쥐의 망막에 Elvax 40W를 통해 서방 약물 전달 : 만성 질환의 치료를위한 시사점

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

이 논문은 Elvax 40W가 성인 쥐의 망막에 약물 전달에 대한 서방의 방법으로 사용 할 수있는 방법을 자세히 설명합니다. 준비, 로딩, 및 눈에 약물 - 수지 복합체를 제공하기위한 프로토콜을 설명한다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fiorani, L., Maccarone, R., Fernando, N., Colecchi, L., Bisti, S., Valter, K. Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions. J. Vis. Exp. (91), e51563, doi:10.3791/51563 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

망막 질환은 망막 깊은 눈에서 거짓말로 처리하기 어렵다. 약물 전달의 침습성 방법은 종종 이러한 질병을 치료하기 위해 필요하다. 망막 부종이나 신생 혈관 등의 만성 망막 질환은 일반적으로 효과적으로 상태를 치료하기 위해 여러 안구 주사를 필요로한다. 그러나, 이러한 주입과 관련된 위험은 약물 전달 반복적으로 증가한다. 따라서, 다른 전송 방법은 재 주입의 위험을 최소화하기 위하여 확립 될 필요가있다. 다른 몇몇 조사는 눈에 화학 천천히 방출 가능한 재료를 통해 연장 된 시간 동안 약물을 전달하는 방법을 개발했다. 이 조사에서는 성인 쥐의 망막에 약물 전달을위한 비히클로서 작용하는 Elvax 40W, 공중합 수지의 사용을 설명합니다. 수지는 만든 약물로로드됩니다. 약물 - 수지 복합체는 다음 천천히 TI를 통해 약물을 발표 할 예정이다 유리체로 이식나. 이 방법은 2 - 아미노-4-phosphonobutyrate (APB), 블록 망막의 광 반응을 글루탐산 유사체를 사용하여 테스트 하였다. 그것은 APB 천천히 수지에서 출시 된 것을 증명하고, 주입 후 칠일에 의해 망막 반응을 차단할 수이었다. 이것은 서방 형 약물 전달이 공중 합체 수지를 사용하여 망막의 치료에 효과적이며, 또한 테스트를 치료 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

Introduction

이들 질환은 일반적으로 장기간 치료를 필요로 당뇨병 및 고혈압과 같은 만성 질환의 치료는 주로 수명, 많은 과제를 제시한다. 이는 빈번한 투여를위한 필요성을 감소 서방 약물 전달 시스템의 개발을 요구하고있다. 이러한 느린 방출 방식의 효과는 당뇨병을 치료하는 데 필요한 인슐린 주사 횟수를 줄이기 위해, 인슐린 펌프의 개발을 통해 증명되었다. 눈의 만성 질환, 그 내부 층에 영향을 미치는 특히이 침략 절차를 통해 약물의 잦은 투여를 필요로합니다. 인간의 눈에 영향을 미치는 하나의 만성 질환은 연령 관련 황반 변성 (AMD)입니다. 이 비전을 개시하기위한 책임을 눈 뒤쪽에 위치한 신경 조직의 층인 중심 망막에 영향을 미친다. AMD는 서양 세계 1 실명의 주요 원인이다. 재 처리와 특정 과제tinal 질병은 종종 약물 전달의 침습적 방법을 필요로 눈이 깊은 층에 도달하기 위해 요구된다는 것이다. 약물은 일반적으로 유리체 강내 주사를 사용하여 유리체 챔버와 망막에 투여한다. 그러나, 각각의 주사 안내 염, 망막 박리, 백내장 및 유리체 출혈이 포함 주 사후 합병증의 위험이있다. 이 위험은 약물의 모든 재 주입을 곱합니다.

다중 주사의 필요성을 감소시키는 것은 AMD의 치료에 큰 이점이 될 것이다. 새로운 혈관의 성장이 특징입니다 AMD의 젖은 양식을 치료하기 위해, 기존의 치료 전략은 VEGF 억제제 3를 사용하여 내피 성장 인자 (VEGF)를 대상으로하는 것입니다. 현재, 이러한 반복 유리체 강내 주사를 통해 전달됩니다. 마찬가지로, 황반 부종, 당뇨 망막 병증의 일반적인 합병증의 치료에 스테로이드 반복 주사를 통해 전달됩니다

느린 방출 약물 전달 시스템의 개념은 먼저 동물 조직 (5)에 작은 분자를 전달하는 실리콘 고무의 차량을 이용하여 설명 하였다. 그 이후로, 다른 서방 방법은 눈을 테스트 한 몇 가지있는 큰 분자를 제공하기 위해 개발되었다. 이러한 생분해 성 마이크로 스피어, 폴리 락 티드 - 코 - 글리콜 라이드 (PLGA) 나노 입자 및 인지질 소포 (리포좀)와 같은 입자 캐리어, 배달 차량 6,7로 유용 할 수 있습니다. PLGA 나노 입자와 리포좀은 7 시간 동안 공막에 걸쳐 항암제를 제공하는 능력에 대한 시험 관내 환경에서 비교되었다. 두 차량은 서서히 약물을 방출 효과가 있었다. 그러나, 연구는 생체 외 환경에서 수행 하였다. Bochot 외. (2002) 8 테스트리포좀의 효과는 생체 내 망막에 분자를 제공합니다. 그들은 리포좀 성공적으로 토끼 망막에 작은 올리고 뉴클레오티드를 제공하는 것을 증명하고있다. 저자는 리포좀은 망막 질환 (8)의 치료에 유용 할 수 있다고 제안했다. 그러나 유리체에 떠있는이 소포의 성격은 가능성이 흐릿하거나 비전 구에 손상을 의미합니다.

오카베는 외. (2003)도 10은 토끼 베타 methasone을 적용하는 33 % 에틸렌 - 비닐 아세테이트로 이루어진 비 생분해 성 중합체 디스크를 사용했다. 그들은 공막 주머니에 디스크를 이식하고 최대 1 개월 10에 대한 유리체와 망막에 약물의 효과적인 방출을 보여 주었다. 그러나,이 특정 프로토콜에, 임플란트가 비교적 크고 강성이고, 큰 공막 절개 봉합 포함한 더 복잡한 외과 수술을 필요.

이전 연구는 tissu 조사전자 토끼 눈의 각막에 그들을 주입함으로써 다양한 중합체 차량에 응답하고, 알코올 세척 에틸렌 - 비닐 아세테이트 공중 합체는 염증 또는 자극을 유발하지 않았다는 것을 발견 하였다. 이러한 착물은 장시간 동물 조직에 큰 화합물의 전달을 유지하기 위해 도시 된, 일부 약물에 따라 11 백일까지 초과. 공중 합체 수지의 그러한 유형 Elvax 40W의 형태로 공업 적으로 개발되어있다 ( 'W'아미드 첨가제 중량 에틸렌 - 비닐 아세테이트 코 모노머 함량은 40 % 펠렛 취급을 개선하기 위해). 이 공중 합체 수지는 룸과 체온에서 모두 안정한 비활성 물질이다. 이 생체 조직에 독성 또는 알레르기를 일으키는 것으로 도시되지 않았다. 이 수지는 효과적으로 유방 유관 시스템 (12), 일차 청각 피질 13,14 <같은 다양한 시스템의 기능을 조사 다른 실험 모델에서 약물의 큰 다양성을 전달한/ SUP>, 그리고 개구리의 시각 시스템 15. 이 수지는 거북이 16, 17, 닭 배아 (18, 19)의 개발에 약물을 전달하기 위해 눈을 사용하고 있으며, 성인 흰 족제비는 20 망막. 랫트 중추 신경계에서는, 수지는 뇌 21-23에서 사용되었지만, 쥐 눈에서의 사용은 기록되지 않았다.

다른 방법에 비해 망막 서서히 약물을 전달하기 위해이 공중 합체 수지를 사용하는 장점은, 그것이 눈에 염증이나 자극을 일으키지 않는 안정된 화합물로되어있다. 그것은 일반적 대신 유리체에 떠있는 배달의 사이트에 남아있는 입자 항공사와는 달리, 약물 - 수지 복합체는, 주입 후 시력에 악영향을하지 않을 것이다. 그것은 단지 눈의 각막 윤부 주변 유리체 공동 내로 간단 주입 공정을 필요로하고, 주입 한 후 봉합을 필요로하지 않을 것이다. 최근 같은 여러 신규 한 전달 시스템의 출현이 있었다캡슐화 된 세포 기술 (ECT) 24,25, 26, 및 마이크로 필름 (27) 하이드로 겔. 그러나, 제조 및 약물 - 수지 복합체를 제공하기위한 현재의 연구에서 사용되는 방법은 이에 기초 연구 환경에서 사용하기에 더 유리한 것으로, 모두 수행하기 쉽고 저렴하다. 장기간 약물 치료를 제공하기 위해 이러한 복합체를 사용하는 과제는 적은 강내 주사를 갖는 치료 학적 이점을 극대화 할 약물의 최적 농도를 결정하는 것이다.

이 논문은 성숙한 래트 망막의 장기 치료 용 약물 - 수지 복합체의 사용을 설명하기위한 목적으로한다. 전달 모드의 효능은 약물로서 글루타메이트 유사체 2 - 아미노-4-phosphonobutyrate (APB)를 사용하여 시험한다. APB 블록 망막 28 글루타민산, 내인성 신경 전달 물질을 모방하여 ON 바이폴라 전지의 광 반응. APB는 수용체를 차단 Light 미사용에 대한 글루타메이트와 경쟁 할 때t 응답. APB 망막 기능을 제어 및 전위도 (ERG)과 같은 방법을 사용하여 전기 생리 학적 효과를 측정하는 생체 연구에 사용되었다. 이전 연구에서, APB 단기 (29) 및 현상 망막의 장기 치료에 모두 사용되었다; 후자는 삼십일 30 매일 안구 주사를 통해 단일 용량을 제공하고있었습니다. 이전 작업 28,29,31에 제안 APB의 같은 양 (50 μM의 농도로 멸균 식염수에 0.092 mg을) 모든 주사에 사용되었다. 우리는 눈에 약물을 전달하는 서방 형 차량과 같은 약물 - 수지 복합체를 테스트 할 APB를 선택했다. 본 연구에 제시된 방법은 16, 32 복잡한 약물 수지의 제조와 관련된 전술 한 바와 방법과 유사하다; 그러나 성인 쥐의 눈에 특히 우리는 또한 세부의 사용을. 눈에 APB-로드 수지의 수술 주입 한 후, 망막 전위 APB는 R을 폐지 여부를 설정 하였다etinal 빛 응답은, 따라서 APB 성공적으로 유리체와 망막에 출시되어 있는지 여부.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

수행 모든 실험은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 ARVO 정책에 따라이었고, L' Aquila의 동물 윤리위원회의 대학과 호주 국립 대학교 동물 실험 윤리위원회의 승인을. 성인 쥐 (P100-200)가이 연구에서 사용 하였다.

1 공중 합체 수지 펠렛을 제조

  1. 흄 후드에서 작은 유리 비커에 20 Elvax 40W 펠렛을 놓습니다.
  2. 100 % 에탄올 모든 알약을 충당하기 위해 보장과 비커를 입력합니다.
  3. 파라 필름으로 비커를 커버하고 7-10일 실온에서 100 % 에탄올에 알약을 흡수. 참고 : 이후이 단계에서 처리하거나 수지를 저장하는 금속 또는 플라스틱을 사용하지 마십시오.

2로드의 약물 용액을 제조

  1. 0.1 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 원하는 약물을 녹인다. 볼륨 40 μL에 약물 솔루션을 확인하십시오.단일 용량으로 주어질 것이다 약 3 배의 농도로 수지를로드.

3 준비하고 약물 수지 복합을로드

  1. 작은 또 다른 유리 비커에 20 세척 알약을 전송합니다. 약 45 분 동안 4 ml의 디클로로 메탄에 알약을 녹여. 펠릿 용해하는 동안 파라 필름으로 비커를 커버.
  2. 0.001 ㎎ / ㎖의 농도로 0.1 % DMSO에 용해시켜 패스트 그린 FCF의 용액을 제조 하였다.
  3. 한 피펫을 가지고, 이전에 제조 된 약물 용액을 40 μl를 작성한다. 빠른 그린 솔루션의 40 μL와 다른 펫을로드합니다.
  4. 비커에 동시에 두 가지 솔루션을 추가합니다. 믹스가 빠르게 녹색 염료가 균일 혼합물에 분산 될 때까지 교반 봉 유리를 사용.
  5. 즉시 수지를 동결 금식을 10 분 동안 드라이 아이스에 비커를 전송합니다.
  6. 용매를 증발 "증발 실"을 설정합니다. 입력황산 칼슘 자갈 3 분의 1에 더 큰 용기입니다. 자갈에 잘 만들기 조심스럽게 실에서 비커를 안정 잘 자갈, 비커의 절반까지 도달 할 정도로에 비커를 놓습니다.
  7. 파라 필름으로 더 큰 외부 컨테이너를 커버.
  8. 냉동실에 증발 챔버를 전송합니다. 2~3주 -20 ° C에서 보관하십시오.

4 외과 이식에 대한 약물 - 수지 복합 준비

  1. 냉동실에서 증발 챔버를 제거합니다. 유리 접시에 고체 약물 수지 블록을 이동시켜 얼음에 보관.
  2. 현미경이나 확대경의 도움으로, 조각보기 직경 약 0.05 mm 및 트레이나 펀칭 공구를 이용하여 블록의 길이가 0.​​1 mm를 잘라.
  3. 동결 방지 물질 (예를 들면, 알루미늄 호일)에 블록의 나머지 부분을 감싸고 필요한 때까지 -20 ° C에서 보관하십시오.

(5) 수술로 임플란트 쥐 눈에 약물 수지 복합

  • 수술을 위해 동물을 준비합니다. 케타민 (100 ㎎ / ㎏ 체중)과 자일 라진 (xylazine) (12 밀리그램 / kg 체중)의 혼합물을 복강 내 주사하여 마취. 전체 마취가 달성 될 때까지 동물을 관찰한다. NOTE : 동물 (호흡 제외)의 움직임의 손실을 가져야하며 각막과 발가락 핀치 반사의 손실.
  • 수술 테이블에 완전히 마취 동물을 전송합니다. 사용 mydriaticum (예를 들어, 아트로핀 황산염) 및 국소 마취제 (예를 들면, 테트라 카인 염산염) 수술을받은 눈 (들)에 삭제합니다. 수술하는 동안 촉촉한 각막을 유지하기 위해 인공 눈물을 적용합니다. 수술을 통해 일회용 바늘 멸균 악기를 사용합니다.
  • 동공이 완전히 팽창 된 후에 무딘 집게 곡선의 쌍을 사용하여 눈을 안정화. 25 G 바늘을 이용하여 유리체 윤부로부터 약 2mm 도달하는 전체 깊이 관통상 있도록 운영 현미경을 사용한다.
  • t의 준비 조각을 삽입천자 사이트를 관통 할 수있는 미세하고 뾰족한 집게 (예, 핀셋)의 쌍을 사용 관통상으로 그 약물 - 수지 복합체.
  • 세균 감염에 대한 예방 적으로, 염증을 방지뿐만 아니라 동물이 회복되는 동안 각막 건조를 방지하기 위해 눈에 항생제 연고를 적용합니다.
  • 전체 복구 할 때까지 동물을 관찰한다. 이 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 동물을 반환하지 않습니다. 동물이 스트레스 또는 불편의 흔적이있는 경우, 진통제는 승인 된 윤리 프로토콜에 따라 사용되어야한다.
  • 수집 및 조직의 분석을위한 일반적인 실험 절차를 따르십시오.
  • 실험의 완료시, 펜 토바 비탈 (60 ㎎ / ㎏ 체중) 2 % 리도카인 염산염 용액을 복강 내 주사로 동물을 안락사.
  • 참고 : Lignocaine 염산염 분지역의 불편을 imizes.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    풀 필드 전위도 (ERG)은 망막에 APB의 효과를 검출하기 위해 사용 하였다. ERG이 수행 된 방법에 대한 자세한 내용은 다음과 같은 연구 33, 34를 참조하십시오. 요약하면, 동물을 마취 한 후, 금 전극은 눈의 각막에 배치하고, 상기 기준 전극은 망막의 전기적 활동을 기록하도록, 눈 사이 전방 두피에 넣었다. 자극은 전자 플래시 장치를 사용하여 생성하고, 강도를 막대 당 활성화 감광성 분자의 수를 나타내는 10 6 광 이성화, 10 내지였다. 이 실험에서, ERG 녹음은 1 ~ 7 일 후 절차에서 촬영되었다. 동료가 눈이 아닌 처리 된 내부 대조군으로 사용 된 반면, 왼쪽 각 동물의 오른쪽 눈은 약물 - 수지 복합체와 함께 주입 하였다.

    도 1은 광 이성화 당로드의 증가와 함께 B-파의 진폭 변화를 보여준다(φ). 제어 눈에서, B-파의 진폭은 플래시 강도가 증가함에 따라 증가한다. 그림 1A에서 망막 응답 녹음은 주입 후 일일 부여됩니다. 눈 주입은 제어 눈 진폭 유사한 패턴을 보였다. 두 눈 사이의 진폭 차이는 열 여섯 φ (p <0.0001)에서 유의 한 차이가되었다. 이는이 초기 단계에서, 약물 - 수지 복합체가 높은 플래시 강도에 도달 할 때까지 반응 망막에 영향을주지 않는 것을 나타낸다. 1B는 이식 후 7 일째 ERG 응답의 변화를 보여주고있다. 일일 녹음에 비해 진폭이 제어 눈에 비해 B 파가 이식 된 눈 플래시 강도의 모든 수준에서 폐지된다. 이는 일일 하였다 (p <0.0001)에서 주입 된 눈에 대한 모든 진폭을 크게 다릅니다. 이는 망막 응답 implantati 후 (1 주)에 의해 폐지되었음을 보여준다눈에 약물 수지 복합체에.

    그림 1
    그림 1 약물 - 수지 복합체의 주입 후 일일 및 일주에서 B 파의 진폭. 이식 눈이 녹색으로 표시되는 반면 두 패널의 경우, 제어 눈이, 오렌지 (사각형)에 표시됩니다 ( 원). 기호는 * 두 눈 사이의 점, P <0.0001에서 의미를 나타냅니다. 모든 그룹의 경우, N = 5 (A) 눈에 약물 수지 복합체의 이식 후 B 파 일일의 진폭. 플래시 강도 (로드 광 이성화 당 φ)와 관련하여 B-파의 진폭 응답은 망막의 지표이다. 10 6 φ, 눈에 이식을 제외한 모든 플래시 강도에서 눈 사이의 B-파 진폭의 유의 한 차이가 없다낮은 진폭을 가지고있다. (B) 주입 후, B-파 일주 (7 일)의 진폭. 두 눈에서 기록 된 진폭은 모든 플래시 강도에서 유의 한 차이가 있습니다. 이식 된 망막에서 B 파의 진폭은 자극 강도에서 측정하지 않았다.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    이 논문은 망막에 약물의 서방 형 전달을위한 약물 - 수지 복합체의 사용을 보여 주었다. 우리는 비교적 저렴​​하고 소형 동물 모델에 적용하기 쉬운 방법을 제시하는 것을 목표로.

    APB의 함수 글루타메이트 유사체로서 작용하는 것을 감안할 때, 그것은 눈 망막 반응을 차단한다. 결과는 APB는 일주의 postimplantation에 의해 망막 응답의 막힘의 원인이 있음을 보여준다. 이 APB 성공적으로 유리체와 망막에 출시 된 것을 의미하고, 그 효과가 눈에 제한되었다는 약물 수지 복합체에 이식되었다. 약물의 전체 효과는 주입 (그림 1B) 후 명백한 일주되었다. 그림 1A는 주입 후 일일에, B 파의 상당한 감소가 주입 된 눈에서 열 여섯 φ 강도에서만 존재하고 있음을 보여줍니다. 이것은 단지를 초기 시점에서 그을 나타낼 수응답 콘 경로,   높은 빛의 강도에 영향을 받았다. 수지 망막 APB를 제공 할 수있는 시간을 결정하기 위해 상기 시간 포인트를 조사한다. 그것은 0-7일 범위 내의 상기 시점에서 녹화 망막 반응이 완전히 폐지 정확히 판별 주입 후 3 및 오일,, 예를 들면, 촬영되어야한다고 제안한다. 또한, 녹음 APB이 출시되는 기간을 결정하기 위해, 칠일 이상주의를 기울여야한다. APB 지속적으로 유리체에 천천히 방출되는 경우 망막 응답이 폐지 될 계속 이것은 분명 할 것이다.

    본 연구에서는, 약물 - 수지 복합체는 망막의 배송 안전한 것으로 밝혀졌다. APB 0.1 % DMSO에 용해시켰다. 같거나보다 높은 0.6 % 농도에서 DMSO는 망막 독성을 일으킬 수 있습니다. 그러나, 0.1 % DMSO가이 행 화합물의 전달을위한 비히클 안전한 것으로 밝혀졌다쥐 눈 (35),이 농도는 본 연구의 모든 실험에서 사용 하였다. 임플란트 오라 세라의 유리체에 transclerally 삽입되었다. 임플란트는 ERG 녹음이 이루어졌습니다 후 수집 된 쥐 눈의 저온부에서 오라 세라에 남아 관찰되었다. 보형물이 위치는 약물 수지 복합 시력 손상을 유발하지 않는다는 것을 보장합니다. 약물 - 수지 복합체를 포함하는이 방법은 다른 화합물 (준비 발행)에서 테스트되었습니다, 그것은 눈에 구조적 또는 기능적 손상이 주입 후 2 개월까지 관찰되지 않았다 것으로 나타났습니다. 60 동물의 총 주입하고, 90 %의 경우에 임플란트 위치는 변화가 없었다.

    필요하다면 여러 변형 기술에 이루어질 수있다. 이들 실험에서, APB의 단일 용량의 세 배 농도는 수지 (50 μM × 3 = 150 μM),이 슈에로드로딩 약물 용액을 제조하기위한 가이드 라인으로 이용 될 ULD. 그러나, 수지 중의 약물의 유효 농도는 가변적이며, 테스트 따라서 수정되어야한다. 분석은 또한 수정 될 수 행하는 시점에서는, 수지는 약물 방출에 유효 기간을 결정한다. 이들 실험에서, 약물의 안정한 유효량은 적어도 일주일 동안 약물 - 수지 복합체를 통해 전달되는 것을 도시하고, 그래서 그것은 조직의 분석은 1 주일 이상 주입 된 후에 수행하는 것이 좋다. 약물 적재 단계 동안, 빠른 그린은 혼합물이 균질 한 것을 보장하기 위해 사용되었다. 기타 생물학적 안전 칼라 염료, 그린 금식 수지 내에 약물의 균일 성을 시각화 대안으로 사용될 수있다. 이러한 방법의 한계는 빠른 그린 염료가 균일하게 혼합만을 측정한다는 것이다. 이 기술은 단지 사소한 광고와, 다른 동물 모델 및 약물을 사용하여 테스트 할 수있다방법에 정 등. 약물의 높은 양이 전달 될 필요가 있다면, 더 큰 크기의 주입이 필요할 수있다. 이러한 모델에서 성공한 경우,이 공중 합체 수지가 시간 경과에 지속적인 효과가 망막에 서서히 약물을 전달하기위한 치료 옵션으로 간주 될 수있다.

    각별히주의해야한다 프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 플라스틱 및 금속 악기 수지의 합성과 처리에서 사용되어서는 안된다. 디클로로 메탄은 플라스틱을 녹여 금속을 부식 수있는이 폴리머의 오염을 방지 할 수 있습니다. 약물 수지 블록의 적절한 건조 외과 이식을 위해 사용하기 전에 성취되어야한다. 약물과 수지를 함유하는 비이커가 완전히 용매를 증발시키기 위해 황산 칼슘에 노출되어 있는지 확인. 다르게는, 동결 건조기는 약물 - 수지를 동결 건조 할 수있다. 약물 - 수지 블록은 용매가 완전히 증발 할 때 사용하기 위해 준비하고,단단하고 푸른 빛을 띤 블록은 비커에 남아있다. 주입 블록에서 조각을 절단 할 때 조각이 매우 작은 저장하기 어려운로, 각 조각은 수술 직전에 준비를해야합니다. 트레이나 펀치 툴은 각 부분은 대략 동일한 약물의 양이 포함되도록, 동일한 크기의 조각을 절단하는 데 사용되어야한다. 25 G 바늘에 의해 찔린 상처에 조각을 삽입 할 때 마지막으로,주의 깊게 상처에 조각을 안내하는 좋은, 뾰족한 핀셋을 사용합니다. 운영 현미경 높은 전력 루페는 시각 도구로 사용되어야한다.

    만 친수성 ​​약물 및 화합물이 방법을 사용하여 테스트되었습니다. 약물이 중합체와 디클로로 메탄과 혼합시 약물 - 수지 복합체는, 바람직하지 않은 부산물 또는 침전 형성을 도시하지 않았다. 이는 권장되는 각각의 새로운 약물 농도, 효과의 반감기, 및 수지 혼합물과 모든 가능한 반응으로해야적합한 방법인지를 결정하기 위해 사용자에 의해 시험 될 수있다.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    저자는 공개와는 아무 상관이 없습니다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Elvax 40W Pellets Du Pont, DE, USA
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
    2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB) Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA A1910
    Dichloromethane Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA 34856
    Fast Green FCF Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
    Drierite, calcium sulfate Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA 238910
    Ketamine, Ilium Ketamil Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
    Xylazine, Ilium Xylazil-20 Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
    Atropine sulphate, Minims eye drops Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
    Tetracaine hydrochloride, Minims eye drops Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
    Chloramphenicol, Chlorsig ointment Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, Australia
    Pentobarbital, Lethabarb Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, Australia
    Lidocaine hydrochloride, Ilium Lignocaine-20 Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
    Uni-Core Punch Tool World Precision Instruments Inc., FL, USA
    Curved Forceps World Precision Instruments Inc., FL, USA
    Operating Microscope, Zeiss OPMI 99 Zeiss, West Germany
    25 G Insulin needle Terumo Corp., Tokyo, Japan
    Dumont tweezers World Precision Instruments Inc., FL, USA

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Access Economics, The global economic cost of visual impairment. AMD Alliance International. 26-27 (2010).
    2. Jager, R., Aiello, L., Patel, S., Cunningham, E. Risks of intravitreous injection: A comprehensive review. Retina. 24, (5), 676-698 (2004).
    3. Rosenfeld, P. J., et al. Ranibizumab for neovascular age-related macular degeneration. New England Journal of Medicine. 355, (14), 1419-1431 (2006).
    4. Cunningham, M. A., Edelman, J. L., Kaushal, S. Intravitreal steroids for macular edema: The past, the present, and the future. Survey of Ophthalmology. 53, (2), 139-149 (2008).
    5. Folkman, J., Long, D. M. The use of silicone rubber as a carrier for prolonged drug therapy. Journal of Surgical Research. 4, (3), 139-142 (1964).
    6. Herrero-Vanrell, R., Refojo, M. F. Biodegradable microspheres for vitreoretinal drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 52, (1), 5-16 (2001).
    7. Kim, E., et al. Human scleral diffusion of anticancer drugs from solution and nanoparticle formulation. Pharmaceutical Research. 26, (5), 1155-1161 (2009).
    8. Bochot, A., et al. Intravitreal delivery of oligonucleotides by sterically stabilized liposomes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, (1), 253-259 (2002).
    9. Bochot, A., Fattal, E. Liposomes for intravitreal drug delivery: A state of the art. Journal of Controlled Release. 161, (2), 628-634 (2012).
    10. Okabe, K., Kimura, H., Okabe, J., Kato, A., Kunou, N., Ogura, Y. Intraocular tissue distribution of betamethasone after intrascleral administration using a non-biodegradable sustained drug delivery device. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (6), 2702-2707 (2003).
    11. Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263, (5580), 797-800 (1976).
    12. Silberstein, G. B., Daniel, C. W. Elvax 40P implants: Sustained, local release of bioactive molecules influencing mammary ductal development. Developmental Biology. 93, (1), 272-278 (1982).
    13. Smith, A. L., et al. An investigation of the role of auditory cortex in sound localization using muscimol-releasing Elvax. European Journal of Neuroscience. 19, (11), 3059-3072 (2004).
    14. Anomal, R., De Villers-Sidani, E., Merzenich, M. M., Panizzutti, R. Manipulation of BDNF signaling modifies the experience-dependent plasticity induced by pure tone exposure during the critical period in the primary auditory cortex. PloS one. 8, (5), e64208 (2013).
    15. Tu, S., Butt, C. M., Pauly, J. R., Debski, E. A. Activity-dependent regulation of substance P expression and topographic map maintenance by a cholinergic pathway. The Journal of Neuroscience. 20, (14), 5346-5357 (2000).
    16. Sernagor, E., Grzywacz, N. M. Influence of spontaneous activity and visual experience on developing retinal receptive fields. Current Biology. 6, (11), 1503-1508 (1996).
    17. Leitch, E., Coaker, J., Young, C., Mehta, V., Sernagor, E. GABA type-A activity controls its own developmental polarity switch in the maturing retina. The Journal of Neuroscience. 25, (19), 4801-4805 (2005).
    18. Park, C. M., Hollenberg, M. J. Basic fibroblast growth factor induces retinal regeneration in vivo. Developmental Biology. 134, (1), 201-205 (1989).
    19. Whitsel, A. I., Johnson, C. B., Forehand, C. J. An in ovo chicken model to study the systemic and localized teratogenic effects of valproic acid. Teratology. 66, (4), 153-163 (2002).
    20. Prusky, G. T., Ramoa, A. S. Novel method of chronically blocking retinal activity. Journal of Neuroscience Methods. 87, (1), 105-110 (1999).
    21. Colonnese, M. T., Constantine-Paton, M. Chronic NMDA receptor blockade from birth increases the sprouting capacity of ipsilateral retinocollicular axons without disrupting their early segregation. The Journal of Neuroscience. 21, (5), 1557-1568 (2001).
    22. Oliveira-Silva, P., et al. Matrix metalloproteinase-9 is involved in the development and plasticity of retinotectal projections in rats. Neuroimmunomodulation. 14, (3-4), 144-149 (2007).
    23. Trindade, P., et al. Evidence for a role of calcineurin in the development of retinocollicular fine topography. Neuroscience Letters. 487, (1), 47-52 (2011).
    24. Kauper, K., et al. Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (12), 7484-7491 (2012).
    25. Birch, D. G., Weleber, R. G., Duncan, J. L., Jaffe, G. J., Tao, W. Randomized of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. American Journal of Ophthalmology. 156, (2), 283-292 (2013).
    26. Rauck, B. M., et al. Biocompatible reverse thermal gel sustains the release of intravitreal bevacizumab in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, (1), 469-476 (2014).
    27. Liu, Y. C., Peng, Y., Lwin, N. C., Venkatraman, S. S., Wong, T. T., Mehta, J. S. A biodegradable, sustained-released, prednisolone acetate microfilm drug delivery system effectively prolongs corneal allograft survival in the rat keratoplasty model. PloS one. 8, (8), e70419 (2013).
    28. Slaughter, M. M., Miller, R. F. 2-amino-4-phosphonobutyric acid: a new pharmacological tool for retina research. Science. 211, (4478), 182-185 (1981).
    29. Bodnarenko, S., Jeyarasasingam, G., Chalupa, L. Development and regulation of dendritic stratification in retinal ganglion cells by glutamate-mediated afferent activity. The Journal of Neuroscience. 15, (11), 7037-7045 (1995).
    30. Deplano, S., Gargini, C., Maccarone, R., Chalupa, L. M., Bisti, S. Long-term treatment of the developing retina with the metabotropic glutamate agonist APB induces long-term changes in the stratification of retinal ganglion cell dendrites. Dev Neurosci. 26, (5-6), 396-405 (2004).
    31. Horton, J., Sherk, H. Receptive field properties in the cat's lateral geniculate nucleus in the absence of on-center retinal input. The Journal of Neuroscience. 4, (2), 374-380 (1984).
    32. Smith, A. L., Cordery, P. M., Thompson, I. D. Manufacture and release characteristics of Elvax polymers containing glutamate receptor antagonists. Journal of Neuroscience Methods. 60, (1), 211-217 (1995).
    33. Gargini, C., Bisti, S., Demontis, G. C., Valter, K., Stone, J., Cervetto, L. Electroretinogram changes associated with retinal upregulation of trophic factors: observations following optic nerve section. Neuroscience. 126, (3), 775-783 (2004).
    34. Maccarone, R., Di Marco, S., Bisti, S. Saffron supplement maintains morphology and function after exposure to damaging light in mammalian retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, (3), 1254-1261 (2008).
    35. Tsai, T., Bui, B., Vingrys, A. Dimethyl sulphoxide dose-response on rat retinal function. Documenta Ophthalmologica. 119, (3), 199-207 (2009).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics