التحليل الآلي من ديناميك كا
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Department of Physiology, University of South Alabama

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

هنا يتجلى منطقة جديدة من بروتوكول تحليل الفائدة على أساس الفرز الحذف أفضل تناسب المخصصة لمناطق إشارة إيجابية خلال فترة زمنية ثنائي الأبعاد تسلسلات الصور الفاصل. هذه الخوارزمية قد تمكن المحققون على تحليل شامل الفسيولوجية كا 2 + إشارات مع الحد الأدنى من إدخال المستخدم والتحيز.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Francis, M., Waldrup, J., Qian, X., Taylor, M. S. Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences. J. Vis. Exp. (88), e51560, doi:10.3791/51560 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يتم دراسة الخلايا كا 2 + إشارات عادة مع الأصباغ الفلورية كا 2 + المؤشر وتقنيات الفحص المجهري. ومع ذلك، والتحليل الكمي من كا 2 + بيانات التصوير هو مضيعة للوقت وتخضع للانحياز. وقد تم تنفيذ الآلية خوارزميات تحليل الإشارات يعتمد على المنطقة ذات الاهتمام (ROI) الكشف عن قياسات سطر واحد الابعاد المسح الضوئي، ولكن ليس هناك خوارزمية الحالي الذي يجمع بين تحديد الأمثل وتحليل رويس في تسلسلات الصور ثنائية الأبعاد. هنا يتم وصف خوارزمية لسرعة اقتناء وتحليل رويس في تسلسلات الصور. فإنه يستخدم الحذف يصلح لإشارات الضجيج تصفيتها من أجل تحديد العائد على الاستثمار الأمثل التنسيب، ويحسب كا 2 + المعلمات إشارة من السعة والمدة وانتشار المكاني. تم تنفيذ هذه الخوارزمية باعتباره المساعد متاحة بحرية لليماغيج (NIH) والبرمجيات. جنبا إلى جنب مع البرامج النصية تحليل مكتوب لمفتوحة المصدر برامج معالجة الإحصائية R،ويوفر هذا النهج خط أنابيب ذات قدرة عالية لأداء التحليل الإحصائي السريع للناتج التجريبية. كما يقترح الباحثون أن استخدام هذا البروتوكول التحليل سوف يؤدي إلى توصيف أكثر اكتمالا وغير منحازة من الفسيولوجية كا 2 + إشارات.

Introduction

كا 2 + هو رسول الثاني في كل مكان مما يشير جزيء وعصاري خلوي كا 2 + وينظم مستويات عالية. الكالسيوم داخل الخلايا 2 + إشارات معقدة وتشمل العابرين معزولة، التذبذبات، ونشر موجات 1-4. ويعتقد أن السيطرة المكانية والزمانية من كا 2 + لخصوصية تكمن وراء الفسيولوجية إشارة، وبالتالي فإن تحليل كا 2 + أنماط إشارة هو من مصلحة كبيرة للمحققين في حقول متعددة 5.

الأصباغ كا 2 + المؤشر مثل فلوو-4-2 FURA وتستخدم عادة لقياس الكالسيوم داخل الخلايا 2 + إشارات مع مضان المجهري 5-12. عادة، يتم تقييم الزمانية كا 2 + إشارات عن التغيرات التي تعتمد على الوقت في متوسط ​​مضان داخل منطقة المعرفة من قبل المستخدم، أو المنطقة ذات الاهتمام (ROI) 5،6،13 - 16. حاليا، وتحليل العائد على الاستثمار دليل على حد سواء مضيعة للوقت والعمل فيتوتري لأنه يتطلب من المستخدمين لتحديد العديد من رويس وأداء العمليات الحسابية المتكررة 17-19. قد تكون هذه التقنيات أيضا عرضة للخطأ المستخدم كبيرة، بما في ذلك إدخال وسائط إشارة مصطنعة والاستبعاد من انخفاض السعة أو إشارات منتشر 18،20.

وقد سبق أن نفذت خوارزميات الكشف الآلي العائد على الاستثمار باستخدام مجموعة متنوعة من النهج الإحصائية لتحديد العائد على الاستثمار الأمثل التنسيب، لكنها عموما اقتصرت على تحليل مسح سطر أو الزائفة خط مسح الصور، مما يحد من التحليل إلى البعد المكاني واحدة في الوقت المناسب 17، 19-22. بالإضافة إلى ذلك، العديد من الخوارزميات الموجودة ليست كافية لتشمل تنوع كا 2 + الأحداث الإفراج التي تتراوح من الدوري، العابرين المترجمة إلى نشر موجات 23،24. وغالبا ما تتعقد تقييم شامل للالفسيولوجية كا 2 + إشارات إضافية من خلال وجود صورة كبيرة artifالتصرف الذي يفند إشارة إلى التمييز الضوضاء في كثير من النظم التجريبية.

سابقا، للكشف عن العائد على الاستثمار خوارزمية الحل الآلي لكا 2 + إشارة الكشف عابرة، كما تنفذ البرنامج المساعد لبرنامج NIH يماغيج (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا، MD)، تم تطويره والتحقق من صحتها 25،26. وقد تم تصميم هذه الخوارزمية، ودعا LC_Pro، لتحديد وتحليل رويس يشمل كا 2 + العابرين في إشارة ثنائية الأبعاد الوقت الفاصل بين متواليات الصورة. هنا يتم توفير بروتوكول التجريبية العملية ومظاهرة ممثل تطبيق الخوارزمية في الخنازير الشريان التاجي البطانة، مع تحليل نتائج إضافية باستخدام مفتوحة المصدر برامج معالجة الإحصائية R لتوليد الناتج رسومية قابلة للاستخدام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تشريح السفن والتصوير

  1. الحصاد الأنسجة من الخنازير الأحداث المحلية كما هو موضح في مارتنز وآخرون 27. وضع تحصد البطينين الأيمن الخنازير في polydimethylsiloxane (PDMS) طبق تشريح الجزء السفلي تحتوي على HEPES مخزنة محلول ملحي الفسيولوجية (PSS).
    1. مع المعونة من stereomicroscope، تشريح وإزالة جزء من الأمامي الأيسر النازل الشريان التاجي (~ 8 مم طول، و 0.5 مم) من الأنسجة المحيطة باستخدام ملقط ومقص الربيع عن طريق إزالة جزء من السفينة المحيطة طبقات أنسجة القلب. ملاحظة: الحرص على عدم ثقب جدار الوعاء الدموي.
    2. وضع كتلة PDMS (1 × 0.5 × 0.5 سم) في طبق تشريح، واستخدام إبرة ليعلقون عليه إلى أسفل. قطع قطرها سلك التنغستن حوالي 40 ميكرون الى اثني عشر قطاعات ~ 0.3 سم طول، وتشكيل micropins، ووضع هذه في الطبق. باستخدام ملقط، وتأمين واحدة من نهاية الجزء السفينة إلى كتلة مع micropiن.
    3. إدراج بعناية مقص الربيع صغير في تجويف السفينة، وقطع طولي أسفل جانب واحد من السفينة لفتحه تماما. توجيه جزء السفينة فتحت مع البطانة المباراة.
    4. استخدام micropins المتبقية لتأمين حدود قطاع سفينة فتح لمنع مثل هذه أن السفينة تشكل مستطيل مسطح. ملاحظة: يجب أن تكون عازمة قمم Micropin إلى 90 درجة وإدراجها حتى الاحمرار مع سطح الكتلة. ينبغي توخي الحذر لتمتد إعداد السفينة دون إرهاق؛ عرض النهائي ينبغي ~ 1.5X عرض المتمدد البدء.
    5. إعداد وحدة تخزين صغيرة (~ 1 مل) من فلوو-4 الحل AM التحميل عن طريق خلط فلوو-4 AM (10 ميكرومتر) الذائبة في DMSO مع بلورونيك (0.03٪) في HEPES مخزنة PSS (تحتوي في ملي: 134 كلوريد الصوديوم، 6 بوكل ، 1 MgCl، 10 HEPES، 10 الجلوكوز)، وإدراج كتلة بأكملها في حل التحميل لحوالي 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    6. بعد التحميل، وغسل كتلة في HEPES مخزنةPSS لمدة 5-10 دقيقة.
    7. جبل كتلة 50-100 ميكرون على الفواصل سميكة في غرفة أسفل ساترة تحتوي على HEPES مخزنة PSS. ملاحظة: دبابيس معدنية يمكن أن تستخدم الفواصل وضمان تواجه قطاع السفينة إلى أسفل وعدم لمس الفواصل.
    8. وضع الغرفة على مرحلة مجهر مقلوب مجهزة للتصوير متحد البؤر، والتركيز على طبقة الخلايا البطانية.
    9. تسلسل التقاط صورة مرور الوقت مضان النسبي القاعدية ل~ 3 دقائق في 20X التكبير ومعدل الإطار ل~ 8 إطارات في الثانية باستخدام صورة متحد البؤر البرمجيات aquisition التسلسل.
    10. بعد ~ 3 دقائق من تسجيل مضان القاعدية، استبدال HEPES مخزنة حل PSS مع نفس الحجم (~ 1 مل) من مادة P (100 م) المذاب في HEPES مخزنة جهاز الأمن الوقائي، وسجل لالإضافيون 3 دقائق.

2. التحليل الآلي

  1. تقديم تسلسل الصور (ق) من النشاط الكالسيوم الفلورسنت من برنامج الحصول متحد البؤر إلى 8 بت، زrayscale '. TIF' شكل ملفات مع عدم وجود المعلومات على نطاق و.
  2. يماغيج مفتوحة، انقر فوق 'فتح' في القائمة ملف، وحدد تسلسل الصور المناسبة في نافذة المستكشف لعرض تسلسل الصور (ق) في ImageJ.
  3. تحديد العائد على الاستثمار يبلغ قطرها المناسب باستخدام أداة مستطيلة العائد على الاستثمار لتقدير حدود العلوي والسفلي من انتشار المكاني للنشاط ضمن تسلسل الصور (ق). ملاحظة: قطر مستطيل متوسط ​​هو اختيار مناسب لقطر العائد على الاستثمار.
  4. إنشاء مجلد جديد على القرص الصلب لجهاز الكمبيوتر، وإضافة تسلسل الصور (ق) إلى الدليل المجلد.
  5. في ImageJ، انقر فوق نافذة 'الإضافات'، ثم انقر 'LC_Pro' لبدء التحليل.
  6. أدخل القيمة قطر العائد على الاستثمار وتحديد قيمة العتبة تصفية (إما 0.05 أو 0.01).
  7. انقر على 'العلاج من تعاطي المخدرات' مربع الاختيار وأدخل القيم نقطة زمنية على الفور قبل وبعد وأضيف المخدرات (بالثواني).
  8. انقر 'موافق'، وأدخل الدليل تسلسل الصور في إطار ملف اكسبلورر.

3. إخراج الرسومية

  1. تحميل النسخة 3.0.2 من R http://www.r-project.org/ .
  2. فتح إصدار 32 بت من ر.
  3. انقر على زر "ملف"، ثم "النصي فتح 'وحدد' traceplot.R 'R النصي لتوليد التقارير الرسومية التجريبية.
  4. تثبيت معايرة، وgplots الحزم عن طريق تحديد "حزم"، "تثبيت حزم"، واختيار حزم appropirate.
  5. انقر 'ملف'، ثم 'تغيير الدليل' الأوامر، واستخدام نافذة المستكشف لتحديد الدليل الذي يتوافق مع الإخراج تحليل LC_Pro.
  6. انقر على إطار البرنامج النصي ثم 'تشغيل جميع' الأوامر لتشغيل البرنامج النصي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

خوارزمية مخصصة، LC_Pro، تم وضعها وتنفيذها من أجل إجراء تحليل الآلي للكا 2 + ديناميات على تسلسلات الصور متحد البؤر. كما هو مبين في الشكل 1، ويستخدم خوارزمية وحدات معالجة متتابعة أن A) كشف وتعقب المواقع الديناميكية كا 2 + تغيير أعلاه إحصائية (ع <0.01) الضوضاء، B) تحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) تلقائيا في مراكز موقع نشط، و C) حساب متوسط ​​كثافة مضان في رويس لتحديد المعلمات حدث معين. يتم عرض لمحة رسومية من الخوارزمية باستخدام الكمبيوتر ولدت البقول التمويه من كثافة معروفة، والمكان (الشكل 2). تم تحويل النبضات إشارة (أرقام 2A وباء) إلى ثنائي باستخدام ض النتيجة لتوزيع الطبيعي القياسي، وتم تعيين علامات الحذف الأكثر تناسبا لبكسل مواضع أعلاه عتبة إشارة (الشكل 2C). تم استخدام خوارزمية الفرز القطع الناقص لمحدداتشمال شرق الأمثل ROI التنسيب (الشكل 2D). العائد على الاستثمار يعني كثافة مقابل الوقت ثم تم قياس وحسبت المعلمات إشارة من السعة والمدة وانتشار المكاني (الشكل 2E). تم تطبيق هذا النهج من التحليل لتقييم الخلوية كا 2 + ديناميات سليمة في بطانة الأوعية الدموية. على وجه التحديد، تم إجراء التصوير متحد البؤر في فتح الشرايين التاجية الخنازير كما هو موضح في الشكل (3)، وكان يعمل الخوارزمية حاليا لقياس متميزة كا 2 + المعلمات. لهذه التجارب، أدلى تسجيلات المستمر قبل وبعد إضافة الحافز البطانية، المادة P (SP، 100 م)، وأجريت تحليل LC_Pro في وقت لاحق. لرفع إشارة في كل ROI، وقد استمدت خطوط الأساس كما انحدارات خطية من شدة العائد على الاستثمار على مدار الساعة التجريبية (الشكل 4). تم حساب القيم يعني كثافة إشارة لكل العائد على الاستثمار (الشكل 4A)، وكانت القيم فوق المتوسط ​​TRUNC ated إلى الوسط وتم إجراء الانحدار الخطي لتقريب إشارة خط الأساس (الشكل 4B). أخيرا، تم تقسيم القيم كثافة الخام من قيمة خط الانحدار لتحويل القيم إلى أضعاف أكثر من خط الأساس التغيير (الشكل 4C). الشكل 5 يظهر التجربة التمثيلية، بما في ذلك الصور من كا 2 + مضان تعتمد في (5A الشكل) البطانة، تتراكم الأقنعة الثنائية من الكل كا 2 + الكشف عن إشارة ضمن مجال أخذ عينات (الشكل 5B)، وتسجيلات لمتوسط ​​مضان في كل العائد على الاستثمار (الشكل 5C) قبل وبعد العلاج SP. تم إجراء تحليل المعلمة اللاحقة باستخدام برنامج R. تظهر رسوم بيانية مما أدى تأثير تضخيم ليرة سورية على السعة الحدث، والمدة، وانتشار المكاني (الشكل 6).

560/51560fig1highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 1. الإشارة المخططات تدفق العمليات الخوارزمية (تم الحصول على هذا الرقم بإذن من فرانسيس وآخرون) 24. نظمت الخوارزمية إلى ثلاثة أقسام: معالجة الصور، معالجة الحدث، والمنطقة ذات الاهتمام (ROI) المعالجة. تسلسلات الصور هي مدخلات في سلسلة التدفق، ويتم إنشاؤها إحصاءات الحدث بأنه الناتج النهائي. معالجة الصور (A) روتين من الخوارزمية يحول تسلسل الصورة المدخلة في قائمة الحذف أفضل تناسب مستوى العتبة من قبل، وذلك باستخدام ض النتيجة لتوزيع الطبيعي القياسي وتحليل يماغيج الجسيمات. معالجة الحدث (B) هو روتين الفرز المستخدمة لتحديد موقف ROI الأمثل من خلال تنظيم مواقع القطع الناقص في الحدث "المواقع" حسب الوقت. بعد يعني تؤخذ قياسات كثافة في كل عائدات الاستثمار، وتحسب المعلمات الإحصائية لكل حدث والموقع من قبل روتين معالجة العائد على الاستثمار (C </ STRONG>) لتوليد الناتج النهائي. BKGD، والخلفية؛ AVG، متوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. مظاهرة من اكتساب ROI الآلي والكشف عن إشارة باستخدام النبض جاوس الحاسوب ولدت (تم تعديل هذا الرقم بإذن من فرانسيس وآخرون) 24. كان جزءا لا يتجزأ من A-لدت كمبيوتر واحد نبض إشارة (A) في ضجيج الخلفية عشوائي. تم تصفية تسلسل الصور مقياس الرمادية لإزالة القيم بكسل خلفية ثابتة (B) وتحويلها إلى ثنائي باستخدام قيم شدة الاستضاءة بكسل P <0.05 وتحسب على أساس معيار درجة (C). يماغيج تحليل الجسيمات القاعدهثم تم تطبيق مللي إلى تسلسل الصور لتعيين الحذف الأكثر تناسبا لبكسل مواضع داخل كل إطار. تم استخدام خوارزمية جديدة لعلامات الحذف المجموعة إلى "الأحداث" الزمانية المنفصلة وتحديد الموقف الأمثل لكل العائد على الاستثمار على أساس متوسط ​​مركز القطع الناقص (D). ثم يتم وضع العائد على الاستثمار من دائرة نصف قطرها يحددها المستخدم في كل موقف (الدائرة المتقطعة). وتحسب يعني قيم الكثافة داخل ROI لكل إطار وتحجيمها باستخدام تقريب خط الأساس الخطية. يتم تحديد السعة الذروة كما ماكسيما المحلية أعلاه P <0.05 على النحو الذي حددته النتيجة القياسية لتتبع ROI المقابلة (E). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. Porci الشريان التاجي شمال شرق بروتوكول تشريح. تم تشريح الفروع ما يقرب من 0.5 مم × 8 مم طول الأمامي الأيسر النازل الشريان التاجي (الصورة 1، دائرة منقط) من عضلة القلب المحيطة. وقلص قطاعات السفينة من الأنسجة المحيطة براني وقطع بالطول مع مقص صغير (الصورة 2). المقبل، والأوعية فتح كانت معقودة شقة إلى كتلة PDMS باستخدام أسلاك التنغستن غرامة (صورة 3). تم تحميل قطاعات سفينة مزودة فلوو-4 كا 2 + صبغ المؤشر، وغسلها، ثم وضعت في غرفة التصوير القاع ساترة. تم جمع الصور في التكبير 20X (488 السابقين.، 510 م.) في 8.0 لقطة في الثانية باستخدام المجهر متحد البؤر مقلوب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

0/51560fig4highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 4. ROI يعني كثافة تقريب خط الأساس. متوسط ​​كثافة التالية مقابل قياسات الوقت (خطوط الصلبة) لكل العائد على الاستثمار، يتم تحجيم القيم كثافة الخام إلى F/F0 باستخدام طريقة تقريب خط الأساس التالية. يتم حساب متوسط ​​كثافة إشارة (خط متقطع) خلال فترة الرقابة من السيطرة يحددها المستخدم والقيم الفاصل العلاج (A). منحنى كثافة إشارة تعتمد على الوقت ثم يتم اقتطاع فوق متوسط ​​كثافة تحكم لشدة الرقابة يعني لتصفية النشاط من تقريب خط الأساس، ويتم إجراء الانحدار الخطي على منحنى الناتج (الخطوط المنقطة) (B). أخيرا، يتم تحجيم القيم كثافة الخام إلى خط الأساس الخطية محسوب (C). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

-together.within صفحة = "دائما"> الرقم 5
الرقم 5. ممثل النتائج من تحليل LC_Pro من القاعدية وحفز كا 2 + ديناميات. الصور انقضاء وقت تسلسل الصورة المدخلة من فاصل زمني أخذ العينات القاعدية (A، اللوحة اليسرى) تليها مادة حفز P الفاصل الزمني للعينة (A، اللوحة اليمنى ) وترد في الرمادي. تسلسلات الصور الفاصل الزمني من أفضل الحذف يصلح لالقاعدية وحفز وقدمت فترات (B) من خلال LC_pro. أخيرا، وتظهر تعتمد على الوقت تحجيم منحنيات كثافة من كل منطقة وضعه تلقائيا من الفائدة (ROI) (C).

الرقم 6
الرقم 6. المدرج الإحصائيالتوزيعات المعلمة من تجربة تمثيلية (الشكل 4). ، كان (العمود الأيمن) الأحداث من تجربة ممثل حفز P مدة ½ في ماكس (ثانية)، والحد الأقصى انتشار المكاني (2 ميكرون) لكلا التحكم (العمود الأيسر) ومادة رسوم بيانية من المعلمات من السعة الذروة (F/F0) تقديمها باستخدام R لمعالجة بيانيا الإخراج من LC_pro. وخاصة، وسعت مادة P تحفيز عدد من الأحداث، وتسبب تحولا كبيرا في الحق سعة الوسيط والمدة التي كتبها مان ويتني U اختبار (ف <0.01).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

سوف فك معقدة كا 2 + إشارات على المستوى الخلوي وتتطلب نهجا متعددة الخلايا التجريبية والتحليلية الصارمة. هنا، يوصف هذا النهج في الوقت الذي تتعرض حل تسلسلات الصور متحد البؤر كا 2 + مضان تعتمد على تحليل الآلية التي تحدد والكمي كا 2 + إشارات ذات الصلة إحصائيا في مجالات الخلوية سليمة وفي حالة محددة قدمت، وكان الجزء الشريان معزولة من قلب خنزير، يشبك فتح لفضح البطانة، محملة كا 2 + المؤشر فلوو-4 صباحا، تعرض للمتحد البؤر التصوير، وتقييمها مع خوارزمية مخصصة LC_Pro. تم تصميم هذه الخوارزمية ل1) كشف وتعقب المواقع الديناميكية كا 2 + تغيير أعلاه إحصائية (ع <0.01) الضوضاء، 2) تحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) تلقائيا في مراكز موقع نشط، و3) تحليل متوسط ​​كثافة مضان في رويس لتحديد المعلمات حدث معين. النهجيتغلب على القيود الرئيسية من البحوث البيولوجية عن طريق الحد من الإشارات الخطأ المستخدم والتحيز، والحد بشكل كبير حاليا تحليل الوقت، وتوفير فهرس كامل للإشارات عبر حقل لتمييز ملامح ممثل أو الأنماط. تتم معالجة الإخراج من LC_Pro مزيد من البرامج النصية من خلال R، وتوفير تقارير المعلمة الكامل للتجارب الفردية، بما في ذلك جودة عالية الانتاج الرسومية.

عدة خطوات مهمة لأداء السليم للتقنية وصفها. يجب أن يتم تنفيذ الإجراء تشريح الأنسجة (الخطوة 1.1.1) بعناية من أجل تجنب تعرية أو ضرر من طبقة الخلايا البطانية. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون تسلسل الصورة في شكل مناسب (الخطوة 2.1) للمنطقة آليا من خوارزمية الفائدة للعمل بشكل صحيح. على سبيل المثال، إذا كان هناك معلومات على نطاق والمرتبطة مع الملف، والمناطق ذات الاهتمام سينصب بشكل غير صحيح وفقا المواقع بكسل، بدلا من المواقع حدة تحجيمها. أيضا، واختيار إعادة مناسبةجيون من قطر الفائدة أمر بالغ الأهمية لأداء التحليل الآلي للنشاط الفلورسنت بشكل صحيح ضمن تسلسل الصور. قد يؤدي صغيرة جدا قيمة قطر في القياسات زائدة عن الحاجة، في حين كبيرة جدا يبلغ قطرها سيؤدي إلى استبعاد إشارات خفية.

المزالق المحتملة لهذه التقنية تتعلق أساسا حساسية التحليل الآلي لXY التحولات في تسلسلات الصور وسجلت للإشارة التشبع و / أو التبييض، والتي قد تؤدي إلى نتائج سلبية أو إيجابية كاذبة كاذبة. الانجرافات الأبعاد أو تحولات قد تكون موجهة مباشرة من خلال استخدام برمجيات تسجيل المكدس وتعيين دقيق لفترات حيث يتم إدخال الاضطرابات. ويمكن أيضا أن يكون الأمثل مستويات الرمادي والمعلمات قطر العائد على الاستثمار لإعداد معين مسبقا لجمع البيانات من أجل توحيد مجموعات البيانات الخام.

لأنه بمثابة نهج موحد لأية إشارة مضان ديناميكية، وصفت تحليل حيحرث هو مناسبة لهيئة متنوعة من التطبيقات. في الأوعية الدموية، يجري استخدام هذا الأسلوب لتحديد الفسيولوجية مميزة وطرائق إشارة المرضية في جسم المريض في سرير الأوعية الدموية متعددة تحت القاعدية وحفزت الظروف 25،26. كما يجري تطبيقه في تتبع الآلي من كا 2 + الأمواج. في نهاية المطاف، فإن مثل التحليل الآلي العالمية أن يكون محور حاسما في فك رموز مكانيا وزمانيا إشارات الحيوية المعقدة وإنشاء خلية جديدة ونماذج متعددة الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح HL-085887، HL-092992، S10RR027535، وMOP-93676.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection dish Fisher Sci #08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS) Fisher Sci #NC9644388 elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS Sigma #H3375-250G HEPES acid
Stereomicroscope Nikon Inst. #MNA42000
Forceps Fine Science Tools #11223-20
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
Tungsten wire Scientific Inst Svcs #406
Fluo-4 AM Life Tech. #F-14201
Pluronic F-127 Life Tech. #P3000MP
Metal pins Fine Science Tools #26002-10
Cover-glass bottom chamber Custom designed
Spinning disc confocal microscope Perkin Elmer RS-3
ImageJ software download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, (6410), 315-325 (1993).
  2. Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, (1), 11-21 (2000).
  3. Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12, (2-3), 217-227 (1991).
  4. Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
  5. Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. J Pharmacol Toxicol Methods. 31, (1), 1-10 (1994).
  6. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
  7. Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5, (3), (2010).
  8. Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31, (7), 2607-2614 (2011).
  9. Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49, (1), 66-77 (2011).
  10. Paredes, R. M., et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46, (3), 143-151 (2008).
  11. Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5, (2), 132-134 (2000).
  12. Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
  13. Gaspers, L. D., Thomas, A. P. Calcium signaling in liver. Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).
  14. Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113, (3-4), 295-305 (1992).
  15. Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44, (2), 135-146 (2008).
  16. Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451, (1-2), 371-375 (1988).
  17. Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127, (2), 157-166 (2003).
  18. Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63, (6), 747-760 (2009).
  19. Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34, (1), 94-108 (2007).
  20. Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90, (6), 2151-2163 (2006).
  21. Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76, (2), 606-617 (1999).
  22. Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293, (3), (2007).
  23. Abramoff, M. D., et al. Image processing with ImageJ. Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).
  24. Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303, (3), (2012).
  25. Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20, (2), 138-148 (2013).
  26. Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19, (5), 423-429 (2012).
  27. Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, (2), (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics