De liberación lenta Drug Delivery través Elvax 40W a la Rata Retina: Implicaciones para el tratamiento de condiciones crónicas

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Summary

Este documento detalla cómo Elvax 40W se puede utilizar como un método de liberación lenta para la administración de fármacos a la retina de rata adulta. El protocolo para la preparación, carga, y entrega el complejo fármaco-resina para el ojo se describe.

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Fiorani, L., Maccarone, R., Fernando, N., Colecchi, L., Bisti, S., Valter, K. Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions. J. Vis. Exp. (91), e51563, doi:10.3791/51563 (2014).

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Abstract

Enfermedades de la retina son difíciles de tratar como la retina se encuentra profundamente dentro del ojo. Los métodos invasivos de administración de fármacos a menudo son necesarios para el tratamiento de estas enfermedades. Enfermedades de retina crónico tales como edema retinal o la neovascularización por lo general requieren múltiples inyecciones intraoculares para tratar eficazmente la enfermedad. Sin embargo, los riesgos asociados con estas inyecciones aumentan con la entrega repetida de la droga. Por lo tanto, los métodos de entrega alternativos necesitan ser establecidos con el fin de minimizar los riesgos de reinyección. Varias otras investigaciones han desarrollado métodos para administrar fármacos a través del tiempo extendido, a través de materiales capaces de liberar sustancias químicas lentamente en el ojo. En esta investigación, se describe el uso de Elvax 40W, una resina de copolímero, para actuar como un vehículo para la administración de fármacos a la retina de rata adulta. La resina se hace y se carga con el fármaco. El complejo fármaco-resina se implanta en la cavidad vítrea, en donde será liberar el fármaco lentamente sobre timí. Este método fue probado usando 2-amino-4-fosfonobutirato (APB), un análogo de glutamato que bloquea la luz de respuesta de la retina. Se demostró que la APB se libera lentamente de la resina, y fue capaz de bloquear la respuesta de la retina por 7 días después de la implantación. Esto indica que la administración de fármacos de liberación lenta usando esta resina de copolímero es eficaz para el tratamiento de la retina, y podría ser utilizado terapéuticamente con más pruebas.

Introduction

El tratamiento de enfermedades crónicas como la diabetes y la hipertensión arterial presenta muchos desafíos, ya que estas enfermedades generalmente requieren tratamiento durante largos períodos de tiempo, a menudo de por vida. Esto ha llamado para el desarrollo de sistemas de administración de fármacos de liberación lenta, que reducen la necesidad de una dosificación frecuente. La eficacia de estos métodos de liberación lenta se ha demostrado mediante el desarrollo de bombas de insulina, para reducir el número de inyecciones de insulina necesarias para tratar la diabetes. Las enfermedades crónicas de los ojos, sobre todo los que afectan a sus capas internas, requieren la administración frecuente de medicamentos a través de procedimientos invasivos. Una enfermedad crónica que afecta tal que el ojo humano es la degeneración macular relacionada con la edad (AMD). Afecta a la retina central, que es una capa de tejido neural situado en la parte posterior del ojo responsable de iniciar la visión. AMD es la principal causa de ceguera en el mundo occidental 1. Un desafío particular con el tratamiento de reenfermedades intes- es que el medicamento es necesario para llegar a esta capa profunda en el ojo, que a menudo requiere de métodos invasivos de entrega. Los fármacos se administran habitualmente a la cámara vítrea y la retina utilizando inyecciones intravítreas. Sin embargo, con cada inyección hay un riesgo de complicaciones postinyección, incluyendo endoftalmitis, desprendimiento de retina, cataratas y hemorragia del vítreo 2. Este riesgo se multiplica con cada reinyección de la droga.

La reducción de la necesidad de múltiples inyecciones sería un beneficio importante en el tratamiento de la AMD. Para tratar la forma húmeda de AMD, donde el nuevo crecimiento de los vasos es un sello distintivo, la estrategia terapéutica establecida es apuntar a los factores de crecimiento endotelial (VEGF) que utilizan inhibidores del VEGF 3. En la actualidad, éstos se entregan a través de inyecciones intravítreas repetidas. Del mismo modo, en el tratamiento de edema macular, una complicación común de la retinopatía diabética, los corticosteroides se entregan a través de inyecciones repetidas

La noción de un sistema de administración de fármacos de liberación lenta se describió primero usando un vehículo de caucho de silicona para entregar pequeñas moléculas en los tejidos animales 5. Desde entonces, otros métodos de liberación lenta se han desarrollado para proporcionar moléculas más grandes, varios de los cuales han sido probados en el ojo. Portadores de partículas, tales como microesferas biodegradables, poli-lactida-co-glicolida (PLGA) nanopartículas y vesículas de fosfolípidos (liposomas) pueden ser útiles como vehículos de administración 6,7. Nanopartículas y liposomas de PLGA se han comparado en un entorno in vitro por su capacidad para suministrar agentes anti-cáncer a través de la esclerótica en el tiempo 7. Ambos vehículos fueron efectivos en la liberación de los fármacos lentamente. Sin embargo, el estudio sólo se llevó a cabo en un entorno in vitro. BOCHOT et al. (2002) 8 probadosla eficacia de los liposomas para entregar moléculas a la retina in vivo. Ellos han demostrado que los liposomas entregar con éxito pequeños oligonucleótidos a la retina de conejo. Los autores sugirieron que los liposomas podrían ser beneficiosos en el tratamiento de enfermedades de la retina 8. Sin embargo, la naturaleza de estas vesículas para flotar en el humor vítreo significa que es probable que difuminar o poner en peligro la visión 9.

Okabe et al. (2003) 10 no utilizan discos de polímero biodegradable compuesta por 33% de acetato de etileno-vinilo para aplicar beta-metasona en conejos. Se implantaron los discos en un bolsillo escleral y demostraron la liberación eficaz del fármaco en el humor vítreo y la retina de hasta un mes 10. Sin embargo, en este protocolo particular, el implante fue relativamente grandes y rígidos, y requiere un procedimiento quirúrgico más complejo que incluye una gran incisión escleral y la sutura.

Un estudio anterior investigó el tissue respuesta a diversos vehículos de polímero por implantarlos en la córnea de los ojos del conejo, y se encontró que los copolímeros de acetato de etileno-vinilo lavadas en alcohol no causan inflamación o irritación. Estos complejos se muestran para sostener el suministro de compuestos más grandes en los tejidos animales durante largos períodos de tiempo, algunos superior hasta 100 días dependiente de la droga 11. Uno de tales tipos de resina de copolímero se ha desarrollado industrialmente en forma de Elvax 40W (40% en peso de etileno-acetato de vinilo contenido de comonómero con un aditivo de amida de "W" para mejorar el manejo de pellets). Esta resina de copolímero es una sustancia inerte que es estable tanto a temperatura ambiente y corporal. No se ha demostrado que causa alergia o toxicidad en el tejido biológico. Esta resina efectivamente ha entregado una gran variedad de drogas en diferentes modelos experimentales que investigan las funciones de varios sistemas, como el sistema ductal mamaria 12, la corteza auditiva primaria 13,14 </ Sup>, y el sistema visual 15 rana. Esta resina también se ha utilizado en el ojo para suministrar fármacos para el desarrollo de tortuga 16,17, 18,19 embrión de pollo, y hurón adulto retinas 20. En el sistema nervioso central de la rata, la resina sólo se ha utilizado en el cerebro 21-23, pero su uso en el ojo de la rata no se ha documentado.

Las ventajas del uso de esta resina de copolímero para suministrar fármacos lentamente a la retina con respecto a otros métodos, es que es un compuesto estable que no causa inflamación o irritación en el ojo. A diferencia de los portadores de partículas, el complejo fármaco-resina no perjudicar la visión después de la implantación, ya que normalmente permanece en el sitio de la entrega en lugar de flotar en el humor vítreo. Sólo se requeriría un proceso de implantación sencilla en la cavidad vítrea cerca del limbo del ojo, y no requeriría la sutura después de la implantación. Recientemente, ha habido un surgimiento en varios nuevos sistemas de suministro, tales comola tecnología de células encapsuladas (ECT) 24,25, hidrogeles 26 y 27 microfilms. Sin embargo, el método utilizado en el estudio actual para preparar y entregar el complejo fármaco-resina es a la vez fácil de seguir y de bajo costo, siendo por tanto más ventajoso para su uso en un entorno de investigación básica. El reto de la utilización de este complejo para ofrecer tratamientos farmacológicos a largo plazo es determinar la concentración óptima de la droga que va a maximizar los beneficios terapéuticos de tener un menor número de inyecciones intravítreas.

Este trabajo tiene como objetivo demostrar el uso del complejo fármaco-resina para el tratamiento a largo plazo de la retina de rata adulta. La eficacia de este modo de entrega se prueba utilizando el análogo de glutamato 2-amino-4-fosfonobutirato (APB) que el medicamento. APB bloquea la respuesta a la luz de las células bipolares ON imitando el glutamato, un neurotransmisor endógeno en la retina 28. Cuando APB compite con glutamato por su receptor, bloquea el light respuesta. APB se ha utilizado en estudios fisiológicos para controlar la función de la retina y medir su efecto usando métodos electrofisiológicos como el electrorretinograma (ERG). En estudios anteriores, APB se ha utilizado durante tanto a corto plazo 29 y el tratamiento a largo plazo de la retina en desarrollo; En ella se registra dar una dosis única vía inyección intraocular al día durante 30 días 30. La misma cantidad de APB (0,092 mg en solución salina estéril, a una concentración de 50 mM) se utilizó para todas las inyecciones como se sugiere en el trabajo anterior 28,29,31. Elegimos APB para poner a prueba el complejo fármaco-resina como un vehículo de liberación lenta para administrar fármacos en el ojo. Los métodos descritos en este estudio son similares a los métodos descritos anteriormente que implican la preparación de la droga-resina compleja 16,32; Sin embargo, también detalle su uso específicamente en el ojo de rata adulta. Después de la implantación quirúrgica de la resina cargada-APB en el ojo, ERG se realizó para determinar si APB suprime la rrespuesta a la luz etinal, y por lo tanto si APB ha sido lanzado con éxito en el humor vítreo y la retina.

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Protocol

Todos los experimentos realizados fueron de acuerdo con la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y con la aprobación de la Universidad de Comité de Ética Animal de L'Aquila y al Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad Nacional de Australia. Las ratas adultas (P100-200) se utilizan en todo este estudio.

1. Preparar los gránulos de resina de copolímero

  1. Coloque 20 pastillas Elvax 40W en un pequeño vaso de vidrio en la vitrina de gases.
  2. Llenar el vaso de precipitados con 100% de etanol asegurando para cubrir todos los gránulos.
  3. Cubrir el vaso con Parafilm, y tomar las pastillas en etanol al 100% a temperatura ambiente durante 7-10 días. NOTA: A partir de este paso adelante, no use metal o plástico para manejar o almacenar la resina.

2. Preparar la solución de fármaco para la carga

  1. Se disuelve el fármaco de elección en el 0,1% de dimetilsulfóxido (DMSO). Hacer la solución del fármaco hasta 40 l de volumen.Cargue la resina con tres veces la concentración de la droga que se daría en una sola dosis.

3. Preparar y Cargar el Complejo de resina de Drogas

  1. Transferir los 20 sedimentos lavados a otro pequeño vaso de vidrio. Disolver los pellets en 4 ml de diclorometano durante aproximadamente 45 min. Cubrir el vaso con Parafilm mientras que los pellets se están disolviendo.
  2. Preparar una solución de Fast Green FCF disolviéndolo en 0,1% de DMSO a una concentración de 0,001 mg / ml.
  3. Tome una pipeta, y elaborar 40 l de la solución de fármaco preparado con anterioridad. Cargue otra pipeta con 40 l de solución de verde rápido.
  4. Añadir las dos soluciones simultáneamente en el vaso de precipitados. Mix rápidamente utilizando una varilla agitadora de vidrio hasta que el colorante verde se distribuye uniformemente por toda la mezcla.
  5. Transferir inmediatamente el vaso de precipitados sobre hielo seco durante 10 min para congelar la resina ayunar.
  6. Establecer una "cámara de evaporación" que se evapore el disolvente. Llene unamayor recipiente hasta un tercio con guijarros de sulfato de calcio. Crear un pozo en los guijarros, y coloque cuidadosamente el vaso de precipitados en el pozo de manera que las piedras lleguen hasta la mitad del vaso, para estabilizar el vaso en la cámara.
  7. Cubra el recipiente fuera más grande con Parafilm.
  8. Traslado de la cámara de evaporación al congelador. Mantener a -20 ° C durante 2-3 semanas.

4. preparar el complejo fármaco-resina para la implantación quirúrgica

  1. Retire la cámara de evaporación del congelador. Transferir el bloque de resina sólida de fármaco a un plato de vidrio se mantienen en hielo.
  2. Con la ayuda de un microscopio o lupa, cortar un trozo de aproximadamente 0,05 mm de diámetro y 0,1 mm de longitud del bloque con una herramienta o trépano de perforación.
  3. Envolver el resto del bloque en el material a prueba de congelación (por ejemplo, papel de aluminio) y mantener a -20 ° C hasta su utilización.

5. implantar quirúrgicamente el complejo fármaco-resina en la rata de ojos

  • Preparar al animal para la cirugía. Anestesiar usando una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (100 mg / kg de peso corporal) y xilazina (12 mg / kg de peso corporal). Observar el animal hasta que se logre la anestesia completa. NOTA: El animal debe tener una pérdida de movimientos (excepto para respirar), y una pérdida de los reflejos de la córnea y de arrastre del dedo del pie.
  • Traslado al animal completamente anestesiado a la mesa de cirugía. Uso mydriaticum (por ejemplo, sulfato de atropina), y anestesia local (por ejemplo, clorhidrato de tetracaína) gotas en el ojo (s) sometidos a cirugía. Aplicar lágrimas artificiales para mantener la córnea húmeda durante la cirugía. Utilizar agujas desechables e instrumentos estériles durante toda la cirugía.
  • Estabilizar el ojo usando un par de pinzas curvas contundentes después de que el alumno esté completamente dilatado. Utilice un microscopio de operación para hacer una herida por punción de profundidad completa para llegar al vítreo, aproximadamente 2 mm desde el limbo usando una aguja de 25 G.
  • Inserte la pieza preparada de tél complejo fármaco-resina en la herida de punción usando un par de pinzas, puntiagudos fino (por ejemplo, pinzas) que son capaces de penetrar en el sitio de la punción.
  • Como profilaxis de la infección bacteriana, aplique ungüento antibiótico en el ojo, para prevenir la inflamación, así como la prevención de la sequedad de la córnea mientras el animal se está recuperando.
  • Observar al animal hasta la recuperación completa. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado la conciencia. No devolver el animal a la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente. Si el animal muestra signos de estrés o malestar, los analgésicos deben ser utilizados de acuerdo con el protocolo de ética aprobado.
  • Siga los procedimientos experimentales habituales para la recolección y el análisis de los tejidos.
  • En la realización de experimentos, la eutanasia al animal con una inyección intraperitoneal de una pentobarbital (60 mg / kg de peso corporal) solución de clorhidrato de lidocaína al 2%.
  • NOTA: Lidocaína Clorhidrato minducir al mínimo el malestar local.

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    Representative Results

    Electrorretinograma de campo completo (ERG) se utilizó para detectar el efecto de APB en la retina. Para más detalles sobre cómo se realizó el ERG, consulte los siguientes estudios 33,34. En resumen, después de anestesiar al animal, un electrodo de oro fue colocado en la córnea del ojo, y el electrodo de referencia se colocó en el cuero cabelludo anterior entre los ojos, para registrar la actividad eléctrica de la retina. Los estímulos se generaron utilizando una unidad de flash electrónico y la intensidad varió de 10 a 10 junio fotoisomerización, que representa el número de moléculas fotosensibles activadas por varilla. En estos experimentos, las grabaciones ERG fueron tomadas en 1 y 7 días después del procedimiento. El ojo derecho de cada animal se implantó con el complejo fármaco-resina, mientras que el compañero de ojo izquierdo se usó como un control interno no tratada.

    La Figura 1 muestra los cambios en la amplitud de la onda b con un aumento de la varilla por fotoisomerización(Φ). En el ojo de control, la amplitud de la onda b aumenta a medida que aumenta la intensidad del flash. En la Figura 1A, grabaciones de respuesta de la retina se dan 1 día después de la implantación. El ojo implantado mostró un patrón de amplitud similar a la vista de control. La diferencia de amplitud entre los dos ojos se convirtió significativamente diferentes a los 10 6 φ (p <0,0001). Esto indica que en esta primera etapa, el complejo de fármaco-resina no tiene un efecto sobre la respuesta de la retina hasta alcanzar intensidades de flash. Figura 1B muestra cambios en la respuesta ERG a los 7 días después de la implantación. La onda b es abolida en todos los niveles de intensidad del flash en el ojo implantado, en comparación con el ojo de control, que tiene amplitudes comparables a las grabaciones 1 día. Esto es significativamente diferente de todas las amplitudes para el ojo implantado en 1 día (p <0,0001). Esto demuestra que la respuesta de la retina ha sido abolida por (una semana) después de que los implantatien el complejo de fármaco-resina en el ojo.

    Figura 1
    Figura 1. La amplitud de la onda b en 1 día y 1 semana después de la implantación del complejo fármaco-resina. Para ambos paneles, el ojo de control se muestra en naranja (cuadrados), mientras que el ojo implantado se muestra en verde ( círculos). El símbolo * representa importancia en este punto entre los dos ojos, donde p <0,0001. Para todos los grupos, n = 5 (A) La amplitud de la onda b 1 día después de la implantación del complejo fármaco-resina en el ojo. La amplitud de la onda b en relación con la intensidad del flash (fotoisomerización por φ varilla) es un indicador de la respuesta de la retina. No hay diferencia significativa en la amplitud de la onda b entre los ojos en todas las intensidades de destello 10, excepto en 6 φ, donde el ojo implantadotiene una amplitud inferior. (B) La amplitud de la onda b 1 semana (7 días) después de la implantación. Las amplitudes registradas de ambos ojos son significativamente diferentes a todas las intensidades de flash. En la retina implantado, la amplitud de la onda b no fue medible en cualquier intensidades de estímulo.

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    Discussion

    Este trabajo demostró el uso de un complejo de fármaco-resina para el suministro de liberación lenta de fármacos a la retina. El objetivo de presentar un método que es relativamente barato y fácil de aplicar en un modelo de pequeños animales.

    Dado que la función de APB es actuar como un análogo de glutamato, bloqueará la respuesta de la retina en el ojo. Los resultados muestran que APB provocó el bloqueo de la respuesta de la retina en una semana después de la implantación. Esto indica que APB fue lanzado con éxito en el humor vítreo y la retina, y que su efecto se limita al ojo que el complejo fármaco-resina fue implantado en. El efecto total del medicamento se hizo evidente una semana después de la implantación (Figura 1B). Figura 1A muestra que en 1 día después de la implantación, una reducción significativa de la onda b se presente sólo en la intensidad 10 6 φ en el ojo implantado. Esto puede indicar que en este punto de tiempo temprano, sólo elvía de cono, que responde   a mayores intensidades de luz, se vio afectada. Para determinar la longitud de tiempo que la resina puede entregar la APB a la retina, más puntos de tiempo se deben investigar. Se propone que las grabaciones en otros puntos de tiempo dentro del lapso de 0-7 días se deben tomar, por ejemplo, a los 3 y 5 días después de la implantación, para determinar exactamente cuando la respuesta de la retina está totalmente abolida. Además, las grabaciones se deben tomar más de 7 días, para determinar cuánto tiempo la APB se libera para. Esto sería evidente a medida que continúe la respuesta de la retina que se suprima si APB está siendo continuamente libera lentamente en el vítreo.

    En este estudio, el complejo fármaco-resina se encontró que era seguro para la entrega a la retina. APB se disolvió en 0,1% de DMSO. A concentraciones iguales o superiores al 0,6%, DMSO puede causar toxicidad retiniana. Sin embargo, 0.1% de DMSO se ha encontrado que es un vehículo seguro para la entrega de compuestos a laojo de rata 35, y esta concentración se utilizó en todo todos los experimentos en este estudio. Los implantes fueron insertados transclerally en la cavidad vítrea en la ora serrata. Se observaron los implantes a permanecer en la ora serrata en cryosections del ojo de la rata, que se recogió después se hicieron las grabaciones ERG. Este posicionamiento del implante garantiza que el complejo fármaco-resina no causa deterioro de la visión. Este método implica el complejo fármaco-resina ha sido probado con otros compuestos (publicación en preparación), y se encontró que no se observó daño estructural o funcional para el ojo hasta dos meses después de la implantación. Un total de 60 animales se implanta, y en el 90% de los casos la posición del implante se mantuvo sin cambios.

    Varias modificaciones se pueden hacer a la técnica si es necesario. En estos experimentos, tres veces la concentración de una dosis única de APB se cargó en la resina (50 M x 3 = 150 M), y esto should ser utilizado como una guía para la preparación de la solución de fármaco para la carga. Sin embargo, la concentración eficaz del fármaco en la resina es variable, y debe ser probado y modificado en consecuencia. Los puntos de tiempo en que se realizan análisis también se puede modificar, para determinar cuánto tiempo la resina es eficaz para liberar el fármaco. En estos experimentos, se demostró que la dosis efectiva estable del fármaco se suministra a través del complejo fármaco-resina durante al menos una semana, por lo que se recomienda que el análisis del tejido se lleva a cabo al menos una semana después de la implantación. Durante la etapa de carga del fármaco, se utilizó Verde rápido para asegurar que la mezcla había homogeneizado. Otros tintes de color biológicamente seguras se pueden utilizar como una alternativa a Fast Green, para visualizar la uniformidad de la droga dentro de la resina. Una limitación de este método es que el colorante verde rápida es la única medida de una mezcla uniforme. Esta técnica también puede ser probado utilizando modelos animales alternativos y medicamentos, con sólo ad menorAJUSTES DEL al método. Si una mayor cantidad de la droga debe ser entregado, un implante de tamaño más grande puede ser necesaria. Si tiene éxito en estos modelos, esta resina de copolímero podría ser considerado como una opción terapéutica para la administración de fármacos lentamente a la retina para tener un efecto continuo en el tiempo.

    Hay varios pasos críticos en el protocolo donde se debe tomar un cuidado especial. Instrumentos de plástico y metal no deben ser utilizados a lo largo de la síntesis y la manipulación de la resina. Esto previene la contaminación del polímero, como diclorometano puede disolver plástico y corroer el metal. Sequedad adecuada del bloque de resina de drogas debe lograrse antes de usarla para la implantación quirúrgica. Asegúrese de que el vaso de precipitados que contiene el fármaco y resina está totalmente expuesto al sulfato de calcio con el fin de evaporar el disolvente. Alternativamente, un liofilizador puede ser utilizado para congelar secar la fármaco-resina. El bloque de resina de drogas está listo para su uso cuando el disolvente se ha evaporado por completo, ysólo un bloque azulado sólido permanece en el vaso de precipitados. Al cortar un trozo del bloque para la implantación, cada pieza debe prepararse inmediatamente antes de la cirugía como las piezas son muy pequeñas y son difíciles de almacenar. Una herramienta o trépano de perforación debe ser utilizado para cortar piezas de igual tamaño, asegurándose de que cada pieza contiene aproximadamente la misma cantidad de la droga. Por último, al introducir la pieza en la herida de punción hecha por la aguja de 25 G, utilice finas, pinzas puntiagudas para guiar cuidadosamente la pieza en la herida. Un microscopio operativo o alta lupa de potencia deben ser utilizados como una ayuda visual.

    Sólo fármacos hidrófilos y los compuestos se han probado usando este método. Los complejos de fármaco-resina no han mostrado ninguna precipitación o formación de subproducto indeseable, cuando el fármaco se mezcla con el polímero y el diclorometano. Se sugiere que con cada nuevo fármaco, la concentración, la vida media del efecto, y las posibles reacciones con la mezcla de resina debeser probados por el usuario para determinar si el método es adecuado.

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    Disclosures

    Los autores no tienen nada que la divulgación.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Elvax 40W Pellets Du Pont, DE, USA
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
    2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB) Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA A1910
    Dichloromethane Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA 34856
    Fast Green FCF Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
    Drierite, calcium sulfate Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA 238910
    Ketamine, Ilium Ketamil Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
    Xylazine, Ilium Xylazil-20 Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
    Atropine sulphate, Minims eye drops Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
    Tetracaine hydrochloride, Minims eye drops Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
    Chloramphenicol, Chlorsig ointment Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, Australia
    Pentobarbital, Lethabarb Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, Australia
    Lidocaine hydrochloride, Ilium Lignocaine-20 Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
    Uni-Core Punch Tool World Precision Instruments Inc., FL, USA
    Curved Forceps World Precision Instruments Inc., FL, USA
    Operating Microscope, Zeiss OPMI 99 Zeiss, West Germany
    25 G Insulin needle Terumo Corp., Tokyo, Japan
    Dumont tweezers World Precision Instruments Inc., FL, USA

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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