ाइल फ्रेम दर फ्रेम में खेलते हैं और सभी फ्रेम के लिए ब्याज की प्रत्येक क्षेत्र में प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकॉर्ड.
  4. समय के एक समारोह के रूप में ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन प्लॉट.
  5. अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता और washoff के 10 मिनट के बाद अवशिष्ट प्रतिदीप्ति तीव्रता यों.
  6. ब्याज की है कि क्षेत्र के साथ जुड़े microvessels के लिए पारगम्यता सूचकांक पाने के लिए ब्याज की प्रत्येक क्षेत्र में अवशिष्ट प्रतिदीप्ति तीव्रता को अधिकतम के अनुपात की गणना.

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Representative Results

छिड़काव टयूबिंग और संबंधित उपकरणों से जुड़ा एक अलग रक्त perfused फेफड़ों तैयारी चित्रा 2 में दिखाया गया है. साथ साथ वर्णित प्रक्रियाओं किसी भी चूहा प्रजातियों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए, हम एक Sprague Dawley चूहे का इस्तेमाल किया. एक बाएं आलिंद Microcatheter के माध्यम से आधान फेफड़ों के केवल एक छोटे से क्षेत्र तक पहुँचते हैं. संचार क्षेत्र में जान फूंकना प्रेरित मलिनकिरण (चित्रा 3) से पहचाना जा सकता है. वास्तविक समय इमेजिंग के लिए तैनात रूप में फेफड़ों की तैयारी चित्रा 4 में दिखाया गया है.

चित्रा 2
चित्रा 2. खून से perfused फेफड़ों तैयारी पृथक. तस्वीर छिड़काव टयूबिंग से जुड़ा है और ऑटोलॉगस रक्त के साथ perfused पृथक चूहा फेफड़ों से पता चलता है. फेफड़ों के diaphragmatic सतह मील चेहरे कि नोटउद्देश्य croscope.

चित्रा 3
चित्रा 3. Microcatheter आसव क्षेत्र. बाएं आलिंद के माध्यम से डाला microcathether फेफड़ों तैयारी में घंटी समाधान को बढ़ावा के लिए इस्तेमाल किया गया था. तस्वीर घंटी प्रेरणा प्राप्त बाएं फेफड़े (चक्र) के क्षेत्र से पता चलता है. घंटी आसव वाहिकाओं के माध्यम से perfusing रक्त विस्थापित के रूप में, संचार क्षेत्र अन्य फेफड़े क्षेत्रों की तुलना में पीला दिखाई देता है. घंटी आसव फेफड़ों के एक छोटे से स्पष्ट रूप से सीमांकन क्षेत्र तक ही सीमित है कि ध्यान दें.

चित्रा 4
पृथक फेफड़ों तैयारी के लिए चित्रा 4. इमेजिंग स्थिति. तस्वीर थानेदारWS एक पृथक फेफड़ों तैयारी इमेजिंग के लिए तैयार उद्देश्य एक खुर्दबीन के नीचे तैनात. फेफड़ों सतह नम फेफड़ों सतह रखने के लिए एक प्लास्टिक की चादर के साथ कवर किया जाता है कि ध्यान दें. एक हे अंगूठी इमेजिंग के दौरान फेफड़ों सतह क्षैतिज रखता है.

, अली के एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल:; इस अध्ययन में, हम बैक्टीरियल lipopolysaccharide (बी 4 सीरोटाइप 0111 LPS) के साथ उपचार के जवाब में संवहनी पारगम्यता में परिवर्तन निर्धारित की. इस ओर है, हम 60 मिनट के लिए 11 एक घंटी धोने के द्वारा पीछा किया 30 मिनट के लिए microvessels में LPS (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के संचार. तो फिर हम पारगम्यता सूचकांक यों तो FITC dextran 20 केडी संचार. अवशिष्ट FITC प्रतिदीप्ति घंटी के साथ इलाज microvessels में कम है, लेकिन LPS (आंकड़े 5 ए डी) के साथ इलाज किया उन लोगों में अधिक थी. इसके अलावा, घंटी निषेचन की तुलना में, LPS आसव छवि महसूस भीतर सभी जहाजों में पारगम्यता में एक वैश्विक वृद्धि, सुझाव पारगम्यता सूचकांक में एक महत्वपूर्ण कमी का कारणडी (चित्रा 5E). venules और केशिकाओं के लिए अलग मात्रा निर्धारित पारगम्यता सूचकांक अंतर (चित्रा 5F) महत्वपूर्ण नहीं था, हालांकि LPS प्रेरित पारगम्यता वृद्धि, केशिकाओं में से venules में कम थी कि सुझाव दिया.

चित्रा 5
चित्रा 5. LPS संवहनी पारगम्यता बढ़ जाती है. पल्मोनरी microvessels 30 मिनट के लिए या तो घंटी या LPS (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ इलाज किया गया. 60 मिनट के बाद, FITC dextran 20 केडी एक घंटी धोने और वास्तविक समय इमेजिंग द्वारा कब्जा कर लिया प्रतिदीप्ति परिवर्तन द्वारा पीछा संचार किया गया था. फिर फेफड़ों का इलाज क्षेत्र में रक्त वाहिकाओं की पारगम्यता सूचकांक अवशिष्ट FITC dextran प्रतिदीप्ति को अधिकतम के अनुपात के रूप में निर्धारित किया गया था. ई.) छवियाँ अधिकतम (ए, सी) और अवशिष्ट शो (बी, डी) FITC FluorRinger's (ए, बी) और LPS का इलाज (सी, डी) फेफड़ों microvessels में escence. ई) LPS आसव छवि सीमा के भीतर सभी पोत क्षेत्रों में काफी पारगम्यता सूचकांक की कमी हुई. एफ) LPS उपचार में पारगम्यता सूचकांक में कमी के कारण दोनों venules और केशिकाओं (* पी <घंटी नियंत्रण की तुलना में 0.05, तीन बार प्रत्येक दोहराया, मतलब ± SEM). Capillaries (टोपी) और venules (उपक्रम) FITC dextran 20 केडी के अर्क से पहले कब्जा कर लिया एक brightfield छवि से प्राप्त पोत आयाम द्वारा की पहचान की गई. पता चला छवियाँ एक 850 x 850 माइक्रोन छवि फ्रेम की एक फसली भाग रहे हैं. एन = जहाजों की संख्या.

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Discussion

वास्तविक समय इमेजिंग के साथ मिलकर अलग रक्त perfused फेफड़ों तैयारी एकल फेफड़ों microvessels में पारगम्यता परिवर्तन के निर्धारण के लिए एक सरल उपकरण प्रदान करता है. हम LPS की सुई लेनी के जवाब में पारगम्यता परिवर्तन को परिभाषित करने के लिए इस पद्धति लागू होता है. हमारे आंकड़े स्पष्ट रूप से LPS आसव microvascular पारगम्यता में वृद्धि के कारण होता है कि सुझाव देते हैं. इसके अलावा, डेटा भी LPS द्वारा प्रेरित पारगम्यता परिवर्तन venules और केशिकाओं दोनों में इसी तरह के थे कि संकेत मिलता है. इस प्रकार, इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ एकल microvessels की leakiness के साथ ही जहाजों के एक वैश्विक नेटवर्क को परिभाषित करने की क्षमता है. इस तकनीक को भी वैश्विक पारगम्यता परिवर्तन है कि पैदावार को देखते हुए, यह इस तरह के gravimetric विश्लेषण के रूप में अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों का उपयोग कर प्राप्त की है कि के साथ इन मूल्यों की तुलना संभव है. इस प्रकार, वर्तमान पद्धति भी अन्य अध्ययन में बताया कि साथ microvascular द्रव रिसाव जानकारी की तुलना के लिए अनुमति देता है.

की तुलना मेंअधिक व्यापक रूप से संवहनी पारगम्यता परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया, वास्तविक समय इमेजिंग आधारित पद्धति फेफड़े के ऊतकों के नमूनों की कोई postprocessing की आवश्यकता है. फ्लोरोफोरे प्रतिधारण की हद तक की fluorophore आसव और बाद washoff दौरान कब्जा कर लिया है. यह स्पष्ट रूप से ऊतकों के नमूनों और अपने को संभालने के साथ जुड़े किसी भी त्रुटि के संरक्षण समाप्त. पारगम्यता सूचकांक के माध्यम से व्यक्तिगत microvessel पारगम्यता की स्थापना के अलावा, वर्तमान पद्धति भी दरियाफ्त प्रतिदीप्ति वृद्धि की भयावहता, ट्रेसर प्रतिदीप्ति के परिवर्तन की दर के biphasic प्रकृति, और दूर धोने के दौरान ट्रेसर प्रतिदीप्ति क्षय की दर को परिभाषित करने की सुविधा. हमारी पिछली रिपोर्ट 14 में वर्णित के रूप में इन अतिरिक्त पैरामीटर, अलग उपचार है, साथ ही microvessels में अंतर - कमानी मतभेदों को प्रतिक्रियाओं तुलना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

हम इस के साथ साथ एक सूजन के जवाब में पारगम्यता परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया हैसंवहनी आसव द्वारा वितरित एजेंट. हालांकि, यह के रूप में अच्छी तरह से अन्य मार्गों द्वारा दिया एजेंटों के लिए पारगम्यता परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए प्रक्रियाओं का अनुकूलन करने के लिए संभव है. इस प्रकार, हम पहले से वायुकोशीय टपकाना 14 ने दिया एसिड को microvessel पारगम्यता बढ़ जाती है निर्धारित किया है.

स्पष्ट रूप में फेफड़ों की तस्वीरों से, Microcatheter आधारित वितरण पद्धति फेफड़ों के एक छोटे से क्षेत्र को दिया उत्पाद प्रतिबंधित करता है. इस प्रकार, विभिन्न फेफड़ों के क्षेत्रों को Microcatheter से छेड़छाड़ करके, प्रयोगों की एक श्रृंखला में एक ही फेफड़ों में आयोजित किया जा सकता है. इस प्रकार, इस विधि का एक पूरा अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है. इस डेटा और अन्य सूचना दी पढ़ाई एक ही फेफड़ों 4,11,12,14,16 में कई लेनी उपयोग किया है. विभिन्न क्षेत्रों से प्रतिक्रियाओं में कोई मतभेद के कारण वर्तमान अध्ययन में perfusate के माध्यम से संचार एजेंटों के संभावित पुनःपरिसंचरण को स्पष्ट किया गया है, इस संभावना विपक्ष होना चाहिएप्रयोगात्मक डिजाइन में idered. प्रयोगों के लिए एक ही फेफड़ों के विभिन्न क्षेत्रों का उपयोग इस प्रकार, जब यह आधारभूत पारगम्यता विभिन्न फेफड़ों के क्षेत्रों में इसी तरह की है कि यह निर्धारित करने के लिए फायदेमंद हो सकता है.

वर्तमान पद्धति की सफलता एक अच्छी तरह से perfused फेफड़ों तैयारी की स्थापना पर निर्भर करता है. फेफड़ों तैयारी द्रव सांस की नली ट्यूब, रक्त रिसाव, या एक क्षतिग्रस्त फेफड़ों से संकेत मिलता है जो सभी उच्च फेफड़े के धमनी के दबाव से बाहर आ रहा है, किसी भी लाल धब्बे बिना वर्दी के रंग की होनी चाहिए. इसके अलावा, देखभाल प्रविष्टि मजबूर venule पंचर और फेफड़ों की क्षति के लिए नेतृत्व करेंगे के रूप में, फेफड़ों में microcathether की प्रविष्टि के दौरान लिया जाना चाहिए.

इस प्रकार वर्तमान बरकरार फेफड़ों विधि सीमा फुफ्फुस और subpleural वाहिकाओं के लिए दृश्य, और फेफड़े के जहाजों का केवल एक उप से पारगम्यता अनुमानों की अनुमति देता है. गहरी जहाजों के दृश्य के लिए, दो photon सूक्ष्म इमेजिंग एक संभावित विकल्प हो सकता है. डालेंप्रतिगामी दिशा में venules और केशिकाओं में बाएं आलिंद प्रवेशनी सीमा लेनी माध्यम Microcatheter के आयन. इस सीमा को नकारना एक संभव तरीके से फेफड़े के धमनी प्रवेशनी के माध्यम से कैथेटर डालने के लिए किया जाएगा. इस वैकल्पिक प्रक्रिया के लिए आवश्यक केवल संशोधन फेफड़ों इनलेट ओर कैथेटर के लिए एक विस्तार ट्यूबिंग देते है.

इन प्रक्रियाओं एक मॉडल के रूप में चूहे फेफड़ों का उपयोग कर विकसित किया गया था. हालांकि, कुछ मामूली संशोधनों के साथ एक ही कदम माउस फेफड़ों microvessels में पारगम्यता परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. माउस फेफड़ों के प्रयोगों के लिए, एगोनिस्ट और दरियाफ्त perfusate को जोड़ा जा सकता है और पारगम्यता चूहा फेफड़ों के लिए उस के रूप में समान मात्रा. इसके अलावा, एक अलग प्रतिदीप्ति ट्रेसर उपयोगकर्ता के माइक्रोस्कोप की क्षमताओं के अनुरूप करने के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है. dextran अणु के आकार एगोनिस्ट प्रेरित पारगम्यता वृद्धि की उम्मीद की भयावहता के आधार पर बदला जा सकता है और निर्णय लिया जाना चाहिएप्रारंभिक प्रयोगों से डेटा पर आधारित है. इस प्रकार, कुल मिलाकर एक साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ पृथक फेफड़ों तैयारी अली के मानक पशु मॉडल में एक पोत पारगम्यता निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

पढ़ाई केपी को एनआईएच HL75503 द्वारा समर्थित थे.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tygon Tubing Fisher Scientific #18
Pressure Transducer Data Sciences International P23XL Need quantity 3
Butterfly Needle Greiner Bio-One 450081 21 G
Peristaltic pump Cole Parmer Masterflex L/S
PE-90 tubing Becton Dickinson 427421 30 cm needed
PE-10 tubing Becton Dickinson 427401 40 cm needed
Syringe Pump Braintree Scientific BS8000
O-ring Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure O-ring to holder
Upright fluorescence microscope Olympus America BX61WI
Image Acquisition Software Molecular Devices Metamorph
FITC Dextran 20KD Sigma Aldrich 0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values) 
Lipopolysaccharide Sigma Aldrich Serotype 0111:B4

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References

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