मानव डबल ढाल centrifugation द्वारा Monocytes और Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग में मैक्रोफेज के लिए उनके भेदभाव का अलगाव

Immunology and Infection
 

Summary

हम मानव मैक्रोफेज की पीढ़ी के लिए एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. बफी कोट डबल घनत्व ढाल centrifugation द्वारा संसाधित कर रहे हैं और अलग monocytes तो Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग में मैक्रोफेज के लिए भेदभाव कर रहे हैं. इस बृहतभक्षककोशिका पैदावार अधिकतम और बाद के प्रयोगों के लिए सेल कटाई की सुविधा.

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Menck, K., Behme, D., Pantke, M., Reiling, N., Binder, C., Pukrop, T., Klemm, F. Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags. J. Vis. Exp. (91), e51554, doi:10.3791/51554 (2014).

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Abstract

मानव मैक्रोफेज संक्रामक रोगों से कैंसर से लेकर वैकृत प्रक्रियाओं के ढेर में शामिल कर रहे हैं. इस प्रकार वे इन रोगों के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण मुद्रा. इसलिए हम उच्च बृहतभक्षककोशिका पैदावार में जो परिणाम एक भेदभाव प्रक्रिया द्वारा पीछा बफी कोट से मानव monocytes, के अलगाव के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. तकनीक आमतौर पर उपलब्ध प्रयोगशाला उपकरणों पर ज्यादातर निर्भर करता है और इस प्रकार मानव मैक्रोफेज की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए एक समय और लागत प्रभावी तरीका प्रदान करता है. संक्षेप में, स्वस्थ रक्त दाताओं से बफी कोट परिधीय रक्त से monocytes फसल के लिए एक डबल घनत्व ढाल centrifugation के अधीन हैं. ये monocytes बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम सीएसएफ) की उपस्थिति में fluorinated ईथीलीन Propylene (FEP) Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग में तो सुसंस्कृत हैं. विभेदित मैक्रोफेज आसानी से काटा और बाद में अध्ययन और के रूप में कार्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैकहते हैं. गुणवत्ता नियंत्रण और अलगाव और भेदभाव चरणों की मान्यता के लिए महत्वपूर्ण तरीकों प्रोटोकॉल के भीतर प्रकाश डाला जाएगा. संक्षेप में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल नियमित और reproducibly लागत गहन उपकरणों की आवश्यकता के बिना मानव मैक्रोफेज अलग करने के लिए वैज्ञानिकों को सक्षम बनाता है. इसके अलावा, रोग मॉडल murine मैक्रोफेज का उपयोग circumventing एक syngeneic मानव प्रणाली में अध्ययन किया जा सकता है.

Introduction

मैक्रोफेज - - monocytic वंश और उनके टर्मिनली विभेदित व्युत्पन्न से कोशिकाओं के विकास, ऊतकों की मरम्मत, और प्रतिरक्षा 1 जैसे विभिन्न प्रक्रियाओं में उनकी भागीदारी के लिए अग्रणी, उनके जैविक समारोह के संबंध में एक हड़ताली plasticity दिखा रहे हैं. बाद के उनके phagocytic और सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 2 के बीच चौराहे पर मैक्रोफेज स्थानों जो प्रतिजन पेश की क्षमता की वजह से है. हालांकि, उनकी क्षमता साइटोकिन्स, chemokines, वृद्धि कारक है, और अन्य संकेतन अणुओं छिपाना 1 उनकी प्रतिरक्षा modulatory समारोह augments बल्कि उनके अतिरिक्त कार्यों के लिए एक आधार के रूप में कार्य करता है न केवल. एम 1 और M2 श्रेणियों 3 में हुई है गैर माइक्रोबियल मध्यस्थता की स्थिति के संदर्भ में इन विविध सक्रियण चरणों दर्पण प्रयास करता है. इस वर्गीकरण पूरा नहीं हुआ है, वहीं यह बृहतभक्षककोशिका जीव विज्ञान की एक बुनियादी समझ के लिए अनुमति देता है.

इन बहुमुखी क्षमताओं के कारण यह मैक्रोफेज किसी तरह से ऊतक remodeling या सूजन शामिल है कि कई शर्तों के साथ जुड़े रहे हैं कि कोई आश्चर्य के रूप में आता है. हमलावर रोगजनकों 4-6 की मान्यता और निकासी में उनके मौलिक भूमिका के आगे, मैक्रोफेज तेजी atherosclerosis, फाइब्रोसिस, मोटापा, और कैंसर 7-10 में फोकस में आ गए हैं. मानव मैक्रोफेज की पीढ़ी के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि इन विकृतियों को समझने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम पहले 11 में वर्णित के रूप में एक डबल घनत्व ढाल centrifugation तकनीक से स्वस्थ दाताओं की परिधीय रक्त से मानव monocytes के अलगाव पर आधारित एक विधि प्रस्तुत करते हैं. मैक्रोफेज की ओर भेदभाव सुविधाजनक बनाने के लिए, अलग monocytic कोशिकाओं एम सीएसएफ और सामान्य मानव सीरम 12 की कम मात्रा की उपस्थिति में incubated हैं. आगे से निपटने और सेल फसल को कम करने के लिए, भेदभाव गैस पारगम्य FEP में किया जाता हैएक हाइड्रोफोबिक सतह 12-15 के साथ Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग. वे अभी भी या तो एक एम 1 या M2 की तरह फैशन में जवाब देने में सक्षम हैं के रूप में जिसके परिणामस्वरूप आराम मैक्रोफेज assays की एक विस्तृत श्रृंखला के अधीन किया जा सकता है. ऐसे चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस) या केन्द्रापसारक धावन (सीसीई) counterflow रूप monocyte अलगाव और बाद में भेदभाव के वैकल्पिक तरीकों की आवश्यकता उपज, लागत, और समय के बारे में कुछ सीमाएं हैं. इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल यह विशेष अभिकर्मकों (जैसे, चुंबकीय मोती एमएसीएस) या डिवाइस (जैसे, सीसीई तंत्र) के लिए आवश्यकता के बिना मानक प्रयोगशाला के उपकरण के साथ किए गए और कोशिकाओं की बड़ी मात्रा के प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है कि हो सकता है लाभ प्रदान करता है.

Protocol

बाँझ मानव अटल बिहारी सीरम की 1. तैयारी

  1. ताजा जमे हुए प्लाज्मा (FFP) के 4-5 बैग ले लीजिए. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर बैग पर्याप्त बैग एकत्र किया गया है जब तक.
  2. बैग पिघलना और पूरक निष्क्रिय और आतंच दूर करने के लिए एक पानी के स्नान में 56 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. अच्छी तरह से बैग के बाहर कीटाणुरहित और 50 मिलीलीटर ट्यूब को प्लाज्मा हस्तांतरण.
  4. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 3000 XG पर अपकेंद्रित्र अवक्षेप और अवशिष्ट प्लेटलेट्स से छुटकारा पाने के लिए.
  5. सभी supernatants पूल और छर्रों त्यागें.
  6. विभाज्य सीरम 15 मिलीलीटर ट्यूब में नमूने और दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर.
    नोट: वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध गर्मी निष्क्रिय सामान्य मानव अटल बिहारी सीरम का इस्तेमाल किया जा सकता है.

Monocytes के 2 अलगाव

अपकेंद्रित्र के संतुलन की सुविधा के लिए, यह समानांतर में दो बफी कोट पर कार्रवाई की सिफारिश की है. हालांकि, सीए लेकोशिकाओं मिश्रण करने के लिए प्रत्येक दाता के लिए अलग सामग्री का उपयोग और नहीं करने के लिए कर रहे हैं. मामले में बफी कोट आसानी से प्राप्त नहीं किया जा सकता है, heparinized परिधीय रक्त की 400 मिलीलीटर के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. ध्यान बफी कोट युक्त प्लास्टिक की थैलियों कीटाणुरहित और दो 50 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए प्रत्येक बफी कोट की सामग्री हस्तांतरण.
  2. प्रत्येक बफी कोट के लिए 15 मिलीलीटर Ficoll समाधान (1.077 ग्राम / एमएल) के साथ तीन 50 मिलीलीटर ट्यूब भरना. Ficoll तैयारी के लिए कमरे के तापमान पर होना चाहिए.
  3. परत पहली घनत्व ढाल के लिए Ficoll समाधान के शीर्ष पर बफी कोट रक्त का 30-35 मिलीलीटर. दोनों परतों मिश्रण को रोकने के क्रम में धीरे धीरे और सावधानी से ऐसा करने के लिए सावधान रहें.
  4. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ब्रेक के बिना 400 XG पर अपकेंद्रित्र.
  5. प्रत्येक ढ़ाल के लिए एक 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट और हस्तांतरण के साथ दो चरणों के बीच स्थित है, जो परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) के सफेद अंगूठी इकट्ठा.
  6. कुल में 40 मिलीलीटर अप करने के लिए पीबीएस EDTA (1 मिमी) के साथ प्रत्येक ट्यूब भरें.
  7. कमरे के तापमान पर ब्रेक के बिना 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र.
  8. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 40 मिलीलीटर पीबीएस EDTA (1 मिमी) के साथ फिर से गोली धोने.
  9. प्रत्येक दाता पूल के लिए फिनोल 10 + लाल% एफसीएस बिना 20 एमएल RPMI 1640 में हिमपात.
  10. दूसरा घनत्व ढाल के लिए आईएसओ आसमाटिक Percoll समाधान तैयार: दो दाताओं 23.13 मिलीलीटर Percoll समाधान मिश्रण के लिए (घनत्व: 1.131 ग्राम / मिलीलीटर) एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में से 1.87 मिलीग्राम 10 गुना पीबीएस. फिर एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए इस समाधान के 23 मिलीलीटर हस्तांतरण और एक 46% आईएसओ आसमाटिक Percoll समाधान प्राप्त करने के लिए फिनोल 10 + लाल% एफसीएस साथ 27 एमएल RPMI-1640 जोड़ें. Percoll तैयारी के लिए कमरे के तापमान पर होना चाहिए.
  11. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए तैयार Percoll समाधान के 25 मिलीलीटर प्रत्येक दाता हस्तांतरण के लिए और Percoll समाधान के शीर्ष पर 2.9 में तैयार PBMC समाधान) परत. बहुत धीरे से एक यह करने के लिए सावधान रहेंघ ध्यान से, दोनों परतों को आसानी से मिश्रण करने के लिए करते हैं. सही ढंग से किया, तो दो चरणों के कारण रंग में उनके अंतर को प्रतिष्ठित किया जा सकता.
  12. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ब्रेक के बिना 550 XG पर अपकेंद्रित्र.
  13. प्रत्येक ढ़ाल के लिए एक 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट और हस्तांतरण के साथ दो चरणों के बीच स्थित है जो monocytes की सफेद अंगूठी इकट्ठा.
  14. कुल में 50 मिलीलीटर अप करने के लिए पीबीएस EDTA (1 मिमी) के साथ प्रत्येक ट्यूब भरें.
  15. कमरे के तापमान पर ब्रेक के बिना 10 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र.
  16. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और फिनोल 10 + लाल% एफसीएस के साथ 20 एमएल RPMI 1640 में छर्रों resuspend.

मैक्रोफेज को monocytes के 3 भेदभाव

  1. Trypan नीले रंग में एक 1:10 कमजोर पड़ने में पृथक monocytes की संख्या निर्धारित करते हैं. केवल monocytes हैं जो बड़े, अक्सर अनियमित आकार का सेल, गिनती. लिम्फोसाइटों हैं जो छोटे, गोल आकार की कोशिकाएं भरोसा मत करो.
    एनOTE: Monocyte संख्या वे केवल कोशिकाओं के भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया जाना है कि कितने और FEP Teflon में लिपटे जो (छोटे या बड़े) बैग के बारे में एक संकेत दे क्योंकि बहुत सही ढंग से निर्धारित किया जा की जरूरत नहीं है.
  2. एक दाता से 1.0-1.5 एक्स 10 8 monocytes के लिए, एक बड़े FEP Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग में कोशिकाओं बीज. प्रत्येक बैग के लिए 174 एमएल RPMI-1640, (धारा 1 में तैयार के रूप में) 2% मानव अटल बिहारी सीरम, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2.5 एनजी / एमएल एम सीएसएफ (180 मिलीलीटर कुल मात्रा) से मिलकर संस्कृति के माध्यम तैयार करते हैं.
    1. एक दाता से 3.0-5.0 10 x 7 monocytes के लिए, एक छोटे से Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग में कोशिकाओं बीज. प्रत्येक बैग के लिए संस्कृति मध्यम 28.5 मिलीलीटर RPMI-1640, (धारा 1 में तैयार के रूप में) 2% मानव अटल बिहारी सीरम, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2.5 एनजी / एमएल एम सीएसएफ (: 30 मिलीलीटर कुल मात्रा) से मिलकर तैयार करते हैं.
      नोट: उदाहरण के लिए, 8.0 10 x 7 monocytes प्राप्त कर रहे हैं, तो हम TW में बीज उन्हें करने की सिफारिश4.0 x 10 7 कोशिकाओं प्रत्येक के साथ ओ छोटे मात्रा बैग. इसके बजाय एम सीएसएफ की, monocytes वैकल्पिक रूप से एक ही एकाग्रता (2.5 एनजी / एमएल) में granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) के साथ भेदभाव किया जा सकता है.
  3. तैयार मध्यम सेल निलंबन (20 मिलीग्राम) जोड़ें और ध्यान से मिश्रण. दो बैग एक दाता से तैयार कर रहे हैं, सेल निलंबन के 20 एमएल RPMI-1640 जोड़ने के लिए और फिर एक मध्यम तैयारी के लिए निलंबन का आधा जोड़ें.
  4. वैकल्पिक: monocyte तैयारी बाँझ रह गया है, तो यह निर्धारित एक रक्त अगर प्लेट पर सेल निलंबन की एक बूंद आंसू और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में सेते हैं.
  5. FEP Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग के प्लग पर सिरिंज perfusor एक 50 मिलीलीटर की म्यान कस और तैयार सेल निलंबन के साथ भरें.
  6. सिरिंज अनप्लग और बैग के बाहर शेष हवा धक्का. एक बंद शंकु के साथ बैग को बंद करें.
  7. 37 में 6-7 दिनों के लिए बैग सेते76, 5% सीओ 2 के साथ सी.

4 मैक्रोफेज हार्वेस्ट

  1. कोशिकाओं की टुकड़ी (अप करने के लिए 3 घंटा संभव है की एक ऊष्मायन) की सुविधा के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए बर्फ पर भेदभाव मैक्रोफेज साथ FEP Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग रखें. बैग की पूरी सतह बर्फ के साथ कवर किया जाता है कि सुनिश्चित करें.
  2. एक डेस्क / बोर्ड के किनारे पर कम से कम दबाव 10x के साथ बैग खींचो.
  3. ध्यान से बैग के बाहर कीटाणुरहित और समापन शंकु हटा दें.
  4. बैग के प्लग पर एक 50 मिलीलीटर सिरिंज कसो, सेल निलंबन हटाने, और 50 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण.
  5. कोशिकाओं नीचे स्पिन करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र.
  6. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और कुल में 10 मिलीलीटर RPMI-1640 + 10% एफसीएस में एक बैग से छर्रों पूल.
  7. एक hemocytometer में सेल संख्या का निर्धारण (1: 4-1: trypan नीले में 10 कमजोर पड़ने). केवल बड़े दौर कोशिकाओं गिनती.
    नोट: FEP Teflon में लिपटे बैग में मैक्रोफेज फर्क बाद, अवशिष्ट कोशिकाओं दाता पर और monocyte अलगाव की गुणवत्ता पर निर्भर करता है,, लिम्फोसाइटों जैसे हो सकता है.
  8. FEP Teflon में लिपटे बैग पुन: उपयोग करने के लिए, अवशिष्ट कोशिकाओं को हटाने के लिए 70% इथेनॉल के साथ दो बार उन्हें धोने. 50 मिलीलीटर 70% इथेनॉल के साथ उन्हें भरने और रातोंरात सेते हैं. बैग, बाँझ पीबीएस के साथ 3x नसबंदी पत्र में उन्हें लपेटो, और मानक प्रक्रियाओं का उपयोग एक आटोक्लेव में बाँझ धो लें.
    नोट: सेल संस्कृति बैग बृहतभक्षककोशिका पैदावार में बिना किसी नुकसान के कई बार reused किया जा सकता है. हालांकि, हम वे रिसाव शुरू होने से पहले 10 का उपयोग करता है के बाद बैग त्यागने का फैसला किया.
  9. RPMI-1640 + 10% एफसीएस में बाद के प्रयोगों संस्कृति मैक्रोफेज के लिए. कम सीरम सांद्रता के लिए आवश्यक हैं, तो 1% एफसीएस साथ RPMI 1640 में खेती संभव है. बीज और 3-4 घंटे के लिए सेते कोशिकाओं. इस अवधि के बाद, मैक्रोफेज सेल संस्कृति पकवान जबकि की सतह के लिए देते हैं कि ध्यान देंकिसी भी contaminating कोशिकाओं (यानी एरिथ्रोसाइट्स, लिम्फोसाइटों, और वृक्ष के समान कोशिकाओं) निलंबन में रहते हैं. गैर पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने के लिए पीबीएस के साथ कम से कम दो बार कोशिकाओं को धो लें.
  10. आगे के प्रयोगों के लिए सेल संस्कृति पकवान से सुसंस्कृत मैक्रोफेज अलग करने के लिए, ध्यान से सतह उन्हें दूर परिमार्जन. वैकल्पिक रूप से, बर्फ पर 20 मिनट के लिए व्यंजन सेते संस्कृति के माध्यम aspirate, और 1 मिलीलीटर एंजाइम मुक्त सेल हदबंदी बफर जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट ऊष्मायन के बाद, नीचे कम से कम 3 मिनट के लिए 4 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ने के लिए, और ऊपर pipetting द्वारा कोशिकाओं को अलग कर.

Representative Results

Ficoll का उपयोग कर पहली घनत्व ढाल centrifugation PBMCs (चित्रा 1 ए) यानी लिम्फोसाइटों और monocytes युक्त एक सफेद interphase पैदावार. यह एक मई Gruenwald धुंधला (लिम्फोसाइटों की विशिष्ट) एक उच्च नाभिक / कोशिका द्रव्य अनुपात दोनों से पता चलता है जो एकत्र कोशिकाओं की (आंकड़े 1 बी और सी) के माध्यम से पुष्टि की और (monocytes की विशिष्ट) bean- या अंगूठी के आकार का नाभिक किया जा सकता है. इन कोशिकाओं को फिर Percoll का उपयोग कर एक दूसरे घनत्व ढाल पर लोड कर रहे हैं, monocytes लिम्फोसाइटों से आगे अलग किया और फिर एक सफेद interphase (आंकड़े -1 डी एफ) के रूप में दिखाई दे सकता है. प्रत्येक बफी कोट के लिए वर्णित डबल घनत्व ढाल centrifugation नियमित बफी कोट प्रति 70 ± 30 x 10 6 मैक्रोफेज (चित्रा 2) के लिए भेदभाव किया जा सकता है, जो 150 ± 40 x 10 6 monocytes पैदावार. से मतलब बृहतभक्षककोशिका उपज20 स्वतंत्र तैयारी कुल पृथक monocytes के 47 ± 14% थी.

Percoll ढाल centrifugation के बाद अभी भी रक्त दाता पर और साथ ही अलगाव की प्रक्रिया की सटीकता पर निर्भर है जो तैयारी में मौजूद कुछ अवशिष्ट गैर monocytic कोशिकाओं हो सकता है. हालांकि, 6-7 दिनों के भेदभाव चरण के बाद, तैयारी मुख्य रूप से आगे होने के कारण प्लास्टिक की सतहों को उनके पालन, यादृच्छिक contaminating कोशिकाओं द्वारा साझा नहीं है कि एक सुविधा (आंकड़े 4A को समृद्ध बनाया जा सकता है जो परिपक्व मैक्रोफेज (चित्रा 3) के होते हैं और बी). एक बढ़ाया धुरी की तरह phenotype (आंकड़े 4C और डी) के साथ कोशिकाओं को भी कर रहे हैं, जबकि एक बार मैक्रोफेज के बहुमत एक शास्त्रीय "तला हुआ अंडा" आकारिकी दिखाने, चढ़ाया. यह कोशिका द्रव्य और आसंजन समूहों के भीतर उनके एफ actin वितरण से नजर आता है. विभेदित कोशिकाओंपरिपक्व मैक्रोफेज (चित्रा 5) के लिए विशिष्ट मार्करों हैं जो CD45, CD14, CD16, CD206 (mannose रिसेप्टर), CD11b की अभिव्यक्ति और CD11c की विशेषता है. CD11b की उपस्थिति कोशिकाओं वृक्ष के समान सेल मार्कर CD209 (डीसी हस्ताक्षर) के लिए नकारात्मक हैं कि इस तथ्य के द्वारा समर्थित है, जो एक मुख्य रूप से वृक्ष के समान भेदभाव के खिलाफ तर्क है.

भेदभाव प्रक्रिया के बाद कोशिकाओं कार्यात्मक और यह पूर्वाह्न धुंधला और ट्यूमर कोशिकाओं से शेड कोशिकी पुटिकाओं को लेने के लिए उनकी क्षमता calcein से देखे जा सकते हैं के रूप में लगभग 5-7 दिनों (चित्रा 6) के लिए पाचन सक्रिय रहते हैं. इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं को अभी भी कई समर्थक भड़काऊ जीनों (चित्रा 7) की अभिव्यक्ति में जो परिणाम lipopolysaccharide (LPS) के साथ उत्तेजना के लिए, दिखाया उदाहरण के रूप में सक्रिय किया जा सकता है.

चित्रा 1 डबल घनत्व ढाल centrifugation के बाद चित्रा 1 प्रकटन और PBMC- की रचना और monocyte परत. आईएसओ आसमाटिक Percoll centrifugation के बाद Ficoll ढाल और (डी) monocyte चरण के बाद (ए) PBMC बैंड illustrating तस्वीर. Cytospin (बी, सी) PBMC अंश की तैयारी और शेष (ई, एफ) monocytes की मई Gruenwald stainings. 200 बी और ई में माइक्रोन, सी और एफ में 50 माइक्रोन = स्केल बार

चित्रा 2
Monocytes और मैक्रोफेज की चित्रा 2 यील्ड. प्रतिनिधि सेल पृथक monocytes की countings और 20 बफी कोट जनसंपर्क के मैक्रोफेजeparations.

चित्रा 3
चित्रा 3 micrographs और (ए) और बाद (बी) बृहतभक्षककोशिका भेदभाव से पहले monocytes और मैक्रोफेज. Monocytic सेल निलंबन के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का सेल आकार माप. Monocytes (सी) और मैक्रोफेज (डी) के सेल आकार histograms इसी. स्केल बार = 100 माइक्रोन.

चित्रा 4
4 चित्र आकृति विज्ञान और पक्षपाती मैक्रोफेज की cytoskeletal संगठन. (ए) से पहले पक्षपाती मैक्रोफेज के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी और गैर adheren के बाद (बी) को हटानेटी कोशिकाओं. पक्षपाती, गैर उत्तेजित मैक्रोफेज में filamentous actin (सी, डी) Phalloidin-TRITC धुंधला. स्केल बार एसी में = 100 माइक्रोन, डी में 20 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा विभेदित मैक्रोफेज की 5 Immunophenotype. FEP Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग में भेदभाव के 6 दिन बाद मैक्रोफेज के प्रवाह cytometry विश्लेषण (लाल रंग में संकेत दिया). इसी निर्धारण नियंत्रण ग्रे में दिखाए जाते हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


मैक्रोफेज द्वारा ट्यूमर सेल microvesicles के 6 चित्रा तेज. PKH26 लेबल (लाल फ्लोरोसेंट) ट्यूमर सेल व्युत्पन्न microvesicles को प्रदर्शनी के बाद पक्षपाती मैक्रोफेज की micrographs. छवियाँ व्यवहार्यता डाई calcein AM इसी के साथ (ए) brightfield या (बी) साइटोसोलिक धुंधला करने overlayed कर रहे हैं. स्केल सलाखों 100 माइक्रोन =. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
7 चित्रा आईएल 1 β की upregulation, Wnt5a, TNFα, आईएल -6, एमएमपी 2, एमएमपी 7, और MT1-एमएमपी stimu के बाद24 घंटा. जीन अभिव्यक्ति के लिए LPS (100 एनजी / एमएल) के साथ मैक्रोफेज की आबादी कुल शाही सेना के नमूने (ए) और HPRT1 और GNB2L1 अभिव्यक्ति पर सामान्यीकृत से मात्रात्मक आरटी पीसीआर द्वारा मापा गया था. दिखाया मूल्यों अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में गुना परिवर्तन कर रहे हैं (, एन, ± एसडी मतलब = 5 * पी <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001). LPS उत्तेजना के तहत TNFα और आईएल -6 प्रेरण आगे (एसडी ± साधन * पी ​​<0.05) एलिसा (बी) द्वारा पुष्टि की गई.

Discussion

मैक्रोफेज सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के महत्वपूर्ण प्रेरक कोशिकाओं रहे हैं और immunomodulation, प्रतिजन प्रस्तुति और ऊतक homeostasis में महत्वपूर्ण कार्यों प्रदर्शन. कारण उनके उल्लेखनीय plasticity के लिए, वे अपने phenotype के परिवर्तन के साथ विभिन्न उत्तेजनाओं को प्रतिक्रिया करने में सक्षम हैं. बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण मार्कर का केवल 50% के आसपास सीधे मानव 16 को माउस से अनुवाद किया जा सकता दिखा रहा है कि खबरें हैं हालांकि, हालांकि बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण के बारे में डेटा की अब तक एक बहुत, murine प्रणाली में प्राप्त कर रहे हैं. इसलिए, हम महंगी सामग्री, जैसे, एमएसीएस चुंबकीय मोती या एक counterflow केन्द्रापसारक धावन डिवाइस के लिए आवश्यकता के बिना यहां पर्याप्त संख्या और पवित्रता में प्राथमिक मानव मैक्रोफेज प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.

हमारे विधि PBMCs से monocytes के अलगाव और FEP में मैक्रोफेज को उनके बाद भेदभाव पर आधारित है कम conce की उपस्थिति में सेल संस्कृति बैग Teflon में लिपटेएम सीएसएफ 11-13 की ntrations. Monocytes उत्तेजना पर, मानव में कम से कम 5 परिधीय रक्त leukocytes के 10% श्रृंगार जबकि वे निवासी ऊतक मैक्रोफेज या वृक्ष के समान कोशिकाओं से 17 अंतर जहां परिधीय साइटों के लिए भर्ती हैं. साइटोकाइन एम सीएसएफ monocyte अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है और मैक्रोफेज 18,19 करने के लिए उनके भेदभाव ड्राइव. अब तक, monocyte भेदभाव के लिए चुने गए हैं जो M-सीएसएफ सांद्रता लेकिन, हमारे प्रोटोकॉल में हम केवल 2.5 एनजी / एमएल 12 के एक मीटर सीएसएफ एकाग्रता के साथ परिपक्व मैक्रोफेज की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने में सक्षम हैं, 100 एनजी / एमएल अप करने के लिए लेकर , 20. इसके अलावा, कोशिकाओं मैक्रोफेज की टुकड़ी और परिभाषित सेल नंबर में उनके बाद बोने की सुविधा जो FEP Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग में संवर्धित कर रहे हैं. बैग में कई बार reused किया जा सकता है, यह आगे अलगाव की प्रक्रिया के लिए लागत कम हो जाती है.

इस प्रक्रिया से प्राप्त मैक्रोफेजCD45, CD14, CD11b, CD11c के लिए बेहद सकारात्मक हैं और शुद्ध, परिपक्व मैक्रोफेज 21,22 की आबादी के लिए तर्क है जो mannose रिसेप्टर CD206 की अभिव्यक्ति दिखा. विशेष रूप से उच्च CD14 अभिव्यक्ति एम सीएसएफ 23 की उपस्थिति में भेदभाव मैक्रोफेज के लिए विशिष्ट है. दूसरों को एक तला हुआ अंडा फेनोटाइप प्रदर्शन करते हुए कोशिकाओं के बोने के बाद, वे एक ठेठ धुरी की तरह आकारिकी दिखा कुछ कोशिकाओं के साथ प्लास्टिक की सतहों को एक तेज पालन प्रदर्शित करते हैं. यह अन्य लेखकों 18,22,24 से टिप्पणियों के अनुसार है.

यह एम सीएसएफ की उपस्थिति में monocyte भेदभाव M2-polarized मैक्रोफेज 16,25 की ओर जाता है कि सूचना मिली थी. हालांकि, हमारे प्रोटोकॉल से अलग मैक्रोफेज जो वे समर्थक की प्रेरण के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए अभी भी ट्यूमर कोशिकाओं 26,27 या LPS के लिए जोखिम के साथ ट्यूमर सेल व्युत्पन्न microvesicles और सह संस्कृति के लिए जोखिम सहित उत्तेजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम हैं ऐसे आईएल रूप में 1 और भड़काऊ जीन# 946 ;, TNFα, Wnt5a, या एम 1-polarized मैक्रोफेज 3,5,28 के लिए विशिष्ट माना जाता है जो विभिन्न मैट्रिक्स metalloproteinases.

अंत में, तकनीकी रूप से कठिन या महंगा प्रक्रियाओं के लिए आवश्यकता के बिना डबल घनत्व ढाल centrifugation और मैक्रोफेज की उच्च संख्या में FEP Teflon लेपित सेल संस्कृति बैग परिणामों में मैक्रोफेज की ओर बाद में भेदभाव से monocytes का अलगाव. प्राप्त मैक्रोफेज ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति को LPS के माध्यम से शास्त्रीय सक्रियण से लेकर बाद के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है.

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव मौजूद खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों पिछले कुछ वर्षों के दौरान उसे हमेशा उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए श्रीमती Meike Schaffrinski धन्यवाद देना चाहूंगा.

इस काम के संयुक्त अनुसंधान समूह 942 (FOR942) के भीतर जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) के माध्यम से और चिकित्सा के संकाय, जोर्ज-August-विश्वविद्यालय के गौटिंगेन रिसर्च प्रोग्राम द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies for immunophenotyping Beckman Coulter for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)
BioLegends for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)
Axiovert 200M microscope Zeiss
Calcein AM AnaSpec 89201
Combi-stopper closing cones Braun 4495101
1x PBS, w/o Ca and Mg Pan biotech P04-36500 for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0.5 M EDTA per 500 ml PBS
10x PBS, w/o Ca and Mg Invitrogen 14200-067
EDTA (Titriplex III) Merck 1084211000 prepare a 0.5 M solution in H2O, use a sterile filter
Cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based) Gibco 13151-014
Fetal calf serum (FCS) Invitrogen 10091148 heat-inactivated
Ficoll (density 1.077 g/ml) Biochrom AG L6115
FACSCanto II BD Biosciences
Goat anti-mouse FITC santa cruz sc-2010
LPS from E.coli Sigma L8274 final conc: 100 ng/ml
Multifuge 3 L-R Heraeus
Penicillin/streptomycin Biochrom AG A2213
Percoll (density 1.131 g/ml) GE Healthcare 17-0891-02
Perfusor syringe 50 ml Braun 8728844F
Phalloidin-TRITC Sigma P1951 resuspend in methanol (c = 0.1 mg/ml)
Name Company Catalog Number Comments
Plastic disposable Pasteur pipettes LVL technologies 2655181
rh M-CSF ImmunoTools 11343117 Resuspend in 500 µl sterile H2O (c = 100 ng/µl), aliquot
RPMI-1640 with phenol red Gibco 21875-034
RPMI-1640 without phenol red Gibco 11835-063
Sterilization paper VP group 3KFKFS230116
Trypan blue stain (0.4% w/v) Sigma T8154
FEP Teflon-coated cell culture bag, small CellGenix 72-C
FEP Teflon-coated cell culture bag, large CellGenix 197-C

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References

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Comments

1 Comment

  1. Hi! First of all, I want to thank you the authors for the very detailed methodology presented here.

    You suggests this technique as a intersting substitute for the other most used approaches to isolate monocytes (i.e. magnetic beads and plastic adherence).

    I've tried this protocol to isolate monocytes for dendritic cell in vitro differentiation. I see that when you do the macrophage differentiation, you wash the non-adherent cells to increase the purity of these cells (eliminating most lymphocytes). Do you often achieve

    Reply
    Posted by: Daniel G.
    January 18, 2016 - 8:29 AM

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