动态钙的自动分析
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Department of Physiology, University of South Alabama

Biology

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Summary

在这里,一种新型的基于排序的二维时间推移图像序列中分配给积极信号的地区最适合椭圆利益分析协议的区域是证明。该算法可以使研究人员综合分析生理的Ca 2 +信号以最小的用户输入和偏见。

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Francis, M., Waldrup, J., Qian, X., Taylor, M. S. Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences. J. Vis. Exp. (88), e51560, doi:10.3791/51560 (2014).

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Abstract

细胞内Ca 2 +信号通常研究了用荧光离子指 ​​示剂染料和显微镜技术。然而,Ca 2 +的成像数据的定量分析是费时并受偏压。基于感兴趣区域(ROI)的检测区域自动信号分析算法已实施了一维的线扫描测量,但没有目前的算法集成在二维图像序列优化的识别和投资回报的分析。这里的算法进行快速采集和投资回报分析图像序列进行描述。它利用椭圆拟合到噪声滤波的信号,以确定最佳的ROI的位置,并且计算的Ca 2 +信号的幅度,持续时间和空间扩散参数。该算法被实现为一个可自由查看的插件ImageJ的(NIH)的软件。连同开源的统计处理软件研发书面分析脚本,这种方法提供了一种高容量的管道,用于执行实验的输出的快速统计分析。作者认为,使用这种分析的协议会导致生理的Ca 2 +信号的更全面和公正的表征。

Introduction

离子是一种普遍存在的第二信使的信号分子和细胞内Ca 2 +的水平受到高度监管。细胞内Ca 2 +信号是复杂的,包括分离的瞬变,振荡,并传播波是1 - 4。的Ca 2 +的空间和时间的控制被认为是背后的生理信号的特殊性,因此对Ca 2 +的信号模式的分析是相当大的兴趣在多个领域的5调查。

的Ca 2 +指示剂染料如荧光4和Fura-2的通常用于测量细胞内Ca 2 +信号用荧光显微镜5-12。典型地,时间的Ca 2 +信号被评价为用户定义的区域内的平均荧光随时间变化,或感兴趣区域(ROI)的5,6,13 - 16。目前,人工ROI分析是既费时又劳力由于病程中它要求用户识别许多的ROI,并执行重复计算17 - 19。这些技术也可能会受到相当大的用户错误,包括引进人工信号模式和排除低振幅或弥漫性信号18,20。

自动ROI检测算法先前已采用多种统计方法,以确定最佳的ROI的位置实现的,但他们一般都限于线扫描或伪线扫描图像,这限制了分析,以一个单一的空间维度中时间17分析, 19 - 22。此外,许多现有的算法都不足以涵盖钙,范围从周期性的,本地化的瞬态传播的波23,24 2 +释放事件的多样性。生理的Ca 2 +信号的综合评价通常进一步由显著图像ARTIF存在复杂行动是混淆信号,在许多实验系统噪音的歧视。

此前,自动ROI检测算法解决的Ca 2 +信号瞬态检测,实现为插件NIH ImageJ的软件(卫生,马里兰州贝塞斯达的美国国家研究院),是开发和验证25,26。这种算法,称为LC_Pro,目的是确定和分析的ROI无所不包的Ca 2 +信号瞬态二维时间推移图像序列。在这里,一个实用的实验方案和算法猪冠状动脉内皮细胞的应用有代表性的示范提供,使用开源统计处理软件研发,生成可用的图形输出额外的后处理。

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Protocol

1,血管夹层和成像

  1. 从国内少年猪一样的马腾斯 27所描述的收获组织。将收获的猪右心室成聚二甲基硅氧烷(PDMS)含有HEPES缓冲生理盐水溶液(PSS)的底部夹层菜。
    1. 用立体显微镜的帮助下,解剖,取出左前从使用镊子和剪刀弹簧通过从周围的心脏组织的层去除血管区段周围组织降支冠状动脉(约8毫米长,0.5毫米直径)的片段。注意:小心不要刺破血管壁。
    2. 放置一个PDMS块(1×0.5×0.5公分)放入解剖盘,并用针将其脚的底部。削减约40微米直径的钨丝成十二个〜0.3厘米长段,形成m​​icropins,并把这些在盘子里。使用镊子,固定血管段的一端与一个micropi块Ñ​​。
    3. 小心地插入小弹簧剪刀成血管腔,并纵向切开向下容器的一侧,以完全打开。定位打开的血管段与内皮起来。
    4. 使用剩余的micropins以固定打开血管区段的边界方框,使得该容器形成一个扁平的矩形。注意:Micropin面应被弯曲到90°和插入,直到与块表面齐平。应小心,以拉伸容器制备而不过度拉伸;最终宽度应〜1.5倍的首发未拉伸宽度。
    5. 准备一个小体积的通过在HEPES混合的Fluo-4 AM(10μM)溶解在DMSO中与聚醚(0.03%)的Fluo-4AM加载溶液(〜1毫升)中缓冲的PSS(含有以mM计:134 NaCl的,​​6氯化钾,1氯化镁,10 HEPES,10葡萄糖),然后将整个块成在室温下在黑暗中约40分钟的加载溶液。
    6. 加载后,在HEPES缓冲洗块PSS 5-10分钟。
    7. 安装块到50〜100微米厚的垫片中含有HEPES缓冲PSS一个玻璃罩底部室。注:金属针可以用作间隔物​​,并确保血管区段朝下和不接触垫片。
    8. 放置在一个倒置显微镜配备的共焦成像的舞台腔,专注于内皮细胞层上。
    9. 为〜3分钟,在20倍的放大倍率,并使用共聚焦图像序列AQUISITION软件每秒〜8帧的帧速率基底相对荧光的采集时间间隔的图像序列。
    10. 后记录基础荧光〜3分钟,取代的HEPES缓冲液的PSS与P物质(PM 100)相同体积(约1毫升)溶解在HEPES缓冲的PSS,并记录为一个addtional 3分钟。

2,自动分析

  1. 呈现荧光活性钙的共聚焦采集软件为8位,G图像序列(S)rayscale'。TIF“格式的文件,没有规模的信息。
  2. 打开ImageJ的,单击文件菜单中的“打开”,然后选择在浏览器窗口中相应的图像序列中的ImageJ查看图像序列(S)。
  3. 通过使用矩形ROI工具来估计活动的图像序列(次)内的空间传播的上限和下限确定一个适当的ROI的直径。注:平均长方形的直径为直径的投资回报率一个合适的选择。
  4. 创建计算机硬盘驱动器上的一个新文件夹,并添加图像序列(S)到该文件夹​​目录。
  5. 在ImageJ的,点击“插件”窗口,然后单击“LC_Pro”开始分析。
  6. 进入投资回报直径值,然后选择过滤器的阈值(无论是0.05或0.01)。
  7. 点击“药物治疗”复选框,并立即将药物加入前,后(以秒为单位)输入时间点的值。
  8. 点击“确定”,并进入图像序列目录到文件浏览器窗口。

3,图形输出

  1. 从下载R版本3.0.2 http://www.r-project.org/
  2. 打开32位版本的河
  3. 点击“文件”,然后“打开脚本”,然后选择“traceplot.R'R脚本生成图形化的实验报告。
  4. 通过选择“套餐”安装校准,并gplots包,“安装软件包”,并选择appropirate包。
  5. 点击“文件”,然后“更改目录”命令,并使用资源管理器窗口中,选择对应于LC_Pro分析输出的目录。
  6. 单击脚本窗口,然后在“运行所有'命令来运行该脚本。

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Representative Results

自定义算法,LC_Pro,开发并为了实现来执行CA的自动分析的共聚焦图像序列2 +动态。正如如图1所示,该算法采用顺序处理模块,A)检测和动态的Ca轨道站点​​2 +更改上述统计(P <0.01),噪音,B),自动在活动现场中心定义的感兴趣区(ROI)区域, C)计算平均荧光强度的投资回报,以确定具体的事件参数。该算法的图形概述使用已知的强度和位置的计算机生成的高斯脉冲( 图2)所示。脉冲信号( 图2AB)被转换使用z分数为标准正态分布为二进制,而最合适的椭圆被分配到像素的位点以上的信号阈值( 图2C)。椭圆排序算法来determiNE最佳的投资回报率的位置( 图2D)。投资回报率平均强度随时间的变化,然后测量和幅度,持续时间和空间扩频信号参数进行了计算( 图2E)。这种分析方法被用于评估在完整的血管内皮细胞内Ca 2 +的动态。具体地,在如图3中描述的开猪冠状动脉中进行共焦成像,并且该算法采用离线量化鲜明的Ca 2 +的参数。对于这些实验,连续录音之前和之后除了内皮的刺激,P物质被做了(SP; 100分),并随后进行LC_Pro分析。对于每个ROI内缩放信号,基准,推导出作为ROI强度超过了实验时间过程的线性回归( 图4)。平均信号强度值,计算了每个感兴趣区域( 图4A),和上面的均值分别的trunc ATED到的均值和线性回归进行近似信号的基线( 图4B)。最后,原始强度值由回归直线转换值超过基线( 图4C)折叠变化值除以图5显示了一个代表性的实验,包括离子依赖的荧光血管内皮细胞( 图5A)的图像,之前和之后的SP治疗累加采样的场( 图5B)内检测到的总的Ca 2 +信号的二进制掩模,并在每个ROI( 图5C)的平均荧光的录音。使用R软件进行后续的参数分析。导致直方图显示的SP对事件的幅度,持续时间和空间扩散( 图6)的放大效应。

560/51560fig1highres.jpg“宽度=”500“/>
图1:信号流算法流程图表 (这个数字是由弗朗西斯等人的许可获得的。)24。该算法分为三个部分:图像处理,事件处理,和感兴趣区域(ROI)的处理。图像序列被输入到流动链,和事件的统计信息队列是作为最终的输出。该算法的图像处理(A) 子程序将所输入的图像序列插入的最佳拟合椭圆通过阈值的列表,通过z-得分为标准正态分布和ImageJ的粒子分析。事件处理(B)是用于通过举办椭圆的位置分成事件“地王”由时间来确定最佳的ROI位置排序子程序。平均强度测量是在每一个投资回报率后,对每个事件和站点统计参数由ROI处理子程序(C <计算/ STRONG>)来生成最终输出。 BKGD,背景; AVG,平均。 请点击这里查看这个数字的放大版本。

图2
图2演示的使用计算机生成的高斯脉冲的自动化投资回报率采集和信号检测 (这个数字是改编自弗朗西斯等人的许可。)24。一台计算机生成的脉冲信号(A)是嵌入在随机背景噪音。灰度图像序列进行过滤,除去静态背景的像素值(B)和转化用P的阈值的像素强度值至二值<0.05的标准分数(C) 计算。 ImageJ的颗粒分析算法毫秒,然后施加到图像序列的每一帧中分配的最佳拟合椭圆,以像素位点。一种新的算法来组椭圆成离散时间的“事件”,并决定基于均值椭圆中心(D)分别是投资回报率的最佳位置。用户定义的半径的一个ROI然后被放置在每一个位置(虚线圆圈)。的ROI内的平均亮度值的计算对于每个帧和使用线性基线近似缩放。通过标准分数,相应的投资回报率跟踪(E)定义峰值幅度被确定为局部最大值以上P <0.05。 请点击这里查看这个数字的放大版本。

图3
图3。Porci NE冠状动脉夹层协议。左冠状动脉前降支(第一形象,虚线圆圈)约0.5毫米直径×8毫米长的分支从周围的心肌进行解剖。血管段进行了修整外膜周围组织和纵向切割用小剪刀(第二图)。接下来,打开容器完全寄托平用细钨丝(3图像)一个PDMS块。装血管区段中填装的Fluo-4的Ca 2 +指示剂染料,洗涤,然后置于盖玻片底的成像室中。图片收集了在20X的放大倍率(488例,510 EM。)在使用倒置共聚焦显微镜每秒8.0帧。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4。投资回报率平均强度基线逼近 。以下的平均强度与时间的测量(实线)对每个感兴趣区域,原始强度值用下列基线近似值方法扩展到F/F0。平均信号强度(虚线)在管制期内从用户定义的控制和治疗间隔值(A)计算。随时间变化的信号强度曲线,然后平均对照强度与平均对照强度高于截断为从基线近似值过滤活性,以及线性回归所得的曲线(虚线)(B)上进行的。最后,原始强度值调整为计算基准线(C)。 请点击此处查看该图的放大版本。


从基础的LC_Pro分析图5。代表性的成果和刺激Ca 2 +的动态。输入图像的基础采样时间间隔(A,左图),其次是P物质刺激的采样间隔(A,右面板的序列时间推移图像)显示灰阶。的最佳拟合椭圆为基础和缩时图像序列刺激的间隔(B)是由LC_pro呈现。最后,从感兴趣区(ROI)每个自动定位区域随时间变化的缩放强度曲线如图(C)。

图6
图6。直方图代表性实验的参数分布(图4)。从峰值幅度的参数(F/F0)直方图,持续时间在半最大值(秒),和最大的空间扩散(2微米),用于既控制(左列)和P物质刺激(右栏)代表性实验的事件是使用R以图形方式处理来自LC_pro输出呈现。值得注意的是,P物质刺激扩展的事件数目,并引起了显著右移位的位数幅度和持续时间用Mann-Whitney U检验(P <0.01)。

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Discussion

在细胞和多细胞水平进行译码复杂的Ca 2 +信号,将需要严格的实验和分析方法。这里,这种方法描述了其中时间分辨共焦图象的Ca 2 +依赖的荧光的序列进行识别及量化统计学相关的Ca 2 +内完好蜂窝字段在特定情况下,信号表示的自动分析,动脉段是孤立从猪的心脏,寄托打开,露出内皮,装入的Ca 2 +指示剂fluo-4 AM,受到共聚焦成像,并使用自定义算法LC_Pro评估。该算法被设计为1)检测和动态的Ca轨道站点​​2 +改变上述统计(P <0.01)噪声,2)在活性部位的中心定义感兴趣区域(ROI),自动地,以及3)分析平均荧光强度在感兴趣区以确定特定事件参数。该方法通过减少用户错误和偏差,大大减少了离线分析的时间,并提供信号一个完整的索引跨越领域辨别代表轮廓或图案克服了生物信号研究的主要限制。从LC_Pro输出是通过R脚本进一步处理,提供完整的参数报告,个别实验,包括高品质的图形输出。

几个步骤是重要的所描述的技术的最佳效果。的组织解剖过程(步骤1.1.1)必须以避免剥蚀或内皮细胞层的损坏小心进行。此外,图像序列必须以正确的格式(步骤2.1)利息算法的自动区域才能正常工作。例如,如果存在与该文件相关联的标度信息,感兴趣的区域将被错误地根据像素位置放置,而不是缩放后的单元的位置。此外,选择一个合适的重息直径的只园是关键的图像序列中,以正确地履行所述荧光活性的自动分析。直径太小的值会导致冗余测量,而过大的直径将导致排除微妙的信号。

这种技术的潜在的缺陷主要涉及自动分析为xy中记录的图像序列的变化和对信号的饱和度和/或漂白,这可能会导致假阳性或假阴性结果的灵敏度。维漂移或变化可通过使用堆栈登记软件和间隔时间,其中扰动引入的准确名称直接处理。灰度级和ROI直径参数也可用于一个给定的制剂预先收集数据以原始数据集标准化优化。

因为它可以作为任何动态荧光信号的标准方法,分析说明ħERE的是适于应用的多种机构。在脉管系统中,这种方法被用来限定在基部下的多个血管床特性的生理和病理生理信号的模式和刺激条件25,26。它也被中的Ca 2 +波的自动跟踪应用。最终,这种全球性的自动化分析将是一个至关重要的关键破译空间和时间复杂的生物信号,在建立新的细胞和多细胞模型。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgements

这项工作是由国家机构支持部分卫生赠款HL-085887,HL-092992,S10RR027535和MOP-93676。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection dish Fisher Sci #08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS) Fisher Sci #NC9644388 elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS Sigma #H3375-250G HEPES acid
Stereomicroscope Nikon Inst. #MNA42000
Forceps Fine Science Tools #11223-20
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
Tungsten wire Scientific Inst Svcs #406
Fluo-4 AM Life Tech. #F-14201
Pluronic F-127 Life Tech. #P3000MP
Metal pins Fine Science Tools #26002-10
Cover-glass bottom chamber Custom designed
Spinning disc confocal microscope Perkin Elmer RS-3
ImageJ software download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing

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