गतिशील सीए के स्वचालित विश्लेषण

Biology

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Summary

यहाँ दो आयामी समय चूक छवि दृश्यों के भीतर सकारात्मक संकेत के क्षेत्रों को सौंपा सबसे फिट ellipses छँटाई के आधार पर ब्याज विश्लेषण प्रोटोकॉल का एक उपन्यास क्षेत्र का प्रदर्शन किया है. इस एल्गोरिथ्म व्यापक न्यूनतम उपयोगकर्ता इनपुट और पूर्वाग्रह के साथ शारीरिक सीए 2 + संकेतों का विश्लेषण करने के लिए जांचकर्ताओं सक्षम हो सकता है.

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Francis, M., Waldrup, J., Qian, X., Taylor, M. S. Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences. J. Vis. Exp. (88), e51560, doi:10.3791/51560 (2014).

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Abstract

Intracellular सीए 2 + संकेतों सामान्यतः फ्लोरोसेंट सीए 2 + सूचक रंगों और माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ अध्ययन कर रहे हैं. हालांकि, सीए 2 + इमेजिंग डेटा का मात्रात्मक विश्लेषण समय लगता है और पूर्वाग्रह के अधीन है. ब्याज (आरओआई) का पता लगाने के क्षेत्र के आधार पर स्वचालित सिग्नल विश्लेषण एल्गोरिदम एक आयामी लाइन स्कैन माप के लिए लागू किया गया है, लेकिन दो आयामी छवि दृश्यों में अनुकूलित पहचान और ROIs का विश्लेषण जो एकीकृत कोई मौजूदा एल्गोरिथ्म है. यहाँ छवि दृश्यों में तेजी से अधिग्रहण और ROIs के विश्लेषण के लिए एक एल्गोरिथ्म वर्णन किया गया है. यह ellipses इष्टतम आरओआई प्लेसमेंट का निर्धारण करने के क्रम में शोर फ़िल्टर्ड संकेतों को फिट इस्तेमाल करता है, और आयाम, अवधि और स्थानिक प्रसार के सीए 2 + संकेत मापदंडों गणना करता है. इस एल्गोरिथ्म ImageJ (एनआईएच) सॉफ्टवेयर के लिए एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध प्लगइन के रूप में लागू किया गया था. एक साथ खुला स्रोत सांख्यिकीय प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर अनुसंधान के लिए लिखा विश्लेषण स्क्रिप्ट के साथ,इस दृष्टिकोण प्रायोगिक उत्पादन के त्वरित सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए एक उच्च क्षमता की पाइप लाइन में हैं. लेखक इस विश्लेषण प्रोटोकॉल का उपयोग शारीरिक सीए 2 + संकेतन की एक और पूरी और निष्पक्ष लक्षण वर्णन करने के लिए नेतृत्व करेंगे कि सुझाव देते हैं.

Introduction

सीए 2 + अणु और साइटोसोलिक सीए 2 + स्तर अत्यधिक विनियमित रहे हैं संकेत एक देशव्यापी दूसरा दूत है. Intracellular सीए 2 + संकेतों जटिल होते हैं और अलग - अलग यात्रियों, दोलनों, और लहरों 1 प्रचार में शामिल हैं - 4. सीए 2 + के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण शारीरिक संकेत विशिष्टता आबाद सोचा, और इसलिए सीए 2 + संकेत पैटर्न के विश्लेषण के कई क्षेत्रों 5 में जांचकर्ताओं को काफी रुचि है.

ऐसे Fluo 4 और Fura-2 के रूप में सीए 2 + सूचक रंगों सामान्यतः प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 5-12 के साथ intracellular सीए 2 + संकेतों को मापने के लिए कार्यरत हैं. 16 - आमतौर पर, अस्थायी सीए 2 + संकेतों समय पर निर्भर एक उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्र के भीतर मतलब प्रतिदीप्ति में परिवर्तन, या हित के क्षेत्र (आरओआई) 5,6,13 के रूप में मूल्यांकन कर रहे हैं. वर्तमान में, पुस्तिका रॉय विश्लेषण समय लगता है और श्रम दोनों में है19 - यह कई ROIs की पहचान और दोहराव संगणना 17 प्रदर्शन करने के लिए उपयोगकर्ताओं की आवश्यकता है क्योंकि तनाव बनानेवाला. इन तकनीकों में भी कृत्रिम संकेत मोड और कम आयाम या फैलाना संकेतों 18,20 के बहिष्कार की शुरूआत सहित काफी उपयोगकर्ता त्रुटि के लिए विषय हो सकता है.

, स्वचालित आरओआई का पता लगाने एल्गोरिदम पहले से इष्टतम आरओआई नियुक्ति निर्धारित करने के लिए सांख्यिकीय तरीकों की एक किस्म का उपयोग कर लागू किया गया है, लेकिन वे आम तौर पर लाइन स्कैन या छद्म लाइन समय 17 में एक भी स्थानिक आयाम के विश्लेषण प्रतिबंधित जो स्कैन छवियों का विश्लेषण करने के लिए सीमित कर दिया गया है 19-22. साथ ही, कई मौजूदा एल्गोरिदम सीए आवधिक, स्थानीय यात्रियों से प्रचार लहरों 23,24 को लेकर 2 + रिहाई की घटनाओं की विविधता धरना पर्याप्त नहीं हैं. शारीरिक सीए 2 + संकेतों के व्यापक मूल्यांकन अक्सर आगे महत्वपूर्ण छवि artif की उपस्थिति से जटिल हैकि कई प्रायोगिक प्रणाली में शोर भेदभाव करने के संकेत घालमेल कर काम करते हैं.

इससे पहले, सीए करने के लिए एक स्वचालित आरओआई का पता लगाने एल्गोरिथ्म समाधान 2 + (स्वास्थ्य, बेथेस्डा, एमडी के राष्ट्रीय संस्थान), विकसित और 25,26 मान्य किया गया था एनआईएच ImageJ सॉफ्टवेयर के लिए एक प्लगइन के रूप में लागू किया, क्षणिक पता लगाने के संकेत. LC_Pro कहा जाता है इस कलन, दो आयामी समय चूक छवि दृश्यों में सीए 2 + संकेत यात्रियों को शामिल ROIs की पहचान करने और विश्लेषण करने के लिए डिजाइन किया गया था. यहाँ एक व्यावहारिक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और सुअर का कोरोनरी धमनी endothelium में एल्गोरिथ्म के एक आवेदन के प्रतिनिधि प्रदर्शन प्रयोज्य चित्रमय उत्पादन उत्पन्न करने के लिए खुला स्रोत सांख्यिकीय प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर अनुसंधान का उपयोग अतिरिक्त postprocessing साथ, प्रदान की जाती है.

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Protocol

1. पोत विच्छेदन और इमेजिंग

  1. Martens एट अल 27 में वर्णित के रूप में घरेलू किशोर सूअरों से फसल ऊतक. एक polydimethylsiloxane (PDMS) HEPES शारीरिक खारा समाधान (पीएसएस) बफर युक्त नीचे विच्छेदन डिश में काटा स्वाइन सही निलय रखें.
    1. एक stereomicroscope की सहायता के साथ, काटना और आसपास के हृदय ऊतक परतों से पोत खंड निकाल कर संदंश और वसंत कैंची का उपयोग आसपास के ऊतकों से कोरोनरी धमनी (~ 8 मिमी लंबाई, 0.5 मिमी व्यास) उतरते बाएँ पूर्वकाल के एक खंड को हटा दें. नोट: पोत दीवार पंचर नहीं करने के लिए ध्यान रखना.
    2. विच्छेदन डिश में एक PDMS ब्लॉक (1 x 0.5 x 0.5 सेमी) रखें, और नीचे करने के लिए यह पिन करने के लिए एक सुई का उपयोग करें. Micropins बनाने, बारह ~ 0.3 सेमी लंबाई खंडों में एक लगभग 40 माइक्रोन व्यास टंगस्टन तार कट, और डिश में इन जगह है. संदंश का प्रयोग, एक micropi साथ ब्लॉक पोत खंड के एक छोर सुरक्षितएन.
    3. ध्यान से पोत लुमेन में छोटे वसंत कैंची डालें, और यह पूरी तरह से खोलने के लिए पोत के एक तरफ नीचे longitudinally कटौती. अन्तःचूचुक अप के साथ खुला पोत खंड पूरबी.
    4. पोत एक फ्लैट आयत रूपों कि इस तरह के ब्लॉक करने के लिए खोला पोत खंड की सीमाओं को सुरक्षित करने के लिए शेष micropins का प्रयोग करें. नोट: Micropin सबसे ऊपर 90 डिग्री तक तुला और ब्लॉक सतह से भरा है जब तक डाला जाना चाहिए. केयर overstretching बिना पोत तैयारी फैलाने के लिए लिया जाना चाहिए; अंतिम चौड़ाई आरंभिक unstretched चौड़ाई 1.5x किया जाना चाहिए.
    5. 134 NaCl, 6 KCl: एक HEPES में pluronic (0.03%) के साथ DMSO में भंग Fluo 4 AM (10 माइक्रोन) के मिश्रण से Fluo 4 AM लोड हो रहा समाधान की एक छोटी मात्रा (~ 1 एमएल) तैयार मिमी में युक्त पीएसएस (बफर , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 ग्लूकोज), और अंधेरे में कमरे के तापमान पर लगभग 40 मिनट के लिए लोड हो रहा समाधान में पूरे ब्लॉक डालें.
    6. लोड करने के बाद, बफर HEPES में ब्लॉक धोने5-10 मिनट के लिए पी एस एस.
    7. HEPES पीएसएस बफर युक्त एक coverglass नीचे कक्ष में 50-100 माइक्रोन मोटी spacers पर ब्लॉक माउंट. नोट: धातु पिन spacers के रूप में इस्तेमाल किया और पोत खंड नीचे का सामना करना पड़ और spacers छू नहीं है यह सुनिश्चित किया जा सकता है.
    8. Confocal इमेजिंग के लिए सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर चैम्बर रखें, और endothelial सेल परत पर ध्यान केंद्रित.
    9. ~ 3 20X बढ़ाई मिनट और confocal छवि अनुक्रम अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रति सेकंड ~ 8 तख्ते के एक फ्रेम दर के लिए बेसल रिश्तेदार प्रतिदीप्ति का कब्जा समय चूक छवि दृश्यों.
    10. बेसल प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग की ~ 3 मिनट के बाद, HEPES एक addtional 3 मिनट के लिए एक ही HEPES में पीएसएस बफर भंग पदार्थ पी (100 बजे) की मात्रा (~ 1 मिलीग्राम), और रिकॉर्ड के साथ पीएसएस समाधान बफर जगह.

2. स्वचालित विश्लेषण

  1. 8 बिट, जी के रूप में confocal अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से फ्लोरोसेंट कैल्शियम गतिविधि की छवि अनुक्रम (ओं) प्रस्तुत करनाकोई पैमाने जानकारी के साथ rayscale '. TIF' प्रारूप फ़ाइलें.
  2. ओपन ImageJ, फ़ाइल मेनू में 'खुला', क्लिक करें और ImageJ में छवि अनुक्रम (ओं) को देखने के लिए Explorer विंडो में उपयुक्त छवि अनुक्रम का चयन करें.
  3. छवि अनुक्रम (ओं) के भीतर गतिविधि के स्थानिक प्रसार के ऊपरी और निचले सीमाओं अनुमान लगाने के लिए आयताकार आरओआई उपकरण का उपयोग करके एक उचित लागत पर लाभ व्यास निर्धारण करते हैं. नोट: मतलब आयताकार व्यास आरओआई व्यास के लिए एक उपयुक्त विकल्प है.
  4. कंप्यूटर की हार्ड ड्राइव पर एक नया फ़ोल्डर बनाएँ, और फ़ोल्डर निर्देशिका में छवि अनुक्रम (ओं) को जोड़ने.
  5. ImageJ में, 'प्लगइन्स' विंडो पर क्लिक करें, फिर विश्लेषण शुरू करने के लिए 'LC_Pro' पर क्लिक करें.
  6. आरओआई व्यास मूल्य दर्ज करें और फिल्टर दहलीज मूल्य (0.05 या 0.01 या तो) का चयन करें.
  7. 'दवा इलाज' चेकबॉक्स क्लिक करें और तुरंत पहले और बाद में दवा जोड़ा गया है (सेकंड में) समय बात मान दर्ज करें.
  8. 'ठीक' क्लिक करें, औरफ़ाइल Explorer विंडो में छवि अनुक्रम निर्देशिका दर्ज करें.

3. ग्राफिकल उत्पादन

  1. से आर संस्करण 3.0.2 डाउनलोड http://www.r-project.org/ .
  2. आर के 32 बिट संस्करण खोलें
  3. "फाइल", तो 'खुला स्क्रिप्ट' पर क्लिक करें और ग्राफिकल प्रयोगात्मक रिपोर्ट उत्पन्न करने के लिए 'traceplot.R' आर स्क्रिप्ट का चयन करें.
  4. 'पैकेज' का चयन करके जांचना, और gplots संकुल स्थापित करें, 'संकुल स्थापित', और appropirate संकुल चयन.
  5. 'परिवर्तन' निर्देशिका कमान फिर, 'फाइल' पर क्लिक करें, और LC_Pro विश्लेषण उत्पादन से मेल खाती है कि निर्देशिका का चयन करने के लिए Explorer विंडो का उपयोग करें.
  6. स्क्रिप्ट खिड़की पर क्लिक करें और फिर 'चलाने के सभी' स्क्रिप्ट चलाने के लिए आदेश.

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Representative Results

एक कस्टम एल्गोरिथ्म, LC_Pro, विकसित और सीए के स्वचालित विश्लेषण करने के क्रम में लागू किया गया था confocal छवि दृश्यों पर 2 + गतिशीलता. चित्र 1 में दर्शाया के रूप में, एल्गोरिथ्म एक) का पता लगाने और गतिशील सीए का ट्रैक साइटों कि अनुक्रमिक प्रसंस्करण मॉड्यूल का इस्तेमाल 2 + <0.01) शोर, बी) सक्रिय साइट केन्द्रों पर स्वचालित रूप से ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों को परिभाषित है, और सांख्यिकीय (पी ऊपर बदलने सी) विशिष्ट घटना के मानकों का निर्धारण करने के लिए ROIs में औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना. एल्गोरिथ्म के एक ग्राफिक अवलोकन ज्ञात तीव्रता और स्थान के कंप्यूटर जनित गाऊसी दालों (चित्रा 2) का उपयोग करते हुए दिखाया गया है. संकेत दालों (आंकड़े 2A और बी) एक मानक सामान्य वितरण के लिए z-स्कोर का उपयोग बाइनरी बदल रहे थे, और सबसे फिट ellipses संकेत सीमा से ऊपर पिक्सेल लोकी (चित्रा -2) को सौंपा गया. एक दीर्घवृत्त छँटाई एल्गोरिथ्म determi के लिए इस्तेमाल किया गया थापूर्वोत्तर के इष्टतम आरओआई प्लेसमेंट (चित्रा 2 डी). आरओआई समय बनाम तीव्रता तब मापा गया था और आयाम, अवधि और स्थानिक प्रसार के संकेत मापदंडों (चित्रा 2 ई) का अभिकलन थे मतलब. इस विश्लेषण दृष्टिकोण बरकरार संवहनी endothelium में सेलुलर सीए 2 + गतिशीलता का आकलन करने के लिए लागू किया गया था. विशेष रूप से, confocal इमेजिंग चित्रा 3 में वर्णित के रूप में खोला स्वाइन कोरोनरी धमनियों में प्रदर्शन किया गया था, और कलन विधि अलग सीए 2 + मापदंडों यों के लिए ऑफ़लाइन कार्यरत था. (100 बजे सपा), और LC_Pro विश्लेषण बाद में प्रदर्शन किया गया था कि इन प्रयोगों के लिए, सतत रिकॉर्डिंग endothelial प्रोत्साहन पदार्थ पी के अलावा पहले और बाद में किए गए थे. प्रत्येक रॉय के भीतर संकेत स्केलिंग के लिए, baselines प्रयोगात्मक समय के पाठ्यक्रम पर आरओआई तीव्रता के रेखीय प्रतिगमन (चित्रा 4) के रूप में प्राप्त किए गए. इसका मतलब यह संकेत तीव्रता मूल्यों प्रत्येक रॉय (चित्रा -4 ए) के लिए अभिकलन, और मतलब ऊपर मूल्यों TRUNC थे मतलब करने के लिए पैदा होते हैं और एक रेखीय प्रतिगमन संकेत आधारभूत (चित्रा 4 बी) लगभग करने के लिए प्रदर्शन किया था. अंत में, कच्चे तीव्रता मूल्यों आधारभूत (चित्रा 4C) के साथ बदल गुना करने के लिए मूल्यों को बदलने के लिए प्रतिगमन लाइन के मान से भाग गया. 5 अन्तःचूचुक (चित्रा 5A) में सीए 2 + निर्भर प्रतिदीप्ति की छवियों सहित, एक प्रतिनिधि प्रयोग से पता चलता है, सपा इलाज से पहले और बाद बाइनरी जांचा क्षेत्र (चित्रा 5 ब) के भीतर का पता लगाया कुल सीए 2 + संकेत के मास्क, और प्रत्येक रॉय (चित्रा 5C) पर औसत प्रतिदीप्ति की रिकॉर्डिंग जमा. इसके बाद पैरामीटर का विश्लेषण आर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया था. जिसके परिणामस्वरूप हिस्टोग्राम घटना आयाम, अवधि, और स्थानिक प्रसार (चित्रा 6) पर सपा के amplifying प्रभाव दिखाते हैं.

560/51560fig1highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
चित्रा 1. एल्गोरिथ्म प्रक्रियाओं का संकेत प्रवाह चार्ट (यह आंकड़ा फ्रांसिस एट अल से अनुमति के साथ प्राप्त हुई थी.) 24. इमेज प्रोसेसिंग, घटना प्रसंस्करण, और ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) प्रसंस्करण: एल्गोरिथ्म तीन वर्गों में आयोजित किया गया था. छवि दृश्यों प्रवाह श्रृंखला में निवेश कर रहे हैं, और घटना के आँकड़े अंतिम आउटपुट के रूप में उत्पन्न कर रहे हैं. कलन विधि की इमेज प्रोसेसिंग (ए) उपनेमका एक मानक सामान्य वितरण और ImageJ कण विश्लेषण के लिए z-स्कोर का उपयोग, thresholding द्वारा सबसे फिट ellipses की एक सूची में इनपुट छवि अनुक्रम धर्मान्तरित. घटना प्रसंस्करण (बी) के समय से घटना "साइट" में अंडाकार स्थानों के आयोजन से इष्टतम आरओआई स्थिति को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल एक छँटाई उपनेमका है. बाद तीव्रता माप प्रत्येक रॉय पर ले रहे हैं मतलब है, हर घटना और साइट के लिए सांख्यिकीय मानकों आरओआई प्रसंस्करण उपनेमका (सी <से गणना कर रहे हैंअंतिम उत्पादन उत्पन्न करने के लिए)> / मजबूत. BKGD, पृष्ठभूमि; औसत, औसत. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
एक कंप्यूटर जनित गाऊसी नाड़ी का उपयोग कर स्वचालित आरओआई अधिग्रहण और संकेत का पता लगाने के चित्रा 2. प्रदर्शन (यह आंकड़ा फ्रांसिस एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था.) 24. किसी एक कंप्यूटर जनित संकेत नाड़ी (ए) यादृच्छिक पृष्ठभूमि शोर में एम्बेडेड था. ग्रे स्केल छवि अनुक्रम स्थिर पृष्ठभूमि पिक्सेल मूल्यों (बी) को हटाने के लिए फ़िल्टर और पी की दहलीज पिक्सेल तीव्रता मूल्यों का प्रयोग बाइनरी परिवर्तित कर दिया गया <मानक स्कोर (सी) द्वारा गणना 0.05. ImageJ कण विश्लेषण algorithएमएस तो प्रत्येक फ्रेम के भीतर पिक्सेल स्थलों के लिए सबसे फिट ellipses आवंटित करने के लिए छवि अनुक्रम करने के लिए लागू किया गया. एक उपन्यास एल्गोरिथ्म असतत लौकिक "घटनाओं" में समूह ellipses के लिए इस्तेमाल किया और मतलब अंडाकार केंद्र (डी) के आधार पर प्रत्येक रॉय के लिए इष्टतम स्थिति को निर्धारित किया गया था. उपयोगकर्ता परिभाषित त्रिज्या का एक रॉय तो प्रत्येक स्थिति (डॉटेड सर्कल) पर रखा गया है. एक रॉय भीतर मतलब तीव्रता मूल्यों प्रत्येक फ्रेम के लिए गणना की और एक रेखीय आधारभूत सन्निकटन का उपयोग पहुंचा रहे हैं. एक इसी आरओआई ट्रेसिंग (ई) के लिए मानक स्कोर द्वारा परिभाषित के रूप में शिखर आयाम पी ऊपर स्थानीय Maxima <0.05 के रूप में पहचान की है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. Porci पूर्वोत्तर कोरोनरी धमनी विच्छेदन प्रोटोकॉल. कोरोनरी धमनी (1 छवि, डॉटेड सर्कल) उतरते बाएँ पूर्वकाल के लगभग 0.5 मिमी व्यास x 8 मिमी लंबाई शाखाओं आसपास मायोकार्डियम से विच्छेदित किए गए. पोत क्षेत्रों बाह्यास्तर अथवा किसी अंग की बनावट के बाहरी आवरण संबंधित ऊतक आसपास की छंटनी की और छोटे कैंची (2 छवि) के साथ लंबाई में काट रहे थे. अगला, खोला जहाजों ठीक टंगस्टन तारों (3 छवि) का उपयोग कर एक PDMS ब्लॉक करने के लिए फ्लैट टिकी थे. घुड़सवार पोत क्षेत्रों, Fluo 4 सीए 2 + सूचक डाई के साथ लोड धोया, और फिर एक coverglass तली इमेजिंग कक्ष में रखा गया था. छवियाँ 20X बढ़ाई एकत्र किए गए थे (488 पूर्व., 510 उन्हें.) एक औंधा confocal खुर्दबीन का उपयोग कर प्रति सेकंड 8.0 फ्रेम पर. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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चित्रा 4. आरओआई तीव्रता आधारभूत सन्निकटन मतलब है. प्रत्येक रॉय के लिए समय मापन (ठोस लाइनों) बनाम मतलब तीव्रता के बाद कच्चे तीव्रता मूल्यों निम्नलिखित आधारभूत सन्निकटन विधि का उपयोग F/F0 तक पहुंचा रहे हैं. नियंत्रण अवधि के दौरान मतलब संकेत तीव्रता (धराशायी लाइन) उपयोगकर्ता परिभाषित नियंत्रण और इलाज के अंतराल मूल्यों (ए) से की जाती है. समय पर निर्भर संकेत तीव्रता वक्र तो आधारभूत सन्निकटन से गतिविधि को फिल्टर करने के लिए मतलब नियंत्रण तीव्रता मतलब नियंत्रण तीव्रता से ऊपर काट दिया गया है, और एक रेखीय प्रतिगमन परिणामी वक्र (बिंदीदार रेखा) (बी) पर किया जाता है. अंत में, कच्चे तीव्रता मूल्यों गणना रैखिक आधारभूत (सी) के लिए पहुंचा रहे हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


चित्रा 5. प्रतिनिधि बेसल की LC_Pro विश्लेषण से परिणाम और सीए 2 + गतिशीलता को प्रेरित किया. एक पदार्थ पी उत्तेजित नमूना अंतराल (ए, सही पैनल द्वारा पीछा एक बेसल नमूना अंतराल (ए, बाएं पैनल) के एक इनपुट छवि अनुक्रम का समय व्यतीत हो छवियों ) स्केल में दिखाया गया. समय चूक छवि बेसल के लिए सबसे अच्छा फिट ellipses के दृश्यों और अंतराल (बी) LC_pro द्वारा गाया गया था प्रेरित किया. अंत में, ब्याज (आरओआई) में से प्रत्येक के लिए स्वचालित रूप से तैनात क्षेत्र से समय पर निर्भर बढ़ाया तीव्रता घटता (सी) दिखाए जाते हैं.

चित्रा 6
चित्रा 6. Histogramsएक प्रतिनिधि प्रयोग से पैरामीटर वितरण (4 चित्रा). शिखर आयाम के मापदंडों (F/F0) से histograms, पर साढ़े अधिकतम (एसईसी) की अवधि, और अधिकतम स्थानिक दोनों नियंत्रण के लिए प्रसार (माइक्रोन 2) (बाएँ स्तंभ) और पदार्थ पी उत्तेजित एक प्रतिनिधि प्रयोग से (सही कॉलम) की घटनाओं थे रेखांकन LC_pro से उत्पादन प्रक्रिया करने के लिए अनुसंधान का उपयोग कर गाया. विशेष रूप से, पदार्थ पी उत्तेजना की घटनाओं की संख्या का विस्तार किया, और मान व्हिटनी यू परीक्षण (पी <0.01) द्वारा मंझला आयाम और अवधि में एक महत्वपूर्ण सही बदलाव का कारण बना.

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Discussion

सेलुलर और बहुकोशिकीय स्तर पर जटिल सीए 2 + संकेतों Decoding कठोर प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण की आवश्यकता होगी. इधर, एक दृष्टिकोण सीए 2 + निर्भर प्रतिदीप्ति का संकल्प लिया confocal छवि दृश्यों प्रस्तुत विशिष्ट मामले में बरकरार सेलुलर क्षेत्र के भीतर सांख्यिकीय प्रासंगिक सीए 2 + संकेतों को पहचानती है और quantifies कि एक स्वचालित विश्लेषण के अधीन हैं जो समय में वर्णित है, एक धमनी खंड पृथक किया गया सुअर दिल से, टिकी confocal इमेजिंग के अधीन सीए 2 + सूचक Fluo 4 AM साथ भरी हुई अन्तःचूचुक, बेनकाब करने के लिए खोला, और कस्टम एल्गोरिथ्म LC_Pro साथ मूल्यांकन किया है. इस एल्गोरिथ्म 1 के लिए डिज़ाइन किया गया है) का पता लगाने और गतिशील सीए का ट्रैक साइट्स 2 + <0.01) शोर, 2) सक्रिय साइट केन्द्रों पर स्वतः) (आरओआई हित के क्षेत्रों को परिभाषित है, और 3) ROIs में औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण सांख्यिकीय (पी ऊपर बदलने विशिष्ट घटना के मानकों का निर्धारण करने के लिए. दृष्टिकोण, उपयोगकर्ता त्रुटि और पूर्वाग्रह को कम करने में काफी ऑफ़लाइन विश्लेषण के समय को कम करने, और प्रतिनिधि प्रोफाइल या पैटर्न विचार करने के लिए एक क्षेत्र में संकेतों के एक पूर्ण सूचकांक प्रदान करके जैविक संकेतन अनुसंधान के प्रमुख सीमाओं पर काबू. LC_Pro से आउटपुट आगे उच्च गुणवत्ता चित्रमय उत्पादन सहित व्यक्तिगत प्रयोगों के लिए पूरी पैरामीटर रिपोर्ट, प्रदान करने, अनुसंधान लिपियों के माध्यम से कार्रवाई की है.

कई चरणों में वर्णित तकनीक का उचित प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं. ऊतक विच्छेदन प्रक्रिया (कदम 1.1.1) अनाच्छादन या endothelial सेल परत की क्षति से बचने के लिए सावधानी से किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, छवि दृश्यों के सही ढंग से काम करने के लिए ब्याज एल्गोरिथ्म के स्वचालित क्षेत्र के लिए उचित प्रारूप (2.1 कदम) में होना चाहिए. फ़ाइल के साथ जुड़े पैमाने जानकारी नहीं है अगर उदाहरण के लिए, हित के क्षेत्रों को गलत तरीके से नहीं बल्कि पहुंचा इकाई स्थानों से, पिक्सेल स्थानों अनुसार रखा जाएगा. इसके अलावा, एक उपयुक्त फिर से चुननेब्याज व्यास के इलाके को सही ढंग से एक छवि अनुक्रम के भीतर फ्लोरोसेंट गतिविधि के स्वचालित विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है. बहुत बड़ी एक व्यास सूक्ष्म संकेतों के बहिष्कार का परिणाम देगा, जबकि एक बहुत छोटा व्यास मूल्य, निरर्थक माप में हो सकता है.

इस तकनीक के संभावित नुकसान मुख्य रूप से दर्ज की छवि दृश्यों में बदलाव xy करने और झूठी सकारात्मक या नकारात्मक झूठी परिणामों में हो सकता है, जो संतृप्ति और / या विरंजन संकेत करने के लिए स्वचालित विश्लेषण की संवेदनशीलता से संबंधित हैं. आयामी drifts या बदलाव के ढेर पंजीकरण सॉफ्टवेयर और perturbations पेश कर रहे हैं, जहां के अंतराल के सटीक पद के प्रयोग के माध्यम से सीधे संबोधित किया जा सकता है. ग्रे स्तर और रॉय व्यास मानकों को भी कच्चे डेटा सेट मानकीकृत करने के क्रम में डेटा संग्रह के अग्रिम में एक भी तैयारी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

यह किसी भी गतिशील प्रतिदीप्ति संकेत के लिए एक मानक दृष्टिकोण के रूप में कार्य करता है, क्योंकि विश्लेषण घंटे वर्णितपहले आवेदन की एक विविध शरीर के लिए उपयुक्त है. Vasculature में, इस विधि बेसल के तहत कई संवहनी बेड में विशेषता शारीरिक और pathophysiological संकेत के तौर तरीकों को परिभाषित करने के लिए नियोजित और शर्तों 25,26 प्रेरित किया जा रहा है. यह भी सीए 2 + लहरों की स्वचालित ट्रैकिंग में लागू किया जा रहा है. अंत में, इस तरह के वैश्विक स्वचालित विश्लेषण spatially और अस्थायी परिसर जैव संकेतों का गूढ़ रहस्य में और नए सेल और बहु ​​- सेल मॉडल स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण लींचपीण हो जाएगा.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

इस काम के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था स्वास्थ्य अनुदान HL-085887, एच. एल-092992, S10RR027535, और एमओपी 93676.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection dish Fisher Sci #08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS) Fisher Sci #NC9644388 elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS Sigma #H3375-250G HEPES acid
Stereomicroscope Nikon Inst. #MNA42000
Forceps Fine Science Tools #11223-20
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
Tungsten wire Scientific Inst Svcs #406
Fluo-4 AM Life Tech. #F-14201
Pluronic F-127 Life Tech. #P3000MP
Metal pins Fine Science Tools #26002-10
Cover-glass bottom chamber Custom designed
Spinning disc confocal microscope Perkin Elmer RS-3
ImageJ software download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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