ダイナミックカルシウムの自動分析

Biology

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Summary

ここでは2次元のタイムラプス画像シーケンス内で正の信号の領域に割り当てられたベストフィット楕円を分類に基づいて、関心の分析プロトコルの新規領域が示されている。このアルゴリズムは、包括的に、最小限のユーザ入力及びバイアスが生理のCa 2 +シグナルを分析するために研究者を可能にすることができる。

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Francis, M., Waldrup, J., Qian, X., Taylor, M. S. Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences. J. Vis. Exp. (88), e51560, doi:10.3791/51560 (2014).

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Abstract

細胞内Ca 2 +シグナルは、一般に蛍光性Ca 2 +指示薬色素および顕微鏡技術を用いて研究されている。ただし、のCa 2 +イメージングデータの定量分析は、時間がかかり、バイアスを受ける。関心領域(ROI)検出に基づく自動化された信号解析アルゴリズムは、一次元ライン走査測定のために実装されているが、二次元画像シーケンスにおけるROIの最適化された同定および解析を統合しない現在のアルゴリズムは存在しない。ここで、画像シーケンスにおけるROIの迅速な取得および分析するためのアルゴリズムが記載されている。これは、楕円が最適ROIの配置を決定するために、ノイズのフィルタリングされた信号に嵌合利用し、振幅、持続時間及び空間の広がりのCa 2 +信号パラメータを計算する。このアルゴリズムは、ImageJの(NIH)ソフトウェアの自由に利用できるプラグインとして実装されました。一緒に、オープンソースの統計処理ソフトウェアRのために書かれた解析スクリプトと、このアプローチは、実験的な出力の迅速な統計分析を行うための大容量のパイプラインを提供する。著者らは、この分析のプロトコルの使用は、生理的なCa 2 +のシグナリングのより完全で公平な特性評価につながることを示唆している。

Introduction

Ca 2 +は、分子および細胞質のCa 2 +レベルを高度に制御されているシグナルユビキタスセカンドメッセンジャーである。細胞内Ca 2 +シグナルは複雑であり、孤立トランジェント、振動、および伝搬波1は、 - 4。のCa 2 +の空間的および時間的制御は、生理学的シグナルの特異性の根底にあると考えられ、そのためのCa 2 +信号パターンの分析は、複数のフィールド5内の研究者にかなりの関心がある。さ

このようなのFluo-4およびフラ-2としてのCa 2 +インジケーター色素は、一般に、蛍光顕微鏡5-12で細胞内Ca 2 +シグナルを測定するために使用される。 16 -一般的に、時間的なCa 2 +の信号は、時間依存ユーザ定義領域内の平均蛍光の変化、または関心領域(ROI)5,6,13として評価されます。現在、手動のROI分析は、時間と労力の両方である19 -それは多くのROIを特定し、反復計算を17を実行するために、ユーザーが必要なため、緊張を引き起こす。これらの技術は、人工信号モードと低振幅またはびまん性信号18,20の除外の導入など、かなりのユーザーエラーを受ける可能性がある。

自動 ROI検出アルゴリズムは、以前に最適なROIの配置を決定するための統計的アプローチの様々な方法を用いて実現されているが、それらは一般にライン走査または時間17に単一の空間次元に分析を制限する擬似ラインスキャン画像の分析に限られていた19から22。さらに、多くの既存のアルゴリズムは、Ca、定期的、局所的な過渡からの伝搬波23,24の範囲2 +放出事象の多様性を包含するのに十分ではありません。生理的なCa 2 +の信号の総合評価は、多くの場合、さらに重要な画像ARTIFの存在によって複雑になる多くの実験系でのノイズの判別に信号を混乱させる行為。

以前は、カルシウム2への自動ROI検出アルゴリズム溶液は+トランジェント検出を知らせる、NIH ImageJソフトウェア(国立衛生研究所、ベセスダ、MD)用のプラグインとして実装され、開発され、25,26を検証した。 LC_Proと呼ばれるこのアルゴリズムは、二次元のタイムラプス画像シーケンス内のCa 2 +シグナルトランジェントを取り囲む関心領域を識別し、分析するために設計した。ここでは実際的な実験プロトコルおよびブタ冠動脈内皮におけるアルゴリズムの適用を代表するデモンストレーションが使えるグラフィカルな出力を生成するために、オープンソースの統計処理ソフトウェアRを使用して、追加の後処理で、提供されています。

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Protocol

1。血管解剖とイメージング

  1. マルテンス 27に記載されているように、国内の幼若豚から収穫組織。ポリジメチルシロキサン(PDMS)、HEPESは、生理食塩水(PSS)にバッファリングを含む底の解剖皿に採取したブタの右心室に配置します。
    1. 実体顕微鏡を用いて、周囲の心臓組織層から血管セグメントを除去することによって、鉗子とスプリングはさみを使用して周囲の組織から冠状動脈(〜8mmの長さ、直径0.5mm)を左前のセグメントを分析し、取り除く。注:血管壁に穴を開けないように注意してください。
    2. 解剖皿に、PDMSブロック(1×0.5×0.5 cm)の配置し、底にそれを固定するために、針を使用しています。 micropinsを形成し、12〜0.3センチメートル長のセグメントに約40μmの直径のタングステン線をカットし、皿にそれらを配置します。鉗子を用いて、micropi有するブロックに血管セグメントの一端を固定するN。
    3. 慎重に血管内腔に小さな春のはさみを挿入し、それを完全に開くように、容器の1面下に縦方向に切断。内皮を上にして開いた血管部分を向けます。
    4. 容器は平坦な長方形を形成するようにブロックするために開かれた血管セグメントの境界を固定するために、残りのmicropinsを使用する。注:マイクロピントップは90°に屈曲し、ブロック表面と同じ高さまで挿入する必要があります。ケアは過延伸することなく、容器の準備を伸ばすように注意する必要があります。最終的な幅が始まる未延伸幅1.5倍〜でなければなりません。
    5. 134のNaCl、6塩化カリウム:HEPES中ロニック(0.03%)でDMSOに溶解したFluo-4 AM(10μM)を混合したFluo-4 AMローディング少量の溶液(〜1ミリリットル)を調製mMのInを含むPSSが(バッファー、1塩化マグネシウム、10 HEPES、10グルコース)、暗所で室温で約40分間のローディング溶液中にブロック全体を挿入します。
    6. 充填後、HEPES緩衝内のブロックを洗う5〜10分間PSS。
    7. HEPESを含むカバーガラス下部チャンバーに50〜100ミクロンの厚さのスペーサーの上にブロックをマウントするには、PSSにバッファリングされた。 NOTE:金属ピンがスペーサとして使用され、血管セグメントが下向きとスペーサに触れていないことを確認することができる。
    8. 共焦点イメージングのために備えた倒立顕微鏡のステージ上のチャンバを配置し、内皮​​細胞層に焦点を当てています。
    9. 20X倍率共焦点画像シーケンスの初期同期ソフトウェアを使用して毎秒約8フレームのフレームレートで約3分間、基底相対蛍光のタイムラプス画像シーケンスをキャプチャする。
    10. 基底蛍光を記録〜3分後、交換しHEPESをHEPESに溶解したサブスタンスP(pMの100)の同じ体積(〜1ml)でPSS溶液を緩衝PSSを緩衝し、addtionalの3分間の記録。

2。自動化された分析

  1. 8ビット、gと共焦点入手ソフトウェアからの蛍光カルシウム活性の画像シーケンス(単数または複数)をレンダリングするなしスケール情報とrayscale '。TIF」形式のファイル。
  2. オープンImageJのは、[ファイル]メニューの「開く」をクリックし、ImageJの画像シーケンス(複数可)を表示するエクスプローラウィンドウで適切な画像シーケンスを選択します。
  3. 画像シーケンス(S)内の活動の空間的な広がりの上下の境界を推定するために、長方形のROIツールを使用して、適切なROIの直径を決定します。注:平均長方形の直径は、ROIの直径はぴったりの選択です。
  4. コンピュータのハードドライブに新しいフォルダを作成し、フォルダのディレクトリ内に画像シーケンス(複数可)を追加します。
  5. ImageJのでは、分析を開始するには、 'LC_Pro」をクリックし、「プラグイン」ウィンドウをクリックします。
  6. ROIの直径値を入力し、フィルタ閾値(0.05または0.01のいずれか)を選択します。
  7. 「薬物治療」チェックボックスをクリックし、すぐに前と後に、薬剤を添加した時間(秒単位)のポイント値を入力します。
  8. 「OK」をクリックし、ファイルエクスプローラウィンドウに画像シーケンスのディレクトリを入力します。

3。グラフィカル出力

  1. からRバージョン3.0.2をダウンロードしてくださいhttp://www.r-project.org/
  2. Rの32ビットバージョンを開く
  3. 「ファイル」は、「開いているスクリプト」をクリックして、グラフィカルな実験​​的なレポートを生成するための「traceplot.R 'のRスクリプトを選択します。
  4. 「パッケージ」を選択することで、キャリブレーション、およびgplotsパッケージをインストール、「パッケージをインストール」、およびappropirateパッケージを選択する。
  5. 'fil​​e'をクリックして、「ディレクトリ変更」コマンド、およびLC_Pro分析出力に対応するディレクトリを選択するようにエクスプローラウィンドウを使用します。
  6. スクリプトウィンドウをクリックし、「すべてを実行 'スクリプトを実行するコマンド。

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Representative Results

カスタムアルゴリズム、LC_Proは、Ca 2 +の共焦点画像シーケンスダイナミクスの自動分析を実行するために開発され、実施された。 図1に示されるように、アルゴリズムは動的のCa 2 +のA)を検出し、追跡する部位が、統計的に(p <0.01)ノイズの上方に変更逐次処理モジュールを利用し、B)が自動的に活性部位の中心に関心領域(ROI)を定義し、 C)特定のイベントパラメータを決定するためのROIにおける平均蛍光強度を算出する。アルゴリズムのグラフィカルな概要は、既知の強度及び位置のガウスパルス( 図2)を生成したコンピュータを用いて示されている。信号パルス( 図2AおよびB)は標準正規分布のためのZスコアを使用してバイナリに変換し、ベストフィットの楕円は、信号閾値を超えるピクセル座( 図2C)に割り当てた。楕円のソートアルゴリズムはdetermiに使用されたNE最適なROIの配置( 図2D)。 ROIは、時間に対する強度を測定した振幅、継続時間や空間的な広がりの信号パラメータが( 図2E)を計算した平均値。この分析アプローチは、無傷の血管内皮における細胞のCa 2 +動態を評価するために適用した。具体的には、共焦点画像は、 図3で説明したように開いたブタ冠状動脈内に行い、アルゴリズムが別個のCa 2 +のパラメータを定量化するためにオフラインで使用した。これらの実験のために、連続的な記録は、サブスタンスP(SP; 100pMの)、血管内皮刺激の添加の前と後に行った、とLC_Pro分析が続いて行われた。各ROI内の信号をスケーリングする、ベースラインは実験時間の経過とともに、ROI強度の線形回帰( 図4)のように導出された。平均信号強度値は、各ROI( 図4A)のために計算され、平均を超える値であったのは、trunc平均とated線形回帰は、信号ベースライン( 図4B)を近似するために実施した。最終的に、生の強度値は、ベースライン( 図4C)上に倍率変化する値を変換する回帰直線の値で割った。5は内皮( 図5A)におけるCa 2 +依存性蛍光の画像を含む、代表的な実験を示し 、 SPの処理の前と後のバイナリにサンプリングフィールド( 図5B)内で検出された総Ca 2 +の信号のマスク、および各ROI( 図5C)での平均蛍光の録音を蓄積する。後続のパラメータ解析は、Rソフトウェアを用いて行った。得られたヒストグラムは、イベントの振幅、持続時間、及び空間的広がり( 図6)上のSPの増幅効果を示す。

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図1。アルゴリズムのプロセスのシグナル·フロー· ​​チャートは (この図では、フランシスの許可が得られた。)24。画像処理、イベント処理、および関心領域(ROI)の処理:アルゴリズムは3つのセクションに組織された。画像シーケンスは、フロー鎖に入力され、イベント統計が最終的な出力として生成される。アルゴリズムの画像処理(A)のサブルーチンは、標準正規分布とImageJの粒子分析のためのZスコアを用いて、閾値化することによって最良適合楕円のリストに入力された画像シーケンスに変換する。イベント処理(B)は、時間によるイベント「サイト」に楕円の場所を編成することによって、最適なROIの位置を決定するために使用されるソートサブルーチンである。後の強度の測定は、各ROIで取られるわけでは、各イベントとサイトの統計パラメータは、ROI処理サブルーチン(C <によって計算される最終的な出力を生成する)> /強い。 BKGD、背景; AVG、平均。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2
コンピュータによって生成されたガウスパルスを用いて自動化されたROIの獲得および信号検出の図2。デモが (この図は、フランシスの許可を得て適応されました。)24。単一のコンピュータ生成信号パルス(A)は 、ランダムなバックグラウンドノイズに包埋した。グレースケール画像シーケンスは、静的な背景の画素値(B)を除去するためにろ過し、標準スコア(C)により算出されるP <0.05の閾値ピクセル強度値を用いてバイナリに変換した。 ImageJの粒子解析algorithミリ次いで、各フレーム内の画素の遺伝子座にベストフィット楕円を割り当てるために画像シーケンスに適用した。新規アルゴリズムは、離散時間的「イベント」にグループ楕円に使用され、平均楕円の中心(D)に基づいて、各ROIのための最適な位置を決定した。ユーザ定義の半径の投資収益率は、その後、それぞれの位置(点線の円)に配置されている。 ROI内の平均強度値は、フレームごとに計算され、直線のベースラインの近似を用いてスケーリングされる。対応するROIトレース(E)のための標準的なスコアで定義されたピーク振幅は、P <0.05上記の局所的な最大値として識別され、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図3
図3。Porci NE冠動脈解剖プロトコル。冠動脈(第一画像、点線の円)を左前の約0.5ミリメートル径×8ミリメートルの長さの枝は、周囲の心筋から解剖した。血管セグメントは、外膜周囲組織をトリミングし、小ハサミ(第2画像)を用いて長手方向に切断した。次に、開いた血管は細いタングステン線(第3画像)を使用して、PDMSブロックに平らに固定された。取り付けられた血管セグメントは、のFluo-4のCa 2 +指示薬色素を負荷し、洗浄し、次いでカバーガラス底撮像チャンバーに入れた。画像は20倍の倍率で収集した(488元。、510 EM)毎秒8.0フレームで倒立型共焦点顕微鏡を用いて。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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図4。ROIは、強度ベースライン近似を意味する 。各ROIのための時間測定値(実線)に対する平均強度に続いて、生の強度値は、以下のベースライン近似法を用いてF/F0にスケーリングされる。制御期間中の平均信号強度(破線)は、ユーザ定義された制御及び処理間隔値(A)から計算される。時間依存性の信号強度曲線は、ベースライン近似からフィルタ活性に対する平均制御強度の平均強度の上方制御切り捨てられて、線形回帰は、結果の曲線(点線)(B)上で実行される。最後に、生の強度値が計算された直線のベースライン(C)にスケーリングされます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。


図5の代表的な基礎のLC_Pro分析の結果とは、Ca 2 +動態を刺激した。サブスタンスP刺激されたサンプリング間隔(A、右のパネルに続いて、基底サンプリング間隔(A、左パネル)の入力画像シーケンスのタイムラプス画像を)グレースケールで表示されます。タイムラプス画像基底に最適楕円のシーケンスとの間隔(B)を刺激したがLC_proによってレンダリングされた。最後に、関心領域(ROI)の各々に自動的に位置する領域から時間依存スケーリングされた強度曲線は、(C)に示されている。

図6
図6。ヒストグラム代表的な実験(図4)からパラメータ分布の。代表的な実験からの制御(左列)とサブスタンスPで刺激された(右欄)のイベントの両方のピーク振幅(F/F0)のパラメータからヒストグラム、時半最大時間(秒)、最大空間的な広がり(μm2)とし、グラフィカルLC_proからの出力を処理するためにRを使用してレンダリング。注目すべきことに、サブスタンスPの刺激は、イベントの数を拡大し、マンホイットニーU検定(p <0.01)の中央値によって振幅および持続期間の有意な右シフトを引き起こした。

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Discussion

細胞および多細胞レベルでの複雑なCa 2 +の信号を復号化することは、厳密な実験·分析的アプローチが必要になります。ここで、アプローチのCa 2 +依存性蛍光の解決共焦点画像シーケンスが提示される特定の場合には、無傷の細胞のフィールド内に統計的に関連のCa 2 +シグナルを識別し、定量化する自動化された分析に供された時間に記載されている、動脈セグメントを単離した豚の心臓から、ピンは、共焦点イメージングを受けたCa 2 +指示薬のFluo-4 AM、を搭載し、内皮を露出するように開いて、カスタムアルゴリズムLC_Proで評価。このアルゴリズムは、1に設計されている)を検出および動的のCa 2 +のトラック部位は統計的に(p <0.01)ノイズの上方に変更し、2)自動的に活性部位の中心に関心領域(ROI)を定義し、3)のROIにおける平均蛍光強度を分析する特定のイベントパラメータを決定する。アプローチ大幅オフライン解析時間を短縮する、ユーザエラーとバイアスを低減し、代表的なプロファイルまたはパターンを識別するためのフィールドを横切って信号の完全な索引を提供することにより、生物学的なシグナル伝達研究の主要な制限を克服する。 LC_Proからの出力は、さらに高品質のグラフィックス出力を含め、個々の実験のための完全なパラメータのレポートを提供する、のRスクリプトを介して処理される。

いくつかのステップが記載された技術の適切な性能のために重要である。組織切開手順(ステップ1.1.1)の削剥または内皮細胞層の損傷を回避するために慎重に行わなければならない。また、画像シーケンスが正常に動作するように関心アルゴリズムの自動化された領域ごとに適切な形式(ステップ2.1)でなければなりません。ファイルに関連付けられたスケール情報がある場合、関心領域が誤っピクセル位置ではなく、スケーリングされたユニットの位置に従って配置される。また、適切な再選択する関心の直径の祇園は正しく画像シーケンス内の蛍光活動の自動化された分析を実行することが重要です。大きすぎる直径が微妙な信号の除外になり、一方、小さすぎる直径値は、冗長な測定になることがあります。

この技術の潜在的な落とし穴は、主に記録された画像シーケンスの変化をxyのために、偽陽性または偽陰性の結果をもたらし得る、飽和および/または漂白を通知するために自動化された分析の感度に関係する。次元ドリフト又はシフトは、スタック登録ソフトウェアおよび摂動が導入される間隔の正確な名称の使用を介して直接対処することができる。グレーレベルおよびROIの直径パラメータは、生のデータセットを標準化するためのデータ収集に先立って所与の製剤のために最適化されてもよい。

それは、任意の動的蛍光シグナルのための標準的なアプローチとして機能するので、分析は、時間に記載やがては、アプリケーションの多様体に適している。血管系では、この方法では、基礎の下に複数の血管床に特徴的な生理学的および病態生理学的信号のモダリティを定義するために使用されると条件25,26を刺激されている。また、Ca 2 +の波の自動追跡に適用されている。最終的に、そのようなグローバルな自動化分析は、空間的および時間的複雑な生体信号を解読および新しいセルおよび多細胞モデルを確立する上で重要な要となる。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgements

この作品は、健康補助金HL-085887、HL-092992、S10RR027535、及びMOP-93676の国立研究所によって部分的にサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection dish Fisher Sci #08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS) Fisher Sci #NC9644388 elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS Sigma #H3375-250G HEPES acid
Stereomicroscope Nikon Inst. #MNA42000
Forceps Fine Science Tools #11223-20
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
Tungsten wire Scientific Inst Svcs #406
Fluo-4 AM Life Tech. #F-14201
Pluronic F-127 Life Tech. #P3000MP
Metal pins Fine Science Tools #26002-10
Cover-glass bottom chamber Custom designed
Spinning disc confocal microscope Perkin Elmer RS-3
ImageJ software download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing

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