De Bovine Lung in het biomedisch onderzoek: visueel geleide Bronchoscopie, intrabronchiale Enten en

Medicine
 

Summary

Dit artikel beschrijft bronchoscopic technieken in de runder-long onder experimentele omstandigheden, dat wil zeggen een bronchoscoop begeleide inenting, bronchoalveolaire lavage, bronchiale borstelen en transbronchiale long biopsie.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Prohl, A., Ostermann, C., Lohr, M., Reinhold, P. The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques. J. Vis. Exp. (89), e51557, doi:10.3791/51557 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Er is een voortdurende zoektocht naar alternatieve diermodellen in onderzoek van de geneeskunde aan de luchtwegen. Afhankelijk van het doel van het onderzoek, grote dieren als modellen longlijden lijken vaak op de situatie van de menselijke long veel beter dan muizen doen. Werken met grote dieren biedt ook de mogelijkheid om hetzelfde dier herhaaldelijk proeven over een bepaalde loop van de tijd, die op lange termijn studies maakt zonder dat de dieren.

Het doel was om in vivo bemonsteringsmethoden voor gebruik bij een rund model van een respiratoire Chlamydia psittaci stellen. Monsternemingen op verschillende tijdstippen worden uitgevoerd in elk dier tijdens de studie en de monsters moeten geschikt zijn om de gastheer respons, evenals de pathogeen bestuderen onder experimentele omstandigheden.

Bronchoscopie is een waardevol diagnostisch instrument in de humane en veterinaire geneeskunde. Het is een veilige en minimaal invasieve procedure. Deze article beschrijft de intrabronchiale inoculatie van kalveren en bemonsteringsmethoden voor de lagere luchtwegen. Video-endoscopische, intrabronchiale inoculatie leidt tot zeer consistente klinische en pathologische bevindingen bij alle geïnoculeerde dieren en is daarom zeer geschikt voor gebruik in modellen van besmettelijke longziekte. De bemonsteringsmethoden beschreven zijn bronchoalveolaire lavage, bronchiale borstelen en transbronchiale long biopsie. Dit zijn waardevolle hulpmiddelen in de menselijke geneeskunde en kan worden aangepast voor experimentele doeleinden kalveren 6-8 weken oud. De verkregen monsters werden geschikt voor detectie van pathogenen en karakterisering van de ernst van longontsteking in de gastheer.

Introduction

De waarden van de grote huisdieren Modellen in Biomedisch Onderzoek

In de moderne interdisciplinair biomedisch onderzoek, dierlijke modellen zijn nog steeds onmisbaar om complexe interacties te verhelderen - gerelateerd aan gezondheid of status ziekte - in zoogdieren vormt. Ondanks 17 Nobelprijzen worden uitgereikt aan wetenschappers die runderen, paarden, schapen, of gevogelte als modellen voor biomedisch onderzoek 1 bestudeerd, tegenwoordig het overgrote deel van de dierproeven worden uitgevoerd met knaagdieren, terwijl minder dan 1% van de studies werken met huisdieren of vee.

Kleine dieren bieden veel praktische voordelen (dwz lage kosten, genetische maakbaarheid, high throughput, de beschikbaarheid van een groot aantal genetische en immunologische tools en kits), en genetisch gemodificeerde muismodellen worden over het algemeen geaccepteerd om mechanistische studies ontdekken van specifieke moleculaire pathways te voeren. In het biomedisch onderzoek van complexe systemen, thij biologische relevantie en klinische bruikbaarheid van muizen modellen wordt steeds meer en meer twijfelachtig. Ze kunnen misleidend zijn en draagt ​​het risico van oversimplificatie van biologische complexiteit 2-9.

Vanwege inter-soorten eigenaardigheden, zal geen enkele diersoorten volledig spiegel van de menselijke situatie, en het gebruik van meer dan een model lijkt gunstig in een interdisciplinaire biomedisch onderzoek aanpak. In het kader van translationele geneeskunde, grote dieren bieden de mogelijkheid om als vergelijkende modellen dienen die hun resultaten met een hoge biologische relevantie van de producten voor tweeërlei gebruik voor de gezondheid van mens en dier 1. Opmerkelijk is het menselijk genoom beter leek de runderen genoom dan in het genoom van knaagdieren. Ook is recentelijk bevestigd dat, in vergelijking met andere taxa het genoom van muizen veel herschikt 10-12.

In een complexe studie ontwerp, gebruik van dierlijke biedt de unique mogelijkheid intra-individuele lange termijn studies door herhaalde verzameling van verschillende monsters in vivo ve-en-dezelfde individuum zonder dat het dier. Daarom kan functioneel, inflammatoire en morfologische veranderingen worden gevolgd hetzelfde onderwerp gedurende een bepaalde tijd 13.

De Bovine Lung als een geschikte adembescherming Model

Vanwege het grote aantal significante verschillen in anatomie long, ademhalingsfysiologie en pulmonaire immunologie, hebben muizen niet veel belangrijke pathofysiologische aspecten van menselijke longziekte reproduceren. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het ​​gebruik ervan als diermodellen van respiratoire aandoeningen 2,9,14-16. Hoewel de eigenaardigheden van de anatomie en de structuur bestaan ​​voor elke long zoogdieren, functionele kenmerken (dwz longvolumes, luchtstromen en respiratoire mechanica) zijn beter vergelijkbaar tussen volwassen mensen en kalveren als gevolg van soortgelijke lichaamsgewicht(50-100 kg).

De species-specifieke kenmerken van de runderlong worden als volgt samengevat: de linker long bestaat uit twee lobben (lobus cranialis, die is verdeeld in twee segmenten, en lobus caudalis), terwijl de rechter long bestaat uit vier lobben (lobus cranialis, lobus medius, lobus caudalis en lobus accessorius). In tegenstelling tot de long anatomie van de meeste andere zoogdieren, de bronchus van de juiste craniale lob takken rechtstreeks van de rechterzijkant van de luchtpijp. Wat anatomie subgross, runderen long weer een hoge lobulation en een hoog percentage van bindweefsel 17,18 leiden tot een relatief laag specifiek longflexibiliteit en hogere pulmonic weefsel weerstand 19. Daarom is de vereiste ademhaling is vrij hoog in vergelijking met andere soorten 20,21. De hoge lobulation leidt tot sterke onafhankelijkheid van de segmenten. Aldus inflammatory processen zijn beperkt door bindweefsel septa, en zieke en gezonde segmenten vaak binnen dezelfde kwab liggen. Vanwege het gebrek aan zekerheid luchtwegen, is de runderlong bijzonder geschikt voor obstructieve pulmonaire disfuncties 13 weerspiegelen. Wat de vasculatuur in het runderlong, de kleine longslagaders tonen prominente gladde spierlagen. Daarom kan het kalf ook dienen als een gevestigde diermodel van pulmonale hypertensie of vasculaire remodeling 22-24.

Wat luchtweginfecties, natuurlijk voorkomende ziekten bestaan ​​in vee dat veel overeenkomsten met de vergelijkbare ziekten bij de mens deelt. Typische voorbeelden zijn rundertuberculose 25, respiratoir syncytieel virus (RSV) infecties bij kalveren 26-28, of natuurlijk verworven Chlamydia infecties 29. Zo hoeft grote diermodellen sterk lijken op de situatie in de natuurlijke gastheer. Daarom zijn ze het meest USEFul voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties en de complexe pathofysiologie van de desbetreffende ziekten bij de mens 30,31.

Als biologisch relevante model van respiratoire Chlamydia psittaci infectie werden kalveren gekozen, omdat runderen vertegenwoordigen natuurlijke gastheren voor deze ziekteverwekker 32-35. Informatie verkregen uit dit model, met betrekking tot de pathogenese van de ziekte of mogelijke overdracht routes tussen dieren en mensen, zal helpen om onze kennis te verbreden met gevolgen voor zowel het vee en de mens. Het model kan ook helpen om algemeen aanvaarde en alternatieve therapeutische opties voor de eliminatie van pulmonale C. controleren psittaci infecties, die is, nogmaals, van belang zowel in de veterinaire en humane geneeskunde.

Technieken Toegepast op en Exemplaren Verkrijgbaar bij de Bovine Respiratory System

Dit artikel beschrijft en illustreert de technieken en diagnostische methoden applicable de runderlong en gebruikt in ons model zowel de effecten van het pathogeen op het zoogdier long en de effectiviteit van therapeutische interventie evalueren.

Bronchoscopie is uitgevoerd in de menselijke geneeskunde sinds 1960 en wordt beschouwd als een veilige procedure 36. Bij kalveren, werd experimenteel bronchoscopie beschreven in 1968 voor de eerste keer 37. De intrabronchiale toepassing van pathogenen werd voorgesteld door Potgieter et al.. Als een betrouwbare methode om lagere luchtwegaandoeningen bij kalveren 38 te produceren en is nu een wijdverspreide methode bij runderen onderzoek 34,39,40. Intrabronchiale inoculatie van een gedefinieerde hoeveelheid van de pathogeen onder video-endoscopische controle maakt selectieve plaatsing van de ziekteverwekker in de long. Dit leidt tot consistente klinische en pathologische bevindingen bij alle dieren 34 en maakt gerichte bemonstering van long gebieden die zouden moeten worden gewijzigd als gevolg van blootstelling aan pathogeen.

Bronchoalveolaire spoelvloeistof (BALF) is een goed beschreven indicator voor de aanwezigheid en de ernst van longontsteking. De bronchoalveolaire lavage (BAL) is een standaardprocedure in de menselijke geneeskunde voor de diagnose van verschillende ademhalingsziekten 41. In levend vee, werd BAL geïntroduceerd door Wilkie en Markham in de late jaren zeventig van de vorige eeuw 42. Het werd beschouwd als een veilige en herhaalbare techniek om het lagere ademhalingskanaal van runderen bestuderen. Vanwege het ontbreken van voldoende gegevens over BALF parameters bij gezonde dieren, in 1988 Pringle et al.. Uitgevoerd BAL op gezonde kalveren met een flexibele fiberoptische bronchoscoop. De auteurs wees ook op de noodzaak om BAL protocollen te standaardiseren onder experimentele omstandigheden tot vergelijkbare resultaten 43 te verwerven. BAL wordt nog steeds gebruikt als een in vivo sampling methode bij kalveren 44-46.

Bronchiale borstelen wordt vaak gebruikt in de menselijke geneeskunde alsdiagnostisch hulpmiddel om neoplastische laesies of voor microbiologische analyse 36 proeven. Voor onderzoeksdoeleinden, kan primaire celculturen van epitheliale cellen geoogst door cytologisch borstelen worden verkregen 47. Bij runderen is het gebruik van bronchiale poetsen voor microbiologisch onderzoek beschreven naar de microflora van de long 43 karakteriseren.

Transbronchiale longbiopt biedt longweefsel monsters en is een waardevol diagnostisch hulpmiddel voor diffuse longaandoeningen bij mensen. Iatrogene pneumothorax en-procedure gerelateerde bloedingen zijn complicaties in verband met deze techniek. De incidentie verluidt minder dan een procent bij menselijke patiënten 48. Transbrochiale longbiopt geen gemeenschappelijke methode voor het gebruik bij runderen, vanwege de hoge kosten van de benodigde apparatuur en de benodigde tijd voor biopsieën. In plaats daarvan, transcutane longbiopsieën zijn handiger onder veldomstandigheden 49-51.

Protocol

Ethiek Verklaring
Dit onderzoek is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Europese en nationale wetgeving voor de zorg en het gebruik van dieren uitgevoerd. Het protocol is op de ethiek van dierproeven en de bescherming van dieren goedgekeurd door het Comite in de deelstaat Thüringen, Duitsland (Nummer van de vergunning: 04-004/11). Alle experimenten werden uitgevoerd onder toezicht van de bevoegde institutionele Agent voor Dierenbescherming. Bronchoscopie werd strikt uitgevoerd onder algemene verdoving. Tijdens de studie, werd alles gedaan om ongemak of leed te minimaliseren.

Algemene opmerkingen
De beschreven technieken zijn ontwikkeld voor kalveren ongeveer 6-8 weken oud, gewicht 60-80 kg. Voor het gebruik in andere grote diersoorten of kalveren verschillende leeftijd en lichaamsgewicht, moet de werkwijzen worden aangepast aan de grootte en het gewicht passen en rekening houden met de long anatomie van de specifieke diersoorten. Alleapparatuur moeten steriel zijn. Chlamydia psittaci is een zoönose bacterie die respiratoire en algemene ziekte bij mensen kan veroorzaken. De niet-aviaire C. psittaci stam DC15 gebruikt in het huidige protocol moet onder bioveiligheid niveau 2 worden behandeld. Alle werkzaamheden met de ziekteverwekker en met besmette dieren moeten worden uitgevoerd dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals een masker, een spatwaterdicht jumpsuit, rubberen laarzen en handschoenen. Het dragen van een geschikt masker is van groot belang, omdat de natuurlijke route van infectie voor C. psittaci is AeroGen. Verpakking en etikettering van de monsters moet ontsmettingsmiddel bewijs aangezien alle dingen moeten worden behandeld met een desinfecterend middel effectief tegen chlamydiae volgens de instructies van de fabrikant voor het verlaten van de stal eenheid.

1. Voorbereiden van de Animal voor bronchoscopie

  1. Bepaal het gewicht van het kalf voor dosering van anesthetica.
  2. Plaats een intraveneuze (IV) toegang in de linker halsader.
  3. Eerst langzaam injecteren xylazine (0,2 mg / kg lichaamsgewicht) gedurende ongeveer 30 seconden, dan na sedatie optreedt, injecteren ketamine (2,0 mg / kg lichaamsgewicht).
  4. Til het dier op de tafel en plaats deze in de juiste zijligging. Zodra het dier adequaat wordt geplaatst op de tafel, controleren of de toegang IV is nog steeds op zijn plaats en stel deze indien nodig. Tijdens de anesthesie, controleer regelmatig het ooglid reflex om de diepte van de anesthesie te bepalen.
  5. Zodra het dier gestaag ademt, laat iemand de tong trek en strek de nek. Plaats een metalen buis speculum in de mond van het dier, met kleine roterende bewegingen. Duw het speculum naar voren onder ogen controle, met behulp van een zaklamp, totdat het strottenhoofd zichtbaar is.
  6. Handhaaf anesthesie gedurende de gehele endoscopische procedure injecteren van een bolus van 7 mg xylazine en ketamine 70 mg zoals nodig.

. 2 Inenting (Enten Sites: Figuur 1)

  • Bereid 3 spuiten met inoculum, met 1, 2, en 5 ml van het inoculum.
  • Plaats een Teflon buis in werkkanaal van de endoscoop. De buis mag niet uitsteken van de punt van de endoscoop.
  • Steek de endoscoop door de metalen speculum. Lichte aanpassingen van het speculum kan nodig zijn om het passeren van het strottenhoofd mogelijk te maken. De Bronchus trachealis, die afbuigt naar rechts, helpt om het beeld af te stemmen op de monitor.
  • Bevestig de spuit met 5 ml inoculum aan het einde van de Teflon buis. Navigeer door de buis in de takken waar de entstof wordt neergelegd en de gewenste hoeveelheid (Rechts long toepassing: Lobus medius: 0,5 ml, Lobus accessorius: 0,5 ml, Lobus caudalis: 0,5 ml en 1,0 ml; linkerlong: Lobus cranialis, Pars cranialis 0,5 ml, Pars caudalis: 0,5 ml, Lobus caudalis 1,5 ml). Bevestig de spuit met 1 &# 160; ml inoculum aan de buis, navigeer naar de Bronchus trachealis en storten het inoculum (Lobus cranialis, Pars caudalis: 1,0 ml). Het is handig om altijd benaderen de lokalisatie in dezelfde volgorde.
  • Verwijder de endoscoop en het speculum.
  • Spray 1 ml van het inoculum in elk neusgat met een actuator.
  • Breng het dier terug naar de stal en plaats het in buikligging voor het wakker worden. Heeft het dier niet zonder toezicht of in het gezelschap van andere dieren verlaten totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging handhaven. Het herstel stabiel moet zijn voorzien van airconditioning, aangezien het vermogen van het dier voor thermoregulatie wordt afgenomen onder algemene verdoving.
    OPMERKING: eerste klinische symptomen voordoen ongeveer 24-36 uur na inoculatie, afhankelijk van het pathogeen gebruikt.
  • . 3 Sampling Procedures (Sampling Sites: Figuur 2)

    1. Bereid het dier zoals beschreven in stappen 1.1-1.6.
    2. Bronchoalveolaire lavage
      1. Plaats 5 spuiten met elk 20 ml steriele isotone zoutoplossing, in een waterbad en laat ze opwarmen tot ongeveer 38 ° C.
      2. Plaats een lavage catheter in werkkanaal van de endoscoop, steek de endoscoop in de metalen speculum en navigeer naar voren in de hoofdbronchus van de linker long, totdat de "wiggepositie" is bereikt waar de endoscoop niet kan worden geduwd verder vooruit.
      3. Een na de ander, hechten de spuiten met de warme NaCl-oplossing voor de lavage catheter, wekt de vloeistof en zuig het direct. De bronchoalveolaire lavage vloeistof moet worden opgeslagen in gesiliconiseerde glazen flessen en op ijs gezet onmiddellijk na herstel te voorkomen dat de alveolaire macrofagen uit die verbonden zijn aan het glasoppervlak. Opmerking zowel de hoeveelheid bijgebracht zoutoplossing en de hoeveelheid teruggewonnen fluïdum.
      4. Verwijder de lavage katheter uit het werkkanaal.
    3. Bronchiale borstelen
      1. Navigeer door de endoscoop naar de gewenste sampling locatie, in het protocol beschreven is dit het Bifurcatio tracheeën.
      2. Bedek de borstel met de buis voordat u deze in werkkanaal van de endoscoop totdat tip van het penseel op de monitor verschijnt.
      3. Duw de borstel met de plastic buis naar voren ongeveer 5 cm en ontdek het van de plastic buis door op het handvat, navigeer vervolgens naar de locatie die moet worden geborsteld.
      4. Afwrijven epitheliale oproepen door zachtjes duwen en trekken de borstel heen en weer tijdens het navigeren de endoscoop om het contact tussen de borstel en de wand van de bronchus waarborgen. Stoppen wrijven wanneer bloeden optreedt. Bedek de borstel met de buis voordat het uit het werkkanaal trekken.
      5. Bereid tot vijf uitstrijkjes op objectglaasjes door zacht glooiende de borstel over de dia. Fixeer de uitstrijkjes in koude methanol gedurende 10 minuten drogen aan de lucht en bewaar bij -20 ° C.
      6. De borstel kan worden gespoeldverschillende media, afhankelijk van het doel van de bemonsterde cellen. Als het nemen van meerdere poetsbeurten met dezelfde borstel, moet u alleen spoelen in media die niet irriteert de slijmvliezen.
    4. Transbronchiale longbiopt
      1. Navigeer door de endoscoop naar de gewenste sampling locatie, in het protocol beschreven is dit het Pars caudalis van de Lobus cranialis. Voordat u de biopsietang in het werkkanaal opent en sluit het een paar keer om ervoor te zorgen dat het soepel verloopt.
      2. Duw de biopsietang in de caudale tak van de bronchus trachealis totdat een lichte weerstand optreedt. Trek 2-3 cm, open de tang, naar voren te duwen ongeveer 2 cm, sluit de tang, terug te trekken en verwijder de tang van het werkkanaal. Dit vereist enige oefening.
      3. Verwijder voorzichtig het weefsel van de biopsie tang, met behulp van een naald of kleine tang. Afhankelijk van het verdere gebruik van het weefsel opslaan in vloeibare nitrOgen of een geschikt medium fixatie. Dit moet juist gebeuren na verwijdering naar autolytische processen te voorkomen.
    5. Post-procedurele behandeling
      1. Breng het dier terug naar de stal en plaats het in buikligging voor het wakker worden. Heeft het dier niet zonder toezicht of in het gezelschap van andere dieren verlaten totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging handhaven. Het herstel stabiel moet zijn voorzien van airconditioning, aangezien het vermogen van het dier voor thermoregulatie wordt afgenomen onder algemene verdoving.
      2. Controleer het dier nauwkeurig tekenen van pneumothorax voor de volgende 24 uur. Zorg voor voer en vers water als het dier volledig bewustzijn heeft herwonnen.

    Representative Results

    Verloop van de ziekte

    Het effect van het pathogeen op de gezondheid van de dieren kan worden beoordeeld door klinisch onderzoek. In onze luchtweginfectie modellen, werden de dieren tweemaal per dag onderzocht en klinische waarnemingen werden geregistreerd met behulp van een scoresysteem. Aanvullende informatie werd gevangen door het uitvoeren van andere in vivo sampling methoden, bijvoorbeeld inzameling van bloed en swabs of longfunctie meten. Pathologisch onderzoek werden op verschillende tijdstippen na inoculatie uitgevoerd om de voortgang van de infectie 32-34 beschrijven.

    BALF Recovery Rate

    De opbrengst van de bijgebracht vloeistof was 83,05 ± 4,58% (gemiddelde ± SD).

    Detectie van pathogenen

    Opnieuw cultiveren van de ziekteverwekker kunnen worden uitgevoerd vanaf bronchiale poetsbeurten. Ook PCR screening van verschillende monsters mogelijk het pathogeen detecteren, bijvoorbeeld tissue biopsie, cytologie penseelvoorbeeld, BALF-cellen 52 of keelholte wattenstaafje. Visualisatie van het pathogeen kan door het uitvoeren van immunohistochemie van ingevroren secties van de longbiopsieën en sedimentatie preparaten van de BALF-cellen (Figuur 3). In eerdere experimenten, PCR van bloedmonsters en swabs (conjunctiva, fecale, nasale) werden uitgevoerd om karakteriseren de verspreiding en verspreiding van de ziekteverwekker 32.

    Markers van lokale ontsteking van longweefsel

    In de BALF kunnen verschillende parameters van longontsteking bestudeerd. Het totale aantal cellen en het percentage neutrofielen verhoogt gewoonlijk bij longontsteking aanwezig is. Voor celdifferentiatie, kan sedimentatie voorbereidingen van BALF-cellen worden gekleurd volgens Giemsa en gedifferentieerd door olie-immersie (figuur 4). Cellulaire en vloeibare verhoudingen van de BALF gescheiden door centrifugatie (300 xg, 20 minuten). De BALF-Supernatant bevat verschillende merkers die veranderen tijdens ontstekingsprocessen in de long en kan onder experimentele omstandigheden worden onderzocht. Voorbeelden zijn totaal eiwit en eicosanoïden 29,34.

    Een schematisch overzicht van de mogelijke verdere gebruik van de beschreven voorbeelden wordt getoond in figuur 5.

    Figuur 1
    Figuur 1. Schema van runderen long met enting plaatsen (geel). De nummers geven de volgorde aan waarin de inoculum toegediend in de verschillende bronchiën. R: rechts; L: links. Rechter long: 1 Lobus medius: 0,5 ml, 2 Lobus accessorius: 0,5 ml, 3 Lobus caudalis: 0,5 ml en 4 1,0 ml; Linkerlong: Lobus cranialis, Pars cranialis: 0,5 ml, 6 Pars caudalis: 0,5 ml, 7 Lobus caudalis: 1,5 ml, 8 Lobus cranialis, Pars caudalis: 1,0 ml.

    Figuur 2
    . Figuur 2 Schema van de runderen long met enting sites (geel) en bemonstering waarheid. Bronchoalveolaire lavage (blauw), bronchiale borstelen (groen), en long biopsie (oranje) Merk op dat alle monsters worden verkregen uit gebieden waar de ziekteverwekker werd afgezet voor. R: rechts, L: links.

    Figuur 3
    Figuur 3. A) Lung biopsie van een kalf geïnoculeerd met Chl amydia psittaci 4 dagen na inoculatie (dpi), b) cellulaire sediment van BALF van een kalf geïnoculeerd met C. psittaci 9 dpi. Immunohistochemische labeling voor chlamydiae. Chlamydia inclusies (pijlen) aanwezig zijn in de long (a) en alveolaire macrofagen (b). Hematoxylin tegenkleuring.

    Figuur 4
    Figuur 4. Cellulaire sediment van BALF van een kalf geïnoculeerd met C. psittaci 9 dpi. alveolaire macrofagen (#) zijn de meest voorkomende celtype in de BALF. De hoeveelheid neutrofiele granulocyten (*) toeneemt wanneer ontstekingsprocessen aanwezig zijn. Gemodificeerde Pappenheim kleuring.

    es.jpg "width =" 600 "/>
    Figuur 5. Mogelijke methoden voor monstervoorbereiding. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

    Discussion

    Een bronchoscopic Werkwijze inoculatie werd ontwikkeld en diverse bronchoscopic bemonsteringsmethoden zijn aangepast om te worden gebruikt in grote dieren onder experimentele omstandigheden. De beschreven technieken zijn eenvoudig te leren, zelfs voor examinatoren met weinig ervaring in endoscopie. Het proces van bronchoscopie is minimaal invasief en geen nadelige effecten geassocieerd met de werkwijzen volgens de inoculatie evenals de beschreven bemonsteringsmethoden (BAL, transbrochiale longbiopt, bronchiale borstelen), werden ooit in een van de dieren. De complicaties geassocieerd met transbrochiale longbiopsieën in mensen bloeden en pneumothorax 48, geen van deze werden gezien in de kuiten deze procedure onderging. De transbronchiale long biopsie is meer tijdrovend en vereist meer apparatuur dan de transcutane methode, maar het is minder invasief en niet het risico van wondinfectie dragen.

    De visueel gecontroleerd, endoscopische methode inoculation kan de afzetting van een gedefinieerde hoeveelheid pathogeen op specifieke plaatsen van de long. Zo resulteert in een zeer consistente klinische en pathologische bevindingen bij alle geïnoculeerde dieren 32-34. Dit betekent echter niet alle functies van natuurlijke infectie lijken bij kalveren. In een model van een respiratoire C. psittaci infectie, de beschreven techniek van inenting leidde tot longlaesies geassocieerd met het plaatsen van een ziekteverwekker plaatsing 34, dat, natuurlijk verworven besmettingen kalveren meestal ontwikkelen longontsteking van de apicale lobben. Dit feit moet rekening worden gehouden bij het interpreteren van de relevantie van experimentele bevindingen in de context van natuurlijke verworven longinfecties bij runderen.

    Video-endoscopische BAL laat bemonsteren van een bepaald gebied van de long. Voor experimentele doeleinden, is een voordeel vergeleken met het gebruik van een nasale katheter onder blinde omstandigheden. Vanwege de anatomie van de longen runderen, zou blind ingebracht katheter duwened rechts middenrif kwab meestal 53,54 en de onderzoeker heeft geen invloed op het gebied van de long die wordt gespoeld. Een ander voordeel van de endoscopische BAL verdoofde kalveren zijligging is de hoge gemiddelde opbrengst van ingeprent vloeistof van meer dan 80%. Een vergelijking met andere studies blijkt dat, in staande, verdoofd kalveren, een herstel van 133,3 ± 1,6 ml 46 en 127,13 ± 3,53 ml 45 na de toediening van 240 ml vloeistof in de caudale kwab is gemeld. In verdoofd kalveren in borstligging 51% van de bijgebracht vloeistof kan worden teruggevorderd van de craniale kwab en 62% van de caudale kwab 43. Dit betekent dat ongeveer de helft van de bijgebracht vloeistof kon worden teruggevonden in rechtopstaande positie van het kalf. Afhankelijk van de hoeveelheid van BALF nodig is voor verdere monstervoorbereiding, zou dit genoeg materiaal niet overlaten aan alle gewenste experimenten uit te voeren. BAL bij runderen is gebruikt door vele onderzoeksgroepen en veleverschillende parameters onderzocht onder verschillende omstandigheden. De meeste auteurs uitgevoerd lavage van de basale lobben 43,45,46, maar de hoeveelheid vloeistof voor lavage verschillen tussen de onderzoeksgroepen. Dit leidt tot inconsistentie bij verdunning van de teruggewonnen cellen, eiwitten en andere stoffen, waardoor het moeilijk om de resultaten te vergelijken van verschillende publicaties. Daarom is voor het gebruik bij runderen is het handig te spoelen met vijf fracties van 20 ml (namelijk 100 ml in totaal) lichaam warm, isotone zoutoplossing, die worden teruggewonnen onmiddellijk na instillatie. Bij gebruik van een lavage katheter met een grote diameter (dat wil zeggen> 2 mm), het volume van elke fractie moet enigszins worden verhoogd, afhankelijk van de hoeveelheid vloeistof die in de catheter blijft.

    De zeer gesegmenteerd anatomie van de runder longen leidt tot een methodische beperking; resultaten van een deel van de long kan niet waar voor de rest van de long. Aangezien er geenzicht controle van de hele long gebied gesondeerd door transbronchiale biopsie en lavage, kan de examinator niet weten of de bemonsterde gebieden gezond of ziek waren. Daarom is het erg belangrijk om plaatsen waar het pathogeen voordat werd geïnoculeerd om een ​​hogere opbrengst van de ziekteverwekker en een grotere kans bemonstering zieke long gebieden proeven. Een andere beperking is de toegenomen narcose risico bij dieren van slechte klinische conditie. De beschreven methoden mag alleen worden gebruikt in modellen van milde tot matige ziekte om de last voor de dieren zo laag mogelijk te houden. Algemene anesthesie bij herkauwers altijd zo kort mogelijk worden gehouden, aangezien de gasontwikkeling in de pens verhoogt de narcose risico bij deze soorten. Dieren moeten in buikligging geplaatst worden direct na bronchoscopie om de uitstroom van de ontwikkelde gas mogelijk te maken en moeten goed gevolgd worden tot ze volledig hersteld van anesthesie. Ook de beschreven technieken niet suitaBLE voor de bemonstering intervallen van minder dan 24 uur.

    De beschreven protocol kan worden aangepast aan andere infectieuze agentia. Endoscopische inoculatie van verschillende pathogenen is beschreven, zoals C. psittaci 32-34, Pasteurella haemolytica 38-40,42, Haemophilus somni 55, en boviene virale diarree virus 44. Ook kunnen de plaatsen van pathogeen afzetting in de longen worden aangepast aan het gewenste model. Bij het kiezen van de bemonsteringsplaatsen, enkele belangrijke feiten in aanmerking moeten worden genomen: (i) Sampling locaties dienen te worden gekozen op basis van de locaties van de inenting en op de verwachte pathologische bevindingen. (Ii) Wanneer necropsie wordt uitgevoerd voorzichtigheid geboden om voldoende unsampled longgebieden reactie voor ex vivo monsters. (Iii) Steekproef website locaties moeten worden gekozen zodat ze kunnen worden bereikt met de apparatuur. Speciaal voor transbrochiale longbiopt zijn er beperkingen door de lengte van de biopsietang. (Iv) Thij orde van de bemonstering is belangrijk, bronchiale borstelen en transbronchiale longbiopt zou kunnen leiden tot kleine bloeden, die de BALF zou besmetten. Daarom BALF altijd als eerste worden verkregen. Bij gebruik van het protocol in andere soorten, moet de soortspecifieke long anatomie rekening worden gehouden.

    Disclosures

    De auteurs hebben niets te onthullen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Veterinary Video Endoscope Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany PV-SG 22–140 diameter: 9 mm, working channel: 2.2 mm, working length 140 cm
    Lavage catheter Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany diameter: 2 mm; length: 180 cm, Luer-lock-adapter
    Actuator WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Germany 32660 length: 60 mm
    Biopsy forceps Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany REF 60180LT 1.8 mm, serrated, oval
    Omnifix 20 ml, Luer-Lock B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4617207V
    Cytology brush mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany 110240-10 working length 180 cm, brush length: 15 mm, diameter 1.8 mm
    iv acess Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 370-211 diameter: 1.2 mm; length: 43 mm
    Rompun 2% (xylazin) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany 0.2 mg/kg bodyweight
    Ketamin 10% (ketamine) bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany 2.0 mg/kg bodyweight
    Isotonic saline solution B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 3200950
    SUB 6 waterbath CLF analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker, Germany n/a
    Metal tube speculum n/a n/a diameter: 3.5 cm; length: 35 cm
    Flashlight n/a n/a
    Siliconized glass bottles n/a n/a siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)
    Omnifix Luer 3 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616025V
    Omnifix Luer 5 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616057V
    Sealing plugs Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 900-3057
    Inoculum n/a dilute pathogen in 8 ml buffer

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ireland, J. J., Roberts, R. M., Palmer, G. H., Bauman, D. E., Bazer, F. W. A commentary on domestic animals as dual-purpose models that benefit agricultural and biomedical research. Journal of animal science. 86, 2797-2805 (2008).
    2. Persson, C. G. Con: mice are not a good model of human airway disease. American journal of respiratory and critical care medicine. 166, 6-7 (2002).
    3. Haley, P. J. Species differences in the structure and function of the immune system. Toxicology. 188, 49-71 (2003).
    4. Hein, W. R., Griebel, P. J. A road less travelled: large animal models in immunological research. Nature reviews. Immunology. 3, 79-84 (2003).
    5. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
    6. Elferink, R. O., Beuers, U. Are pigs more human than mice. Journal of hepatology. 50, 838-841 (2009).
    7. Jawien, J., Korbut, R. The current view on the role of leukotrienes in atherogenesis. Journal of physiology and pharmacology : an official journal of the Polish Physiological Society. 61, 647-650 (2010).
    8. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3507-3512 (2013).
    9. Pabst, R. Allergy and Allergic Diseases. 1, (2009).
    10. Bovine Genome, S., et al. The genome sequence of taurine cattle: a window to ruminant biology and evolution. Science. 324, 522-528 (2009).
    11. Tellam, R. L., et al. Unlocking the bovine genome. BMC genomics. 10, 193 (2009).
    12. Graphodatsky, A. S., Trifonov, V. A., Stanyon, R. The genome diversity and karyotype evolution of mammals. Molecular cytogenetics. 4, 22 (2011).
    13. Kirschvink, N., Reinhold, P. Use of alternative animals as asthma models. Current drug targets. 9, 470-484 (2008).
    14. Coleman, R. A. Of mouse and man--what is the value of the mouse in predicting gene expression in humans. Drug discovery today. 8, 233-235 (2003).
    15. Kips, J. C., et al. Murine models of asthma. The European respiratory journal. 22, 374-382 (2003).
    16. Coraux, C., Hajj, R., Lesimple, P., Puchelle, E. In vivo models of human airway epithelium repair and regeneration. European Respiratory Review. 14, 131-136 (2005).
    17. McLaughlin, R. F., Tyler, W. S., Canada, R. O. A Study of the Subgross Pulmonary Anatomy in Various Mammals. American Journal of Anatomy. 149-165 (1961).
    18. Robinson, N. E. Some functional consequences of species differences in lung anatomy. Adv Vet Sci Comp Med. 26, 1-33 (1982).
    19. Lekeux, P., Hajer, R., Breukink, H. J. Effect of Somatic Growth on Pulmonary-Function Values in Healthy Friesian Cattle. Am J Vet Res. 45, 2003-2007 (1984).
    20. Veit, H. P., Farrell, R. L. The anatomy and physiology of the bovine respiratory system relating to pulmonary disease. Cornell Vet. 68, 555-581 (1978).
    21. Gallivan, G. J., McDonell, W. N., Forrest, J. B. Comparative pulmonary mechanics in the horse and the cow. Res Vet Sci. 46, 322-330 (1989).
    22. Hunter, K. S., et al. In vivo measurement of proximal pulmonary artery elastic modulus in the neonatal calf model of pulmonary hypertension: development and ex vivo validation. Journal of applied physiology. 108, 968-975 (2010).
    23. Stenmark, K. R., et al. Severe pulmonary hypertension and arterial adventitial changes in newborn calves at 4,300 m. Journal of applied physiology. 62, 821-830 (1987).
    24. Tian, L., et al. Impact of residual stretch and remodeling on collagen engagement in healthy and pulmonary hypertensive calf pulmonary arteries at physiological pressures. Annals of biomedical engineering. 40, 1419-1433 (2012).
    25. Van Rhijn, I., Godfroid, J., Michel, A., Rutten, V. Bovine tuberculosis as a model for human tuberculosis: advantages over small animal models. Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 711-715 (2008).
    26. Otto, P., et al. A model for respiratory syncytial virus (RSV) infection based on experimental aerosol exposure with bovine RSV in calves. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 19, 85-97 (1996).
    27. Gershwin, L. J., et al. A bovine model of vaccine enhanced respiratory syncytial virus pathophysiology. Vaccine. 16, 1225-1236 (1998).
    28. Gershwin, L. J. Immunology of bovine respiratory syncytial virus infection of cattle. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 35, 253-257 (2012).
    29. Jaeger, J., Liebler-Tenorio, E., Kirschvink, N., Sachse, K., Reinhold, P. A clinically silent respiratory infection with Chlamydophila spp. in calves is associated with airway obstruction and pulmonary inflammation. Veterinary research. 38, 711-728 (2007).
    30. Martinez-Olondris, P., Rigol, M., Torres, A. What lessons have been learnt from animal models of MRSA in the lung. The European respiratory journal. 35, 198-201 (2010).
    31. Sadowitz, B., Roy, S., Gatto, L. A., Habashi, N., Nieman, G. Lung injury induced by sepsis: lessons learned from large animal models and future directions for treatment. Expert review of anti-infective therapy. 9, 1169-1178 (2011).
    32. Ostermann, C., et al. Infection, Disease, and Transmission Dynamics in Calves after Experimental and Natural Challenge with a Bovine Chlamydia psittaci Isolate. PloS one. 8, (2013).
    33. Ostermann, C., Schroedl, W., Schubert, E., Sachse, K., Reinhold, P. Dose-dependent effects of Chlamydia psittaci infection on pulmonary gas exchange, innate immunity and acute-phase reaction in a bovine respiratory model. Vet J. 196, (2012).
    34. Reinhold, P., et al. A bovine model of respiratory Chlamydia psittaci infection: challenge dose titration. PloS one. 7, (2012).
    35. Reinhold, P., Sachse, K., Kaltenboeck, B. Chlamydiaceae in cattle: commensals, trigger organisms, or pathogens. Vet J. 189, 257-267 (2011).
    36. Dionisio, J. Diagnostic flexible bronchoscopy and accessory techniques. Revista portuguesa de pneumologia. 18, 99-106 (2012).
    37. Hilding, A. C. Experimental bronchoscopy: resultant trauma to tracheobronchial epithelium in calves from routine inspection. Trans Am Acad Ophthalmol Otolaryngol. 72, 604-612 (1968).
    38. Potgieter, M. M., Hopkins, F. M., Walker, R. D., Guy, J. S. Use of fiberoptic bronchoscopy in experimental production of bovine respiratory tract disease. Am J Vet Res. 45, 1015-1019 (1984).
    39. Ackermann, M. R., Kehrli Jr, M. E., Brogden, K. A. Passage of CD18- and CD18+ bovine neutrophils into pulmonary alveoli during acute Pasteurella haemolytica pneumonia. Veterinary pathology. 33, 639-646 (1996).
    40. Malazdrewich, C., Ames, T. R., Abrahamsen, M. S., Maheswaran, S. K. Pulmonary expression of tumor necrosis factor alpha, interleukin-1 beta, and interleukin-8 in the acute phase of bovine pneumonic pasteurellosis. Veterinary pathology. 38, 297-310 (2001).
    41. Wells, A. U. The clinical utility of bronchoalveolar lavage in diffuse parenchymal lung disease. European respiratory review : an official journal of the European Respiratory Society. 19, 237-241 (2010).
    42. Wilkie, M. R. Sequential titration of bovine lung and serum antibodies after parenteral or pulmonary inoculation with Pasteurella haemolytica. Am J Vet Res. 40, 1690-1693 (1979).
    43. Pringle, J. K., et al. Bronchoalveolar lavage of cranial and caudal lung regions in selected normal calves: cellular, microbiological, immunoglobulin, serological and histological variables. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire. 52, 239-248 (1988).
    44. Silflow, R. M., Degel, P. M., Harmsen, A. G. Bronchoalveolar immune defense in cattle exposed to primary and secondary challenge with bovine viral diarrhea virus. Veterinary immunology and immunopathology. 103, 129-139 (2005).
    45. Mitchell, G. B., Clark, M. E., Caswell, J. L. Alterations in the bovine bronchoalveolar lavage proteome induced by dexamethasone. Veterinary immunology and immunopathology. 118, 283-293 (2007).
    46. Mitchell, G. B., Clark, M. E., Siwicky, M., Caswell, J. L. Stress alters the cellular and proteomic compartments of bovine bronchoalveolar lavage fluid. Veterinary immunology and immunopathology. 125, 111-125 (2008).
    47. Lordan, J. L., et al. Cooperative effects of Th2 cytokines and allergen on normal and asthmatic bronchial epithelial cells. J Immunol. 169, 407-414 (2002).
    48. Tukey, M. H., Wiener, R. S. Population-based estimates of transbronchial lung biopsy utilization and complications. Respiratory medicine. 106, 1559-1565 (2012).
    49. Braun, U., Estermann, U., Feige, K., Sydler, T., Pospischil, A. Percutaneous lung biopsy in cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association. 215, 679-681 (1999).
    50. Burgess, B. A., et al. The development of a novel percutaneous lung biopsy procedure for use on feedlot steers. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire. 75, 254-260 (2011).
    51. Sydler, T., Braun, U., Estermann, U., Pospischil, A. A comparison of biopsy and post-mortem findings in the lungs of healthy cows. Journal of veterinary medicine. A, Physiology, pathology clinical medicine. 51, 184-187 (2004).
    52. Voigt, K., et al. PCR examination of bronchoalveolar lavage samples is a useful tool in pre-clinical diagnosis of ovine pulmonary adenocarcinoma (Jaagsiekte). Research in Veterinary Science. 83, 419-427 (2007).
    53. Caldow, G. Bronchoalveolar lavage in the investigation of bovine respiratory disease. In Practice. 1, 41-43 (2001).
    54. Heilmann, P., Müller, G., Reinhold, P. Bronchoscopy and Segmental Bronchoalveolar Lung Lavage of Anesthetised Calf. Monatsh. Veterinärmed. 43, 79-84 (1988).
    55. Gogolewski, R. P., et al. Protective ability and specificity of convalescent serum from calves with Haemophilus somnus pneumonia. Infection and immunity. 55, 1403-1411 (1987).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics