जैव चिकित्सा अनुसंधान में गोजातीय फेफड़े: दिखने गाइडेड ब्रोंकोस्कोपी, Intrabronchial टीका और

Medicine
 

Summary

यह लेख प्रयोगात्मक शर्तों के तहत गोजातीय फेफड़ों में bronchoscopic तकनीक, यानी bronchoscopically निर्देशित टीका, ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना, ब्रोन्कियल ब्रशिंग, और transbronchial फेफड़ों बायोप्सी का वर्णन करता है.

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Prohl, A., Ostermann, C., Lohr, M., Reinhold, P. The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques. J. Vis. Exp. (89), e51557, doi:10.3791/51557 (2014).

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Abstract

सांस की दवा के अनुसंधान में वैकल्पिक पशु मॉडल के लिए एक सतत खोज है. शोध के लक्ष्य पर निर्भर करता है, फेफड़े के रोग के मॉडल के रूप में बड़े जानवरों अक्सर चूहों की तुलना में ज्यादा बेहतर मानव फेफड़ों की स्थिति के समान है. बड़े जानवरों के साथ काम करना भी जानवरों के त्याग के बिना लंबे समय तक अध्ययन की अनुमति देता है, जो समय की एक निश्चित पाठ्यक्रम पर बार बार एक ही जानवर नमूना करने का अवसर प्रदान करता है.

उद्देश्य एक सांस क्लैमाइडिया psittaci संक्रमण का एक गोजातीय मॉडल में इस्तेमाल के लिए vivo में नमूने के तरीकों की स्थापना के लिए किया गया था. सैम्पलिंग अध्ययन के दौरान प्रत्येक जानवर में विभिन्न बिंदुओं पर समय से किया जाना चाहिए, और नमूने प्रयोगात्मक परिस्थितियों में मेजबान प्रतिक्रिया है, साथ ही रोगज़नक़ अध्ययन करने के लिए उपयुक्त होना चाहिए.

ब्रोंकोस्कोपी मानव और पशु चिकित्सा में एक मूल्यवान नैदानिक ​​उपकरण है. यह एक सुरक्षित और न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया है. इस ArticLe intrabronchial बछड़ों का टीका के साथ ही कम श्वसन तंत्र के लिए नमूने विधियों का वर्णन है. Videoendoscopic, intrabronchial टीका सभी टीका पशुओं में बहुत संगत नैदानिक ​​और रोग निष्कर्ष की ओर जाता है और है, इसलिए, संक्रामक फेफड़ों की बीमारी के मॉडल में इस्तेमाल के लिए अच्छी तरह से अनुकूल. वर्णित नमूना तरीकों ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना, ब्रोन्कियल brushing और transbronchial फेफड़ों बायोप्सी हैं. इन सब के सब मानव चिकित्सा में मूल्यवान नैदानिक ​​उपकरण हैं और 6-8 सप्ताह की आयु के बछड़ों को प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. प्राप्त नमूनों की मेजबानी में फेफड़ों की सूजन की गंभीरता का रोगज़नक़ लक्षण और पहचान दोनों के लिए उपयुक्त थे.

Introduction

बायोमेडिकल रिसर्च में बड़े पशु मॉडल का मान

आधुनिक अंतःविषय जैव चिकित्सा अनुसंधान में, पशु मॉडल अभी भी जटिल संबंधों को स्पष्ट करने के लिए अपरिहार्य हैं - स्वास्थ्य या एक रोग की स्थिति से संबंधित - स्तनधारी जीवों के भीतर. अध्ययन के कम से कम 1% घरेलू पशुओं के साथ काम कर रहे हैं, जबकि जैव चिकित्सा अनुसंधान 1 के लिए मॉडल के रूप में पशु, घोड़े, भेड़, या मुर्गी का अध्ययन किया कि वैज्ञानिकों को सम्मानित किया जा रहा 17 नोबेल पुरस्कार के बावजूद, पशु प्रयोगों की आजकल विशाल बहुमत, मूषक के साथ शुरू कर रहे हैं या पशुधन.

छोटे जानवरों कई व्यावहारिक लाभ (यानी कम लागत, आनुवंशिक बढ़ने की योग्यता, उच्च throughput, कई आनुवंशिक की उपलब्धता, और immunologic उपकरण और किट) प्रदान करते हैं, और आनुवंशिक रूप से संशोधित murine मॉडल आम तौर पर विशेष आणविक मार्ग की खोज यंत्रवत अध्ययनों प्रदर्शन करने के लिए स्वीकार कर रहे हैं. जटिल प्रणाली, टी के जैव चिकित्सा अनुसंधान मेंवह जैविक प्रासंगिकता और चूहों मॉडल के नैदानिक ​​उपयोगिता अधिक से अधिक संदिग्ध होता जा रहा है. वे गुमराह किया और जैविक जटिलता 2-9 की अति सरलीकरण के जोखिम को सहन कर सकता है.

कारण अंतर - प्रजाति peculiarities करने के लिए, कोई भी पशु प्रजातियों पूरी तरह से मानव की स्थिति दर्पण होगा, और एक से अधिक मॉडल का उपयोग एक अंतःविषय जैव चिकित्सा अनुसंधान दृष्टिकोण में लाभकारी हो रहा है. Translational चिकित्सा के संदर्भ में, बड़े जानवरों मानव और पशु दोनों स्वास्थ्य 1 के लिए दोहरे उपयोग की उच्च जैविक प्रासंगिकता के साथ परिणाम प्रदान करने के रूप में तुलनात्मक मॉडल की सेवा करने का अवसर प्रदान करते हैं. उल्लेखनीय है, मानव जीनोम और अधिक बारीकी से प्रयोगशाला कृन्तकों के जीनोम की तुलना में गोजातीय जीनोम से मची है. यह भी अन्य taxa की तुलना में चूहों के जीनोम बहुत अधिक 10-12 पुन: व्यवस्थित है, कि हाल ही में पुष्टि की गई है.

एक जटिल अध्ययन डिजाइन में, पशुओं के उपयोग uniq प्रदान करता हैपशु त्याग के बिना एक और एक ही individuum से विवो में नमूनों की एक किस्म के दोहराया संग्रह द्वारा इंट्रा व्यक्ति, लंबे समय तक अध्ययन के UE अवसर. इसलिए, कार्यात्मक भड़काऊ और morphological परिवर्तन समय 13 साल की एक निश्चित अवधि में एक ही विषय में नजर रखी जा सकती है.

एक उपयुक्त श्वसन मॉडल के रूप में गोजातीय फेफड़े

कारण फेफड़ों के शरीर रचना विज्ञान, श्वसन फिजियोलॉजी, और फेफड़े इम्यूनोलॉजी में काफी अंतर की उच्च संख्या के लिए, चूहों मानव फेफड़े के रोग के कई महत्वपूर्ण pathophysiological पहलुओं को पुन: पेश नहीं करते. सांस की बीमारी 2,9,14-16 के पशु मॉडल के रूप में प्रयोग करते हैं तो यह ध्यान में रखा जाना चाहिए. शरीर रचना और संरचना के peculiarities प्रत्येक स्तनधारी फेफड़ों के लिए मौजूद नहीं है, कार्यात्मक विशेषताओं (यानी फेफड़ों की मात्रा, airflows और श्वसन यांत्रिकी) की वजह से इसी तरह शरीर के वजन को वयस्क मनुष्यों और बछड़ों के बीच बेहतर तुलना कर रहे हैं(50-100 किलो).

इस प्रकार के रूप गोजातीय फेफड़ों की प्रजाति विशेष विशेषताओं संक्षेप हैं: बाएं फेफड़े (दो खंडों में विभाजित है, और lobus caudalis है जो lobus cranialis,) दो पालियों के होते हैं, सही फेफड़ों चार पालियों के होते हैं जबकि (lobus cranialis, lobus medius, lobus caudalis, और lobus न्यूनतापूरक अथवा सहायक). अधिकांश अन्य स्तनधारियों के फेफड़ों शरीर रचना विज्ञान के विपरीत, श्वासनली की सही पार्श्व की ओर से सीधे सही कपाल पालि शाखाओं के श्वसनी. शरीर रचना subgross के लिए सम्मान के साथ, गोजातीय फेफड़ों lobulation के एक उच्च डिग्री और एक अपेक्षाकृत कम विशिष्ट फेफड़ों के अनुपालन के लिए अग्रणी बीचवाला ऊतक 17,18 के एक उच्च प्रतिशत और एक उच्च फेफड़े के ऊतकों प्रतिरोध 19 प्रस्तुत करता है. इसलिए, आवश्यक सांस लेने गतिविधि अन्य प्रजातियों 20,21 की तुलना में बल्कि उच्च है. lobulation के उच्च स्तर के क्षेत्रों की स्वतंत्रता की ओर जाता है. इस प्रकार, inflammatory प्रक्रियाओं संयोजी ऊतक SEPTA द्वारा सीमित हैं, और रोगग्रस्त और स्वस्थ क्षेत्रों अक्सर एक ही पालि भीतर झूठ बोलते हैं. कारण जमानत के वायुमार्ग की कमी के कारण, गोजातीय फेफड़ों विशेष रूप से प्रतिरोधी फेफड़े के रोग 13 दर्पण के लिए अनुकूल है. गोजातीय फेफड़ों में वाहिका संरचना के बारे में, छोटे फेफड़े धमनियों बहुत प्रमुख चिकनी पेशी परतों दिखा. इसलिए, बछड़ा भी 22-24 remodeling फेफड़े के उच्च रक्तचाप या नाड़ी की एक अच्छी तरह से स्थापित पशु मॉडल के रूप में सेवा कर सकता है.

श्वसन संक्रमण के संबंध में, स्वाभाविक रूप से होने वाली बीमारियों के आदमी की तुलना में रोग के साथ कई समानताएं है कि पशुओं में मौजूद हैं. विशिष्ट उदाहरण गोजातीय क्षयरोग 25, सांस syncytial वायरस बछड़ों 26-28 में (आरएसवी) संक्रमण, या स्वाभाविक रूप से प्राप्त कर लिया क्लैमाइडिया संक्रमण 29 हैं. इस प्रकार, बड़े पशु मॉडल बारीकी से प्राकृतिक मेजबान में स्थिति सदृश है. इसलिए, वे सबसे usef हैंउल मेजबान रोगज़नक़ बातचीत और मनुष्य 30,31 में इसी रोग की जटिल pathophysiology के अध्ययन के लिए.

श्वसन क्लैमाइडिया psittaci संक्रमण का एक जैविक रूप से प्रासंगिक मॉडल के रूप में, बछड़ों bovines इस रोगज़नक़ 32-35 के लिए प्राकृतिक मेजबान प्रतिनिधित्व के बाद से चुने गए हैं. पशुओं और मनुष्यों के बीच रोग या संभव संचरण मार्गों के रोगजनन के लिए सम्मान के साथ, इस मॉडल से प्राप्त जानकारी, पशु और मनुष्य दोनों के लिए प्रभाव के साथ हमारे ज्ञान को व्यापक करने में मदद मिलेगी. मॉडल भी फेफड़े सी. के उन्मूलन के लिए आम तौर पर स्वीकार किए जाते हैं और वैकल्पिक उपचार के विकल्प को सत्यापित करने के लिए मदद कर सकते हैं दोनों पशु चिकित्सा और मानव चिकित्सा में ब्याज की फिर से, जो psittaci संक्रमण,.

गोजातीय श्वसन प्रणाली से और नमूनों प्राप्य करने के लिए तकनीक लागू

यह कागज का वर्णन करता है और तकनीकों और निदान विधियों दिखाता applicablगोजातीय फेफड़ों को ई और स्तनधारी फेफड़ों और चिकित्सकीय हस्तक्षेप की प्रभावकारिता पर रोगज़नक़ के दोनों प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए हमारे मॉडल में इस्तेमाल किया.

ब्रोंकोस्कोपी 1960 के दशक के बाद से मानव चिकित्सा में प्रदर्शन किया गया है और एक सुरक्षित प्रक्रिया 36 में माना जाता है. बछड़ों में, प्रयोगात्मक ब्रोंकोस्कोपी पहली बार 37 के लिए 1968 में वर्णित किया गया था. रोगजनकों के intrabronchial आवेदन Potgieter एट अल द्वारा सुझाव दिया गया था. एक विश्वसनीय विधि बछड़ों 38 में कम श्वसन तंत्र की बीमारी का उत्पादन और अब गोजातीय अनुसंधान 34,39,40 में एक व्यापक तरीका है के रूप में. Videoendoscopic नियंत्रण में रोगज़नक़ का एक निर्धारित राशि के Intrabronchial टीका फेफड़ों में संक्रामक एजेंट के चुनिंदा प्लेसमेंट के लिए अनुमति देता है. यह सभी जानवरों 34 में लगातार नैदानिक ​​और रोग निष्कर्ष की ओर जाता है और कारण रोगज़नक़ जोखिम को परिवर्तित करने की उम्मीद कर रहे हैं कि फेफड़ों के क्षेत्रों के लक्षित नमूना की अनुमति देता है.

ब्रोन्कोएल्वियोलर lavage द्रव (BALF) फेफड़ों की सूजन की उपस्थिति गंभीरता के लिए एक अच्छी तरह से वर्णित सूचक है. ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) सांस की बीमारियों 41 की एक किस्म के निदान के लिए मानव चिकित्सा में एक मानक प्रक्रिया है. जीना पशु में, बाल पिछली सदी के 42 के देर से सत्तर के दशक में Wilkie और Markham द्वारा शुरू की गई थी. यह पशु के निचले श्वसन तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक सुरक्षित और repeatable तकनीक माना जाता था. कारण एक लचीला fiberoptic श्वसनीदर्शी साथ स्वस्थ बछड़ों पर 1988 प्रिंगल एट अल. प्रदर्शन किया बाल में स्वस्थ पशुओं में BALF मानकों पर पर्याप्त डेटा की कमी के कारण. लेखकों को भी तुलनीय परिणाम 43 प्राप्त करने के लिए प्रयोगात्मक शर्तों के तहत बाल प्रोटोकॉल मानकीकरण करने की जरूरत बताया. बाल अभी बछड़ों 44-46 में एक Vivo में नमूना पद्धति के रूप में प्रयोग किया जाता है.

ब्रोन्कियल ब्रशिंग आमतौर पर एक के रूप में मानव चिकित्सा में प्रयोग किया जाता हैneoplastic घावों या सूक्ष्मजीवविज्ञानी विश्लेषण 36 के लिए नमूने के लिए नैदानिक ​​उपकरण. अनुसंधान प्रयोजनों के लिए, कोशिकीय ब्रशिंग से काटा उपकला कोशिकाओं के प्राथमिक सेल संस्कृतियों 47 प्राप्त किया जा सकता है. पशुओं में, सूक्ष्मजीवविज्ञानी विश्लेषण के लिए ब्रोन्कियल brushings का उपयोग फेफड़ों 43 की माइक्रोबियल पर्यावरण को चिह्नित करने के लिए वर्णित किया गया है.

Transbronchial फेफड़ों बायोप्सी फेफड़े के ऊतकों के नमूनों प्रदान करता है और मानव में फेफड़ों के रोगों फैलाना के लिए एक मूल्यवान नैदानिक ​​उपकरण है. Iatrogenic वातिलवक्ष और प्रक्रिया संबंधी नकसीर इस तकनीक से संबंधित जटिलताओं हैं. उनकी घटना मानव रोगियों में 48 में कम से कम एक प्रतिशत होने की सूचना है. Transbronchial फेफड़ों बायोप्सी आवश्यक उपकरणों की उच्च लागत और बायोप्सी प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय के कारण पशुओं में इस्तेमाल के लिए एक आम तरीका नहीं है. इसके बजाय, transcutaneous फेफड़ों बायोप्सी क्षेत्र की स्थिति 49-51 के तहत और अधिक सुविधाजनक हैं.

Protocol

आचार विवरण
इस अध्ययन से पशु की देखभाल और उपयोग के लिए यूरोपीय और राष्ट्रीय कानून के साथ सख्त अनुसार किया गया था. प्रोटोकॉल थुरिंगिया राज्य, जर्मनी (: 04-004/11 परमिट नंबर) में पशु प्रयोगों की नैतिकता और पशु के संरक्षण पर समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था. सभी प्रयोगों पशु संरक्षण के लिए अधिकृत संस्थागत एजेंट की देखरेख में प्रदर्शन किया गया. ब्रोंकोस्कोपी सख्ती से सामान्य संज्ञाहरण के तहत किया गया था. अध्ययन के दौरान हर संभव प्रयास परेशानी या पीड़ा कम करने के लिए बनाया गया था.

सामान्य अभिप्राय
वर्णित तकनीकों के बारे में 60-80 किलो वजन, उम्र के लगभग 6-8 सप्ताह के बछड़ों के लिए विकसित किया गया है. अन्य बड़े जानवरों की प्रजातियों या उम्र और वजन में अलग बछड़ों में उपयोग के लिए, तकनीक आकार और वजन फिट और खाते में विशेष जानवरों की प्रजातियों के फेफड़ों शरीर रचना लेने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. सबउपकरणों का इस्तेमाल किया बाँझ होना चाहिए. क्लैमाइडिया psittaci मानव में श्वसन और सामान्य बीमारी पैदा कर सकता है, जो एक जूनोटिक जीवाणु है. गैर एवियन सी. वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता psittaci तनाव DC15 जैव सुरक्षा स्तर 2 के तहत नियंत्रित किया जाना चाहिए. रोगज़नक़ के साथ और संक्रमित जानवरों के साथ सभी काम इस तरह के एक श्वासयंत्र, एक छप पानी के सबूत jumpsuit, रबड़ के जूते और दस्ताने के रूप में, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने से किया जाना चाहिए. एक उपयुक्त श्वासयंत्र पहने हुए, बहुत महत्व का है सी. के लिए संक्रमण के प्राकृतिक मार्ग के बाद psittaci एक गैस बनाने वाला जीवाणु है. पैकेजिंग और नमूनों की लेबलिंग सब बातें पशु आवास की इकाई के रवाना होने से पहले निर्माता के निर्देशों के अनुसार Chlamydiae के खिलाफ एक कीटाणुनाशक प्रभावी के साथ इलाज किया जाना चाहिए क्योंकि कीटाणुनाशक सबूत होना चाहिए.

1. ब्रोंकोस्कोपी के लिए पशु की तैयारी

  1. निश्चेतक की खुराक के लिए बछड़े के वजन का निर्धारण.
  2. एक अंतःशिरा (चतुर्थ) का उपयोग मैं जगहn बाईं गले नस.
  3. सबसे पहले, धीरे धीरे बेहोश करने की क्रिया होने के बाद, (2.0 मिलीग्राम / किग्रा वजन) ketamine इंजेक्षन, तो लगभग 30 सेकंड से अधिक (0.2 मिलीग्राम / किग्रा वजन) xylazine इंजेक्षन.
  4. मेज पर पशु लिफ्ट और सही पार्श्व लेटना में जगह है. पशु पर्याप्त रूप से मेज पर तैनात होने के बाद चतुर्थ पहुँच जगह में अब भी है, तो जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो इसे बदल डालना. संज्ञाहरण के दौरान नियमित रूप से संज्ञाहरण की गहराई का निर्धारण करने के लिए पलक पलटा जांच ले.
  5. पशु तेजी से साँस ले रहा है एक बार, किसी ने जीभ बाहर खींच और गर्दन में खिंचाव है. मामूली घूर्णन आंदोलनों का उपयोग, पशु के मुंह में एक धातु ट्यूब वीक्षक रखें. गला दिख रहा है जब तक, एक टॉर्च का उपयोग, दृष्टि नियंत्रण में आगे वीक्षक पुश.
  6. जरूरत के रूप में 7 मिलीग्राम xylazine और 70 मिलीग्राम ketamine के एक सांस में इंजेक्शन द्वारा पूरे इंडोस्कोपिक प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखें.

2. टीका (टीका साइटें: चित्रा 1)

  • 1, 2 युक्त inoculum साथ 3 सीरिंज,, और inoculum के 5 एमएल तैयार करें.
  • एंडोस्कोप का काम कर रहे चैनल में एक Teflon ट्यूब डालें. ट्यूब एंडोस्कोप की नोक से बहर नहीं होना चाहिए.
  • धातु वीक्षक के माध्यम से एंडोस्कोप डालें. वीक्षक की मामूली readjustments गला के निधन सक्षम करने के लिए आवश्यक हो सकता है. दाएं लिए रवाना शाखाओं, मॉनीटर पर चित्र संरेखित करने में मदद करता है जो श्वसनी trachealis,.
  • Teflon ट्यूब के अंत तक 5 एमएल inoculum साथ सिरिंज देते हैं. Inoculum जमा किया जाएगा जहां शाखाओं में ट्यूब नेविगेट और वांछित राशि (सही फेफड़ों लागू: Lobus MEDIUS: 0.5 मिलीलीटर, Lobus न्यूनतापूरक अथवा सहायक: 0.5 मिलीलीटर, Lobus caudalis: 0.5 मिलीग्राम और 1.0 मिलीग्राम, बाएं फेफड़े: Lobus cranialis, cranialis Pars : 0.5 मिलीलीटर, Pars caudalis: 0.5 मिलीलीटर, Lobus caudalis: 1.5 एमएल). 1 के साथ सिरिंज संलग्न और# 160; ट्यूब मिलीलीटर inoculum, तो श्वसनी trachealis नेविगेट करने के लिए और inoculum जमा (1.0 मिलीलीटर Lobus cranialis, caudalis Pars). यह हमेशा एक ही क्रम में localizations दृष्टिकोण करने के लिए उपयोगी है.
  • एंडोस्कोप और वीक्षक निकालें.
  • एक actuator साथ प्रत्येक नथुने में inoculum के 1 मिलीलीटर स्प्रे.
  • वापस स्थिर करने के लिए पशु ले आओ और जागने के लिए प्रवण स्थिति में डाल दिया है. यह sternal अवलंबन बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक नायाब या अन्य जानवरों की कंपनी में जानवर न छोड़ें. तापमान के लिए जानवर की क्षमता सामान्य संज्ञाहरण के तहत कमी आई है के बाद से वसूली स्थिर, वातानुकूलित होना चाहिए.
    नोट: पहले नैदानिक ​​लक्षण इस्तेमाल किया रोगज़नक़ पर निर्भर करता है, टीका के बाद के बारे में 24-36 घंटे हो जाना चाहिए.
  • 3. प्रक्रिया नमूने (नमूना साइटें: चित्रा 2)

    1. कदम 1.1-1.6 में वर्णित के रूप में पशु की तैयारी.
    2. ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना
      1. एक पानी के स्नान में प्रत्येक बाँझ isotonic खारा की 20 मिलीलीटर युक्त 5 सीरिंज, जगह और उन्हें लगभग 38 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने की अनुमति
      2. एंडोस्कोप का काम कर रहे चैनल में एक पानी से धोना कैथेटर डालें, तो धातु वीक्षक में एंडोस्कोप डालने और एंडोस्कोप आगे आगे किसी भी धक्का नहीं किया जा सकता है, जहां "कील स्थिति" पर पहुँचने तक बाएं फेफड़े की मुख्य श्वसनी में आगे नेविगेट.
      3. एक के बाद एक, पानी से धोना कैथेटर को गर्म NaCl समाधान के साथ सीरिंज देते हैं, द्रव टपकाना और इसे सीधे aspirate. ब्रोन्कोएल्वियोलर lavage द्रव siliconized कांच की बोतलों में रखे और कांच की सतह के लिए संलग्न से वायुकोशीय मैक्रोफेज को रोकने के लिए तत्काल वसूली के बाद बर्फ पर रखा जाना चाहिए. डाले खारा की राशि बरामद तरल पदार्थ की मात्रा दोनों नोट.
      4. काम कर रहे चैनल से पानी से धोना कैथेटर निकालें.
    3. ब्रोन्कियल ब्रशिंग
      1. वर्णित प्रोटोकॉल में इस Bifurcatio tracheae है, वांछित नमूना स्थान पर एंडोस्कोप नेविगेट.
      2. ब्रश टिप मॉनिटर पर दिखाई देता है जब तक एंडोस्कोप का काम कर रहे चैनल में डालने से पहले ट्यूब के साथ ब्रश को कवर किया.
      3. आगे प्लास्टिक ट्यूब के साथ के बारे में 5 सेमी ब्रश पुश और संभाल धक्का द्वारा प्लास्टिक ट्यूब से यह उजागर, तो ब्रश करने की है कि स्थान पर नेविगेट.
      4. ब्रश और श्वसनी की दीवार के बीच संपर्क सुनिश्चित करने के लिए एंडोस्कोप नेविगेट जबकि धीरे आगे पीछे ब्रश धक्का और खींच द्वारा उपकला कॉल बंद रगड़ना. खून बह रहा होता है जब मलाई बंद करो. काम कर रहे चैनल से बाहर खींच से पहले ट्यूब के साथ ब्रश को कवर किया.
      5. धीरे स्लाइड पर ब्रश रोलिंग द्वारा खुर्दबीन स्लाइड पर पाँच करने के लिए स्मीयरों तैयार करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, शुष्क हवा और दुकान के लिए ठंड मेथनॉल में स्मीयरों fixate
      6. ब्रश में rinsed जा सकता हैनमूना कोशिकाओं के उद्देश्य के आधार पर विभिन्न मीडिया,. एक ही ब्रश के साथ कई brushings लेने, तो केवल श्लेष्मा झिल्ली में जलन नहीं है जो मीडिया में यह कुल्ला करना सुनिश्चित करें.
    4. Transbronchial फेफड़ों बायोप्सी
      1. वर्णित प्रोटोकॉल में इस Lobus cranialis की Pars caudalis है, वांछित नमूना स्थान पर एंडोस्कोप नेविगेट. खुले काम कर रहे चैनल में बायोप्सी संदंश डालने और इसे सुचारू रूप से काम कर रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए यह समय की एक जोड़ी को बंद करने से पहले.
      2. एक मामूली प्रतिरोध तब होता है जब तक trachealis श्वसनी की दुम शाखा में बायोप्सी संदंश पुश. वापस 2-3 सेमी खींचो संदंश खोलने, आगे के बारे में 2 सेमी धक्का, संदंश बंद, वापस खींचने के लिए और काम कर रहे चैनल से संदंश हटा दें. यह कुछ अभ्यास की आवश्यकता है.
      3. ध्यान से एक सुई या छोटे संदंश का उपयोग, बायोप्सी संदंश से ऊतक को हटा दें. ऊतक के आगे उपयोग पर निर्भर करता है, तरल nitr में यह स्टोरogen या एक उपयुक्त निर्धारण मध्यम. इस स्वलयन संबंधी अथवा स्वलयजनक प्रक्रियाओं को रोकने के लिए हटाने के बाद सही होना चाहिए.
    5. पोस्ट प्रक्रियात्मक उपचार
      1. वापस स्थिर करने के लिए पशु ले आओ और जागने के लिए प्रवण स्थिति में डाल दिया है. यह sternal अवलंबन बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक नायाब या अन्य जानवरों की कंपनी में जानवर न छोड़ें. तापमान के लिए जानवर की क्षमता सामान्य संज्ञाहरण के तहत कमी आई है के बाद से वसूली स्थिर, वातानुकूलित होना चाहिए.
      2. अगले 24 घंटे के लिए वातिलवक्ष के संकेत के लिए बारीकी से पशु मॉनिटर. पशु पूर्ण होश आ गया है जब चारा और ताजा पानी उपलब्ध कराने.

    Representative Results

    रोग के पाठ्यक्रम

    'जानवरों के स्वास्थ्य पर रोगज़नक़ के प्रभाव नैदानिक ​​परीक्षा द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. हमारे श्वसन संक्रमण मॉडल में, जानवरों दैनिक दो बार जांच की गई और नैदानिक ​​टिप्पणियों एक स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग कर दर्ज किए गए. अतिरिक्त जानकारी जैसे अन्य vivo में नमूने के तरीकों,, रक्त का संग्रह और swabs या फेफड़ों समारोह माप प्रदर्शन से कब्जा कर लिया था. टीका संक्रमण 32-34 की प्रगति का वर्णन करने के बाद रोग परीक्षाओं अलग समय बिंदुओं पर किए गए.

    BALF वसूली दर

    डाले तरल पदार्थ की वसूली दर 83.05 ± 4.58% थी (मतलब ± एसडी).

    पैथोजन जांच

    रोगज़नक़ की Recultivation ब्रोन्कियल brushings से किया जा सकता है. इसके अलावा, विभिन्न नमूनों की पीसीआर स्क्रीनिंग रोगज़नक़ पता लगाने के लिए संभव है, जैसे तिवारीssue बायोप्सी, कोशिका विज्ञान ब्रश नमूना, BALF कोशिकाओं 52 या ग्रसनी झाड़ू. रोगज़नक़ के दृश्य फेफड़ों बायोप्सी और BALF कोशिकाओं के अवसादन तैयारी के जमे हुए वर्गों के immunohistochemistry (चित्रा 3) के प्रदर्शन से संभव है. पिछले प्रयोगों में, रक्त के नमूने और swabs (नेत्रश्लेष्मला, मल, नाक) की पीसीआर प्रसार और रोगज़नक़ 32 के छप्पर को चिह्नित करने के लिए प्रदर्शन किया गया.

    फेफड़े के ऊतकों के स्थानीय सूजन के मार्करों

    BALF में, फेफड़ों की सूजन के विभिन्न मापदंडों का अध्ययन किया जा सकता है. फेफड़ों की सूजन मौजूद है जब कुल सेल गिनती और neutrophils के अनुपात आमतौर पर वृद्धि हुई है. सेल भेदभाव के लिए, BALF कोशिकाओं के अवसादन तैयारी Giemsa के अनुसार दाग और तेल विसर्जन (चित्रा 4) का उपयोग कर भेदभाव किया जा सकता है. BALF के सेलुलर और तरल अनुपात centrifugation (20 मिनट 300 XG) से अलग होती है. BALF-सतह पर तैरनेवाला फेफड़ों में सूजन प्रक्रियाओं के दौरान बदल सकते हैं और प्रयोगात्मक परिस्थितियों में अध्ययन किया जा सकता है कि विभिन्न मार्कर होता है. उदाहरण कुल प्रोटीन और eicosanoids 29,34 हैं.

    वर्णित नमूनों की संभावित आगे उपयोग का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्रा 5 में दिखाया गया है.

    चित्रा 1
    टीका साइटों (पीला) के साथ गोजातीय फेफड़ों के चित्रा 1. योजना. संख्या inoculum अलग ब्रांकाई में प्रशासित किया जाता है जिस क्रम में संकेत मिलता है. आर: सही; एल: छोड़ दिया. सही फेफड़ों: 1 Lobus MEDIUS: 0.5 मिलीग्राम, 2 Lobus न्यूनतापूरक अथवा सहायक: 0.5 मिलीग्राम, 3 Lobus caudalis: 0.5 मिलीग्राम और 4 1.0 मिलीलीटर; बाएं फेफड़े: Lobus cranialis, Pars cranialis: 0.5 मिलीलीटर, 6 Pars caudalis: 0.5 मिलीलीटर, 7 Lobus caudalis: 1.5 मिलीग्राम, 8 Lobus cranialis, Pars caudalis: 1.0 मिलीलीटर.

    चित्रा 2
    . चित्रा 2 टीका साइटों (पीला) और नमूना साइटों के साथ गोजातीय फेफड़ों की योजना:. ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (नीला), ब्रोन्कियल ब्रशिंग (हरा), और फेफड़ों बायोप्सी (नारंगी) सभी नमूनों रोगज़नक़ जमा किया गया था जहां क्षेत्रों से प्राप्त कर रहे हैं कि नोट पहले. आर: ठीक है, एल: छोड़ दिया.

    चित्रा 3
    Chl साथ inoculated एक बछड़ा से चित्रा 3. एक) फेफड़ों बायोप्सी amydia psittaci 4 दिनों टीका के बाद (डीपीआई), ख) एक बछड़ा से BALF के सेलुलर तलछट सी. के साथ inoculated psittaci 9 डीपीआई. Chlamydiae के लिए immunohistochemical लेबलिंग. Chlamydial समावेशन (तीर) फेफड़ों में (एक) और वायुकोशीय मैक्रोफेज (ख) में मौजूद हैं. Hematoxylin counterstain.

    चित्रा 4
    चित्रा 4. सी. के साथ inoculated एक बछड़ा से BALF के सेलुलर तलछट psittaci 9 डीपीआई. वायुकोशीय मैक्रोफेज (#) BALF में प्रमुख सेल प्रकार के होते हैं. भड़काऊ प्रक्रियाओं मौजूद हैं जब न्युट्रोफिल granulocytes की राशि (*) बढ़ जाती है. संशोधित Pappenheim धुंधला हो जाना.

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    चित्रा 5. नमूना तैयार करने के लिए संभावित तरीकों. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Discussion

    टीका की एक bronchoscopic विधि विकसित किया गया था और विभिन्न bronchoscopic नमूने विधियों प्रयोगात्मक परिस्थितियों में बड़े जानवरों में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुकूलित किया गया. वर्णित तकनीक भी एंडोस्कोपी में कम अनुभव के साथ परीक्षकों के लिए, जानने के लिए आसान कर रहे हैं. ब्रोंकोस्कोपी की प्रक्रिया न्यूनतम इनवेसिव है और टीका के तरीकों, साथ ही वर्णित नमूना तरीकों (बाल, transbronchial फेफड़ों बायोप्सी, ब्रोन्कियल ब्रशिंग) के साथ जुड़े कोई प्रतिकूल प्रभाव, कभी जानवरों में से किसी में देखा गया था. मानव में transbronchial फेफड़ों बायोप्सी के साथ जुड़े जटिलताओं खून बह रहा है और वातिलवक्ष 48, इनमें से कोई भी इस प्रक्रिया लिया कि बछड़ों में देखा गया था. transbronchial फेफड़ों बायोप्सी अधिक समय लगता है और transcutaneous विधि से अधिक उपकरणों की आवश्यकता है, लेकिन यह कम आक्रामक है और घाव संक्रमण के जोखिम को सहन नहीं करता है.

    inoculat की नेत्रहीन नियंत्रित, इंडोस्कोपिक विधिआयन फेफड़ों के विशिष्ट स्थलों पर रोगज़नक़ का एक निर्धारित राशि के बयान की अनुमति देता है. इस प्रकार, यह सब टीका पशुओं 32-34 में बहुत संगत नैदानिक ​​और रोग निष्कर्ष में यह परिणाम है. हालांकि, यह बछड़ों में प्राकृतिक संक्रमण की सभी सुविधाओं के समान नहीं है. एक सांस सी. के एक मॉडल में स्वाभाविक रूप से संक्रमण का अधिग्रहण बछड़ों में आमतौर पर शिखर पालियों की निमोनिया, जबकि psittaci संक्रमण, टीकाकरण की वर्णित तकनीक, रोगज़नक़ नियुक्ति 34 की साइटों के साथ जुड़े फेफड़ों के घावों के लिए नेतृत्व किया. इस तथ्य bovines में प्राकृतिक हासिल कर ली फेफड़ों में संक्रमण के संदर्भ में प्रायोगिक निष्कर्षों की प्रासंगिकता की व्याख्या जब ध्यान में रखा जाना है.

    Videoendoscopic बाल फेफड़ों का एक परिभाषित क्षेत्र नमूना की अनुमति देता है. प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए, यह अंधा शर्तों के तहत एक नाक कैथेटर का उपयोग की तुलना में एक फायदा है. कारण गोजातीय फेफड़ों की शारीरिक रचना से, आँख बंद करके डाला कैथेटर धक्का होगाज्यादातर मामलों 53,54 में सही diaphragmatic पालि के लिए एड और परीक्षक lavaged है कि फेफड़ों के क्षेत्र पर कोई प्रभाव है. पार्श्व लेटना में anesthetized बछड़ों में इंडोस्कोपिक बाल का एक अन्य लाभ यह है कि अधिक से अधिक 80% के डाले तरल पदार्थ के उच्च औसत वसूली दर है. अन्य अध्ययनों के साथ तुलना से चली आ रही है, बेहोश बछड़ों, 133.3 ± 1.6 मिलीलीटर 46 की वसूली और 127.13 ± 3.53 मिलीलीटर 45 में दुम पालि में तरल पदार्थ 240 मिली लीटर के टपकाना के बाद बताया जाता है, कि पता चलता है. बेहोश बछड़ों में sternal अवलंबन में डाले तरल पदार्थ के 51% दुम पालि 43 से कपाल पालि और 62% से बरामद किया जा सकता है. इस डाले तरल पदार्थ का लगभग आधा बछड़े की ईमानदार स्थिति में बरामद किया जा सकता है कि इसका मतलब है. आगे नमूना तैयार करने के लिए आवश्यक BALF की मात्रा पर निर्भर करता है, यह सभी वांछित प्रयोगों बाहर ले जाने के लिए पर्याप्त सामग्री नहीं छोड़ सकता. मवेशियों में बाल कई अनुसंधान समूहों द्वारा इस्तेमाल किया और कई गया हैविभिन्न मापदंडों के विभिन्न शर्तों के तहत जांच की गई है. ज्यादातर लेखकों बेसल पालियों 43,45,46 के पानी से धोना प्रदर्शन किया, लेकिन पानी से धोना के लिए इस्तेमाल तरल पदार्थ की मात्रा अनुसंधान समूहों के बीच अलग है. यह मुश्किल के विभिन्न प्रकाशनों से निष्कर्ष तुलना करने के लिए कर रही है, बरामद कोशिकाओं, प्रोटीन और अन्य पदार्थों के कमजोर पड़ने में विसंगति की ओर जाता है. इसलिए, पशुओं में इस्तेमाल के लिए इसे तुरंत टपकाना के बाद बरामद कर रहे हैं जो 20 मिलीलीटर शरीर गर्म, isotonic खारा (कुल यानी 100 मिलीलीटर), के पांच भागों के साथ पानी से धोना की सिफारिश की है. एक बड़े व्यास (यानी> 2 मिमी) के साथ एक पानी से धोना कैथेटर का उपयोग करते हैं, तो प्रत्येक अंश की मात्रा थोड़ा कैथेटर में रहेगा कि तरल पदार्थ की मात्रा पर निर्भर करता है, वृद्धि की जरूरत है.

    गोजातीय फेफड़ों के अत्यधिक खंडों शरीर रचना एक व्यवस्थित सीमा की ओर जाता है; फेफड़ों के एक भाग से प्राप्त परिणामों फेफड़ों के आराम के लिए सच नहीं हो सकता. वहाँ कोई नहीं है के बाद सेtransbronchial बायोप्सी और पानी से धोना द्वारा जांच पूरी फेफड़ों क्षेत्र की दृष्टि नियंत्रण, परीक्षक नमूना क्षेत्रों स्वस्थ या रोगग्रस्त थे कि क्या पता नहीं कर सकते. इसलिए, यह रोगज़नक़ रोगज़नक़ के एक उच्च वसूली दर है और रोगग्रस्त फेफड़ों क्षेत्रों नमूने के एक उच्च संभावना है क्रम में पहले inoculated किया गया था, जहां स्थानों नमूने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. एक और सीमा गरीब नैदानिक ​​शर्त के पशुओं में वृद्धि हुई संवेदनाहारी जोखिम है. वर्णित विधि केवल संभव के रूप में कम जानवरों के लिए बोझ रखने के लिए रोग उदारवादी हल्के के मॉडल में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. रूमेण में गैस विकास इन प्रजातियों में संवेदनाहारी खतरा बढ़ जाता है के रूप में जुगाली करने में जनरल एनेस्थीसिया हमेशा, जितना संभव हो कम रखा जाना चाहिए. पशु ब्रोंकोस्कोपी विकसित गैस की तपका अनुमति देने के तुरंत बाद प्रवण स्थिति में रखा जाना चाहिए और वे पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद कर रहे हैं जब तक बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए. इसके अलावा, वर्णित तकनीकों Suita नहीं हैंकम से कम 24 घंटे के अंतराल के नमूने लिए ble.

    वर्णित प्रोटोकॉल अन्य संक्रामक एजेंटों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. विभिन्न रोगजनकों के इंडोस्कोपिक टीका ऐसे सी के रूप में वर्णित किया गया है psittaci 32-34, पास्चरेला haemolytica 38-40,42, हेमोफिलस somni 55, और गोजातीय वायरल डायरिया वायरस 44. इसके अलावा, फेफड़ों में रोगज़नक़ जमा की साइटों वांछित मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. (मैं) नमूने साइटों टीका के स्थानों पर और उम्मीद रोग निष्कर्षों के आधार पर चुना जाना चाहिए: नमूना साइटों का चयन, कुछ महत्वपूर्ण तथ्यों को ध्यान में रखा जाना है. पोस्टमार्टम देखभाल प्रदर्शन किया जा रहा है जब (द्वितीय) पूर्व vivo नमूना लेने के लिए पर्याप्त नमूनारहित फेफड़ों क्षेत्रों छोड़ने के लिए लिया जाना चाहिए. वे उपकरणों के साथ पहुंचा जा सकता है तो (iii) नमूना साइट स्थानों से चुना जाना चाहिए. खासकर transbronchial फेफड़ों बायोप्सी के लिए, बायोप्सी संदंश की लंबाई की वजह से सीमाएं हैं. (Iv) टीवह नमूने के आदेश महत्वपूर्ण है, ब्रोन्कियल brushing और transbronchial फेफड़ों बायोप्सी BALF दूषित होता है, जो मामूली रक्तस्राव का कारण बन सकता है. इसलिए, BALF हमेशा पहले प्राप्त किया जाना चाहिए. अन्य प्रजातियों में प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, प्रजाति विशेष के फेफड़ों शरीर रचना को ध्यान में रखा जाना चाहिए.

    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Veterinary Video Endoscope Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany PV-SG 22–140 diameter: 9 mm, working channel: 2.2 mm, working length 140 cm
    Lavage catheter Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany diameter: 2 mm; length: 180 cm, Luer-lock-adapter
    Actuator WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Germany 32660 length: 60 mm
    Biopsy forceps Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany REF 60180LT 1.8 mm, serrated, oval
    Omnifix 20 ml, Luer-Lock B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4617207V
    Cytology brush mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany 110240-10 working length 180 cm, brush length: 15 mm, diameter 1.8 mm
    iv acess Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 370-211 diameter: 1.2 mm; length: 43 mm
    Rompun 2% (xylazin) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany 0.2 mg/kg bodyweight
    Ketamin 10% (ketamine) bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany 2.0 mg/kg bodyweight
    Isotonic saline solution B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 3200950
    SUB 6 waterbath CLF analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker, Germany n/a
    Metal tube speculum n/a n/a diameter: 3.5 cm; length: 35 cm
    Flashlight n/a n/a
    Siliconized glass bottles n/a n/a siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)
    Omnifix Luer 3 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616025V
    Omnifix Luer 5 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616057V
    Sealing plugs Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 900-3057
    Inoculum n/a dilute pathogen in 8 ml buffer

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