Автоматизированный анализ динамических Ca
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Department of Physiology, University of South Alabama

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Здесь роман регион протокола анализа процентной ставки, основываясь на сортировку наилучшего соответствия эллипсы, назначенные регионах позитивный сигнал в двумерное промежуток времени последовательности изображений демонстрируется. Этот алгоритм может позволить следователям всесторонне проанализировать физиологические Ca 2 + сигналы с минимальным пользовательского ввода и предвзятости.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Francis, M., Waldrup, J., Qian, X., Taylor, M. S. Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences. J. Vis. Exp. (88), e51560, doi:10.3791/51560 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Внутриклеточного Са 2 + сигналы, как правило, учился с флуоресцентными красителями Са 2 + индикаторов и методов микроскопии. Однако количественный анализ Ca 2 + данных изображений занимает много времени и при условии смещения. Автоматизированные алгоритмы анализа сигналов, основанные на интересующей области обнаружения (ROI) были реализованы для измерений одномерной линией сканирования, но нет текущий алгоритм, который объединяет оптимизированный выявление и анализ трансформирования в двумерных последовательностей изображений. Вот алгоритм для быстрого сбора и анализа трансформирования в последовательности изображений описывается. Он использует эллипсы подходят для шума с фильтром сигналов, чтобы определить оптимальное размещение ROI, и вычисляет Ca параметры 2 + сигнальные амплитуде, продолжительности и пространственного распространения. Этот алгоритм был реализован в виде свободно распространяемой плагин для ImageJ (NIH) программного обеспечения. Вместе с анализа сценариев, написанных для открытым исходным кодом статистической программного обеспечения обработки R,Такой подход обеспечивает высокую емкость трубопровода для выполнения быстрого статистического анализа экспериментальных выхода. Авторы полагают, что использование этого протокола анализа приведет к более полному и непредвзятой характеристике физиологической Ca 2 +-сигнализации.

Introduction

Са 2 + является повсеместное вторичный мессенджер молекулу и цитозольные Ca 2 + уровня сигнализации строго регулируется. Внутриклеточного Са 2 + сигналы сложны и включают отдельные переходные, колебания и распространяющихся волн 1 - 4. Пространственное и временное управление Ca 2 +, как полагают, лежат в основе физиологического специфику сигнала, и поэтому анализ Са 2 + шаблонов сигнала представляет значительный интерес для исследователей в нескольких полей 5.

Са 2 + индикатор красители, такие как Fluo-4 и Фура-2 обычно используются для измерения внутриклеточных 2 + сигналы Ca с флуоресцентной микроскопии 5-12. Как правило, временные Са 2 + сигналы оцениваются как зависящих от времени изменений в средней флуоресценции в пределах определенной пользователем области или области интереса (ROI) 5,6,13 - 16. В настоящее время, анализ эксплуатации КОРОЛЬ много времени и труда всоздающий напряжение, потому что это требует, чтобы пользователи определить многие трансформирования и выполнять повторяющиеся вычисления 17 - 19. Эти методы также могут быть подвержены значительным ошибки пользователя, в том числе введения искусственных режимов сигнала и исключения низкой амплитуде или диффузных сигналов 18,20.

Автоматизированные алгоритмы обнаружения ROI ранее были реализованы с использованием различных статистических подходов, чтобы определить оптимальное размещение ROI, но они, как правило, ограничен анализа строчной развертки или псевдо-линии сканирования изображений, что ограничивает анализ для одного пространственного измерения в момент 17, 19 - 22. Кроме того, многие существующие алгоритмы не являются адекватными, чтобы охватить все разнообразие Ca 2 событий + релиз, которые варьируются от периодических локализованных переходных к распространяющихся волн 23,24. Комплексная оценка физиологических 2 + сигналов Са часто осложняется наличием значительного искусственн изображениядействовать, что смешивает сигнал к дискриминации шума во многих экспериментальных системах.

Ранее, автоматизированная обнаружения ROI алгоритм решения к Са 2 + сигнал переходный обнаружения, реализован в виде плагина для программного обеспечения NIH ImageJ (Национальные Институты Здоровья, Bethesda, MD), была разработана и утверждена 25,26. Этот алгоритм, называемый LC_Pro, был разработан, чтобы выявить и проанализировать трансформирования охватывающие Ca 2 + сигналов переходных процессов в двумерных изображений последовательностей промежуток времени. Вот практический экспериментальный протокол и представитель демонстрация применения алгоритма в свиной эндотелия коронарных артерий обеспечивается, с дополнительной постобработки с помощью с открытым исходным кодом статистического программного обеспечения для обработки R генерировать полезную графический вывод.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Вскрытие судно и обработка изображений

  1. Урожай ткани из внутренних несовершеннолетних свиней, как описано в Мартенса и др. 27. Поместите собранные свиного правый желудочки в полидиметилсилоксана (PDMS) нижняя рассечение блюдо с HEPES буферный физиологический раствор (PSS).
    1. С помощью стереомикроскопа, анализировать и удалить сегмент левой передней нисходящей коронарной артерии (~ длина 8 мм, диаметр 0,5 мм) от окружающей ткани с помощью щипцов и пружинные ножницы удалением сегмента сосуда от окружающих слоев сердечной ткани. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проколоть стенку сосуда.
    2. Поставьте PDMS блок (1 х 0,5 х 0,5 см) в рассечение блюдо, и использовать иглу, чтобы повесить это на дно. Вырежьте примерно 40 мкм диаметром вольфрамовой проволоки на двенадцать ~ сегменты длиной 0,3 см, образуя micropins, и разместить их в блюдо. Использование щипцов, обеспечить один конец сегмента сосуда к блоку с micropiн.
    3. Осторожно вставьте небольшие весенние ножницы в просвете сосуда, и разрезаются вдоль по одной стороне судна, чтобы открыть его полностью. Расположите открытый сегмент сосуда с эндотелия вверх.
    4. Используйте оставшиеся micropins обеспечить границы открывшемся сегмента сосуда, чтобы блокировать такие, что судно образует плоский прямоугольник. ПРИМЕЧАНИЕ: Micropin вершины должны быть согнуты на 90 ° и не вставлены заподлицо с поверхности блока. Следует проявлять осторожность, чтобы растянуть подготовку судна без перенапряжения; Окончательный ширина должна быть ~ 1.5x стартовый Unstretched ширину.
    5. Подготовка небольшого объема (~ 1 мл) Fluo-4 утра загрузки раствора путем смешивания Fluo-4 утра (10 мкм), растворенный в ДМСО с плюрониевого (0.03%) в забуференном HEPES PSS (содержащий в мМ: NaCl 134, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 глюкозы), и вставьте весь блок в загрузочный решение для примерно 40 мин при комнатной температуре в темноте.
    6. После загрузки, мыть блок, в HEPES буферныхPSS в течение 5-10 мин.
    7. Установите блок на 50-100 толстыми прокладками мкм в покровного стекла нижней камере, содержащей HEPES буферный PSS. Примечание: Металлические штифты могут быть использованы в качестве распорок и обеспечить сегмент сосуд вниз и не касаясь распорки.
    8. Наведите камеру на сцене инвертированного микроскопа, оснащенного для конфокальной микроскопии, и сосредоточиться на эндотелиальной слоя клеток.
    9. Время захвата покадровой последовательности изображений базального относительной флуоресценции для ~ 3 мин при 20-кратным увеличением и частотой кадров ~ 8 кадров в сек с использованием конфокальной изображения последовательность aquisition программного обеспечения.
    10. После ~ 3 мин записи базальной флуоресценции, заменить HEPES буферный раствор PSS с таким же объемом (~ 1 мл) вещества Р (100 мкм), растворенного в забуференном HEPES PSS и записи для ДОПОЛНИТЕЛЬНО 3 мин.

2. Автоматизированный анализ

  1. Рендер последовательность (ы) изображения флуоресцентного деятельности кальция из конфокальной приобретения программного обеспечения, как 8 бит, гrayscale '. TIF' файлы формата, не имеющие масштабной информации.
  2. Открыть ImageJ, нажмите «открытой» в меню файла и выберите соответствующую последовательность изображений в окне проводника, чтобы просмотреть последовательность (ы) изображения в ImageJ.
  3. Определить соответствующий диаметр ROI при помощи функции прямоугольную ROI для оценки верхней и нижней границы пространственного распространения активности в последовательности (ы) изображения. ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее прямоугольная диаметр является подходящим выбором для диаметра ROI.
  4. Создайте новую папку на жестком диске компьютера, а также добавить последовательность (ы) изображения в каталог папок.
  5. В ImageJ, нажмите окно "плагины", затем нажмите кнопку "LC_Pro ', чтобы начать анализ.
  6. Введите значение диаметра ROI и выберите пороговое фильтр значения (либо 0,05 или 0,01).
  7. Нажмите кнопку "лечения от наркозависимости" флажок и введите значения момент времени непосредственно до и после был добавлен препарат (в секундах).
  8. Нажмите «ОК», ивойти в каталог последовательность изображения в окно File Explorer.

3. Графический выход

  1. Скачать R версию 3.0.2 с http://www.r-project.org/ .
  2. Откройте 32 разрядную версию R.
  3. Нажмите кнопку "Файл", затем "открытого сценария 'и выберите R сценарий в' traceplot.R 'для создания графических экспериментальные отчеты.
  4. Установите калибровку и gplots пакеты для определенных "пакеты ',' установить пакеты 'и выбрав appropirate пакеты.
  5. Нажмите "Файл", затем "изменить каталог 'команда, и использовать окно проводника, чтобы выбрать каталог, который соответствует выходу анализа LC_Pro.
  6. Нажмите на окне сценария, а затем команду "запустить все", чтобы запустить скрипт.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Пользовательский алгоритм, LC_Pro, была разработана и внедрена для того, чтобы выполнить автоматический анализ Са 2 + динамика на конфокальной последовательностей изображений. Как показано на рисунке 1, алгоритм использует последовательные модули обработки, что) обнаруживать и сопровождать сайты динамического Ca 2 + изменить выше статистической (р <0,01) шума, В) определить зоны интереса (ROI) автоматически при активных центров на места, и С) рассчитать средние интенсивности флуоресценции в трансформирования определить конкретные параметры события. Графическое представление алгоритма показан с использованием компьютерных генерируется гауссовых импульсов известной интенсивности и расположения (рис. 2). Сигнальные импульсы (рис. 2А и В) были преобразованы в двоичную с помощью Z-счет для стандартного нормального распределения, и лучше всего подходят эллипсы были назначены на пиксель локусов выше порога сигнала (рис. 2С). Эллипс алгоритм сортировки был использован для детерпе оптимального размещения ROI (рис. 2D). ROI средняя интенсивность в зависимости от времени Затем измеряли и параметры сигнала с амплитудой, продолжительности и пространственного распространения были вычислены (рис. 2E). Этот подход анализ был применен для оценки сотовой Ca 2 + динамику в неповрежденном сосудистого эндотелия. В частности, конфокальной микроскопии проводили в открытых свиного коронарных артерий, как описано на рисунке 3, и алгоритм был использован форума количественно различных Ca 2 + параметры. Для этих экспериментов непрерывные записи были сделаны до и после добавления эндотелиальной стимул, вещество P (SP; 100 мкМ), а анализ LC_Pro впоследствии была выполнена. Для масштабирования сигнала внутри каждого ROI, базовые были получены как линейной регрессии интенсивности ROI над экспериментальной времени курс (рис. 4). Средние значения интенсивности сигнала были рассчитаны для каждого ROI (Рисунок 4А), а значения выше среднего были ОТБР ованные к среднему и линейная регрессия была выполнена, чтобы приблизить сигнала базовой линии (рис. 4б). Наконец, значения интенсивности сырье были разделены на значение линии регрессии для преобразования значений сложить изменение по сравнению с исходным (фиг.4С). 5 показан представительный эксперимент, в том числе изображений Ca 2 + зависимой флуоресценции в эндотелии (фиг.5А), накапливаются бинарные маски общего Са 2 + обнаруженного сигнала в выборку поля (рис. 5B) и записи средней флуоресценции в каждой ROI (Рисунок 5С) до и после лечения SP. Последующий анализ параметров проводили с использованием R программного обеспечения. Полученные гистограммы показывают усиления эффекта СП на амплитуды событий, продолжительности и пространственного распространения (рис. 6).

560/51560fig1highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 1. Графики сигнал расхода процессов алгоритма (эта цифра была получена с разрешения Фрэнсис и соавт.) 24. Алгоритм был организован на три секции: обработка изображений, обработки событий, и область интереса (ROI) обработки. Последовательности изображения вводятся в цепи потока, и статистика событий генерируются как конечный результат. Обработки изображений (А) подпрограмма алгоритма преобразует входную последовательность изображения в списке самых подходят эллипсов по пороговой, используя Z-счет для стандартного нормального распределения и ImageJ анализа частиц. События (В) является сортировка подпрограмма используется для определения оптимального положения ROI путем организации мест эллипс в событиях "сайтов" по времени. После означает измерений интенсивности взяты на каждом ROI, статистические параметры для каждого события и сайте рассчитываются по переработке ROI подпрограммы (C </ STRONG>) для генерации выходного сигнала. BKGD, фон; Среднее, среднее. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Демонстрация автоматизированного сбора ROI и обнаружения сигнала с помощью гауссов импульс сгенерированного компьютером (эта цифра была адаптирована с разрешения Фрэнсис и соавт.) 24. Один генерируемые компьютером импульсный сигнал (A) был встроен в случайном фонового шума. Последовательность серой шкалы изображений фильтруют, чтобы удалить статический фон пиксельные значения (б) и преобразуется в двоичную с использованием значений пороговой интенсивности пикселов P <0,05 вычисляется по стандартной оценки (С). ImageJ анализ частиц алгоритмическиMS были затем применены к последовательности изображений, чтобы назначить наиболее подходящей для пикселя эллипсы локусов в пределах каждого кадра. Алгоритм новый был использован для групповых эллипсов в дискретных временных "событий" и определить оптимальное положение для каждого ROI на основании средней центра эллипса (D). ROI радиуса определяется пользовательским помещается в каждом положении (пунктирная окружность). Средние значения интенсивности в пределах ROI рассчитывается для каждого кадра и масштабируется с использованием линейного базового приближение. Амплитуда определяется как локальных максимумов выше P <0,05, как это определено стандартного балла за соответствующим отслеживания ROI (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Porci пе коронарной артерии рассечение протокол. Примерно 0,5 мм в диаметре х 8 мм длина ветви левой передней нисходящей коронарной артерии (1-й изображение, пунктирная окружность) рассекали от окружающего миокарда. Сегменты судов были отделаны окружающих адвентиции ткани и разрезать вдоль с маленькими ножницами (2-й изображение). Далее, открытые сосуды возлагались плоским к PDMS блока с использованием тонких проводов вольфрама (3-е изображение). Установленные сегменты сосудов были загружены Fluo-4 Ca 2 + индикаторным красителем, промывают и затем помещают в камеру формирования изображения покровного стекла дном. Изображения были собраны в 20-кратным увеличением (488 EX., 510 EM.) В 8,0 кадров в сек с использованием перевернутой конфокальной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

0/51560fig4highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 4. ROI средняя интенсивность базовых приближение. После средней интенсивности по сравнению с измерения времени (сплошные линии) для каждого ROI, значения сырье интенсивности масштабируются до F/F0 помощью следующей базовой метод приближения. Средняя напряженность сигнала (пунктирная линия) в период управления вычисляется из определенной пользователем контроля и значений интервала лечения (А). Кривая интенсивность сигнала зависит от времени затем усечен выше средней интенсивности управления в средней интенсивности управления для фильтрации активность от базовой приближении и линейная регрессия выполняется на результирующей кривой (пунктирные линии) (B). Наконец, значения сырье интенсивности масштабируются с вычисленной линейной базовой линии (С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 5. Представитель результаты от LC_Pro анализа базальной и стимулированной Ca 2 + динамику. Промежуток времени изображения последовательности входных изображений базальной интервала дискретизации (A, левая панель), за которым следует Вещество Р-стимулированной интервала дискретизации (правой панели ) приведены в оттенках серого. Замедленная съемка изображения последовательности наилучшим образом соответствует эллипсов для базальной и стимулированной интервалы (B) было оказано LC_pro. Наконец, зависящие от времени масштабные кривые интенсивности от каждого автоматически позиционируется области интереса (ROI) показаны (C).

Рисунок 6
Рисунок 6. Гистограммыраспределений параметров из типичного эксперимента (рис. 4). Гистограммы из параметров пиковой амплитуды (F/F0), длительность на ½ макс (сек), а максимальная пространственная распространение (мкм 2) и для контроля (левая колонка) и вещество Р-стимулированной (правая колонка) события из типичного эксперимента были визуализируется с помощью R графически обрабатывать вывод LC_pro. Примечательно, что вещество Р стимуляция расширил количество событий, и вызвало значительное сдвиг вправо в средней амплитуде и длительности по теста Манна-Уитни U (р <0,01).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Расшифровка сложных Са 2 + сигналов на клеточном и многоклеточного уровне потребует строгие экспериментальные и аналитические подходы. Здесь подход описан в это время решены конфокальной изображения последовательности Ca 2 + в зависимости флуоресценции подвергаются автоматизированной анализа, которая определяет и количественную статистически соответствующие Са 2 + сигналов в неповрежденных сотовых полей в конкретном случае, представленные, сегмент артерии выделяли от сердца свиньи, возлагали открыл выставить эндотелий, в который загружена Са 2 + индикатор Fluo-4 утра, подвергают конфокальной микроскопии, и оцениваться с пользовательского алгоритма LC_Pro. Этот алгоритм предназначен для 1) обнаруживать и сопровождать сайты динамического Ca 2 + изменить выше статистической (р <0,01) шума, 2) определить зоны интереса (ROI) автоматически при активных центров на места, и 3) проанализировать средние интенсивности флуоресценции в трансформирования определить конкретные параметры события. Подходпреодолевает основные ограничения исследований биологической сигнализации за счет снижения ошибку пользователя и предвзятости, что значительно снижает время не в сети анализа и предоставления полного индекс сигналов через поле различить репрезентативные профили или узоры. Выход из LC_Pro дополнительно обрабатывают с помощью сценариев R, обеспечивая полные отчеты параметров для отдельных экспериментов, в том числе высокого качества графического вывода.

Несколько шагов важны для надлежащего исполнения описанной методике. Процедура рассечение тканей (шаг 1.1.1) должны быть выполнены тщательно, чтобы избежать денудации или повреждение эндотелия слоя клеток. Кроме того, последовательности изображений должны быть в нужном формате (шаг 2.1) для автоматизированного области алгоритма процентной чтобы работать правильно. Например, если есть шкала информация, связанная с файлом, регионах, представляющих интерес будет неправильно размещен в соответствии местах пиксельных, вместо того, масштабируемых местах на единицу продукции. Кроме того, выборе подходящего повторноГион диаметра процентной имеет решающее значение для правильного выполнения автоматизированного анализа флуоресцентного деятельности в последовательности изображений. Слишком маленький значение диаметра может привести к избыточных измерений, в то время как слишком большой диаметр приведет к исключению тонких сигналов.

Потенциальные ловушки этой техники, прежде всего, связаны с чувствительностью автоматизированного анализа в XY сдвиги в записанных последовательностей изображений и сигнализировать насыщенность и / или обесцвечивание, что может привести к ложным положительным или ложных отрицательных результатов. Габаритные сугробы или сдвиги могут быть направлены непосредственно через использование регистрации стека программного обеспечения и точного обозначения интервалах, где вводятся возмущения. Серые уровни и параметры диаметр ROI также могут быть оптимизированы для данного препарата в преддверии сбора данных в целях стандартизации сырья наборов данных.

Потому что он служит в качестве стандартного подхода к любой динамической флуоресцентного сигнала, анализ описано чпрежде чем подходит для разнообразных применений тела. В сосудистой, этот способ в настоящее время используются для определения характерный физиологических и патофизиологических формы сигнала в нескольких сосудистого ложа в соответствии с базальной и стимулированной условий 25,26. Он также применяется в автоматизированной отслеживания Ca 2 + волн. В конечном счете, такая глобальная автоматизированный анализ будет решающим стержнем в расшифровке в пространственном и временном сложные био-сигналы и в создании новой ячейки и модели множества сот.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

Эта работа была частично поддержана Национальными Институтами Здоровья Гранты HL-085887, HL-092992, S10RR027535 и СС-93676.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection dish Fisher Sci #08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS) Fisher Sci #NC9644388 elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS Sigma #H3375-250G HEPES acid
Stereomicroscope Nikon Inst. #MNA42000
Forceps Fine Science Tools #11223-20
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
Tungsten wire Scientific Inst Svcs #406
Fluo-4 AM Life Tech. #F-14201
Pluronic F-127 Life Tech. #P3000MP
Metal pins Fine Science Tools #26002-10
Cover-glass bottom chamber Custom designed
Spinning disc confocal microscope Perkin Elmer RS-3
ImageJ software download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, (6410), 315-325 (1993).
  2. Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, (1), 11-21 (2000).
  3. Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12, (2-3), 217-227 (1991).
  4. Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
  5. Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. J Pharmacol Toxicol Methods. 31, (1), 1-10 (1994).
  6. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
  7. Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5, (3), (2010).
  8. Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31, (7), 2607-2614 (2011).
  9. Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49, (1), 66-77 (2011).
  10. Paredes, R. M., et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46, (3), 143-151 (2008).
  11. Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5, (2), 132-134 (2000).
  12. Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
  13. Gaspers, L. D., Thomas, A. P. Calcium signaling in liver. Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).
  14. Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113, (3-4), 295-305 (1992).
  15. Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44, (2), 135-146 (2008).
  16. Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451, (1-2), 371-375 (1988).
  17. Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127, (2), 157-166 (2003).
  18. Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63, (6), 747-760 (2009).
  19. Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34, (1), 94-108 (2007).
  20. Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90, (6), 2151-2163 (2006).
  21. Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76, (2), 606-617 (1999).
  22. Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293, (3), (2007).
  23. Abramoff, M. D., et al. Image processing with ImageJ. Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).
  24. Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303, (3), (2012).
  25. Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20, (2), 138-148 (2013).
  26. Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19, (5), 423-429 (2012).
  27. Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, (2), (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics