Transgene gnaver Assay til Quantifying Mand Kimcelle mutanthyppighed

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

O'Brien, J. M., Beal, M. A., Gingerich, J. D., Soper, L., Douglas, G. R., Yauk, C. L., Marchetti, F. Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency. J. Vis. Exp. (90), e51576, doi:10.3791/51576 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Sporadiske DNA mutationer i kønscellerne kan føre til reduceret reproduktiv succes, og hvis arvet kan forårsage genetisk sygdom eller øget disposition til kræft i afkommet 1-3. Betydelige beviser viser, at en stor del af de novo mutationer nedarves fra fædrene kimcellelinje 4, og at antallet af mutationer i sit afkom positivt korreleret med faderlig alder på tidspunktet for undfangelsen 5. Jo højere andel af mandlige mutationer menes at være et resultat af forskellen i alder under gametogenese mellem kønnene, jo større antallet af sædcelledannende celledelinger, sammenlignet med antallet af oogenic celledelinger i den kvindelige kimcellelinje 2 og en gradvis nedgang i DNA reparere effektivitet med alderen hos mænd. Alle disse faktorer bidrager til en øget sandsynlighed for replikation fejl i den mandlige germlinie 6. Men for at virkningen af ​​faderlig eksponering Environmental faktorer på hyppigheden af de novo mutationer er fortsat usikker. Ikke desto mindre er kendt et stort antal miljøskadelige stoffer at fremkalde kønscellemutationer hos gnavere 7, og der er stigende tegn på, at nogle af disse midler også kan påvirke den menneskelige kimcellelinje 8. På trods af disse bekymringer, kemikalier rutinemæssigt testet for deres evne til at fremkalde mutationer i somatiske celler til reguleringsmæssige formål, og det er almindeligt antaget, at somatiske kontrol er tilstrækkelig til at beskytte kimcellelinjen. Derfor er kemikalier kun sjældent bedømmes for deres evne til at inducere kønscellemutationer.

En af grundene kimcellemutagenicitet test har været stort set udeladt fra den lovgivningsmæssige beslutningsproces er en mangel på praktiske metoder. Traditionelle gnaver-baserede metoder, såsom de dominerende letale 9 og specifikke locus 10 test, vurderer kønsceller mutationsrater ved at score mutant fænotyper i embryoner eller afkomudsatte forældre. Disse analyser kræver brug af et meget stort antal dyr, tid og ressourcer til at erhverve statistisk meningsfulde resultater.

Selv om flere moderne metoder til kvantificering kønsceller mutation nylig er dukket op, mange lider mangler med hensyn til deres funktionalitet, effektivitet og biologiske relevans. For eksempel, gentag længde mutationer ved udvidet enkel tandemgentagelse (ESTR) loci kan kvantificeres på mandlige kimceller hjælp af et enkelt molekyle PCR tilgang 15. Dog kan udførelse af denne metode være teknisk udfordrende og besværlig, og i modsætning punktmutationer, den biologiske og sundhedsmæssige betydning af ændringer i gentagelse længden af den meget ustabile ESTR loci fortsat uklare 16. Moderne hele genom sekventering teknologier kan give et væld af biologisk meningsfuld data, når den anvendes på problemet med arvelige mutationer 4,17, men de høje omkostninger, høje fejlprocenter, der er forbundet validering påkrævetat bekræfte mutationer, og bioinformatik udfordringer stadig begrænse rutinemæssig anvendelse af denne mulighed i et lovmæssige forsøg kapacitet 18.

Heri beskriver vi en praktisk metode til at kvantificere inducerede mutationer direkte i kimceller transgene hanmus. Denne protokol er beskrevet for det transgene MutaMouse model, som har flere sammenkædede kopier af et rekombinant Agt10 fag-vektor, der indeholder en Escherichia coli-lacZ-reportergenet integreres i begge kopier af kromosom 3 19 (figur 1).

Denne protokol er også relevant for andre transgene gnavere (TGR) modeller baseret på de samme principper (BigBlue mus og rotte, eller lacZ plasmid mus mv.) Eller lidt forskellige reportergener (GPT delta mus og rotter, TGR modeller revideret i Lambert et al. 20). Denne metode er baseret på TGR mutationsanalyse beskrevet i en nylig udgivetog reviderede OECD test guideline 21 og vi uddybe de særlige overvejelser, der er nødvendige for at imødekomme vurdering af mutationer i den mandlige kimcellelinje på grund af de unikke egenskaber spermatogenesen. Kort fortalt analysen indebærer udsætte transgene hanmus til et mutagent stof, efterfulgt af en prøveudtagning tid, hvor præ-mutationelle læsioner er fastsat til stabile mutationer. På det valgte prøveudtagningstidspunkt musene aflivet og kimceller opsamles fra enten cauda epididymis eller sædkanalerne. Som diskuteret nedenfor kan mutagene effekter på forskellige faser af spermatogenesen bestemmes ved at vælge den tid mellem eksponering og prøvetagning. Transgene skær, som omfatter multiple kopier af λ faggenomet per celle, er isoleret fra kimcelle genomisk DNA og pakket ind i tomme λ fag capsider skaber infektiøse λ fagpartikler, der derefter bruges til at inficere en E. coli-vært. De inficerede bakterier dyrkes på selective medier, der kan skelne celler, der indeholder en vektor med en muteret kopi af lacZ fra celler, der huser vildtype lacZ. Den mutagene effekt af eksponering på den mandlige germline bestemmes ved at sammenligne hyppigheden af mutant transgener mellem kontrol og behandlede mus (figur 2, revideret i Lambert 20 et al.). Et stort antal af kimceller kan analyseres fra en enkelt mus, giver dette assay overlegen følsomhed i forhold til traditionelle metoder, samtidig med at antallet af forsøgsdyr. Og fordi ingen specialiseret udstyr eller uddannelse er nødvendig, denne analyse giver en praktisk og effektiv løsning for kønsceller mutation test i de fleste moderne toksikologiske / molekylærbiologiske laboratorier.

En væsentlig forudsætning for en effektiv anvendelse af TGR kimcellens mutation assay er en forståelse af den spermatogene cyklus (Figur 3). Tiden for mus kønsceller til fremskridt fra stEM celler i sædkanalerne til spermatogonier, spermatocytter, spermatider og til sidst til modne sædceller i epididymis (dvs.. spermatogenesen) er cirka 49 dage. Mutation kan forekomme på forskellige faser af denne cyklus, og er ofte sammensat specifik. To vigtige funktioner, der er af særlig relevans for mutagenese i mandlige kønsceller ophør af DNA-syntese under tidlig meiose, og den gradvise tab af DNA-reparation kapacitet 6 i slutningen af post-meiose, to processer, der er nødvendige for induktion og fiksering af de fleste mutationer.

På grund af disse unikke egenskaber spermatogenesen, er der tre kritiske eksperimentelle variabler for afviklingen af ​​TGR kimcellens mutationsanalyse: (1) testforbindelsen administration tid; (2) prøveudtagning tid; og (3) udvælgelse af kimcellens befolkningen til at samle ind til analyse (figur 3 og tabel 1). Administration tid er experimental variabel, der bestemmer, hvor lang målceller eksponeres for prøveforbindelserne. Længden af ​​tid til administration kan også anvendes til at målrette eksponeringer til specifikke celletyper eller faser af spermatogenesen. For eksempel kunne en enkelt dag indgivelse anvendes til at bestemme virkningerne af en akut eksponering på en bestemt celletype. Ligeledes kan eksponeringen være fokuseret til en hel spermatogene fase, for eksempel ved at målrette kun meiotisk delende spermatocytter eller mitotisk dividere spermatogonier hjælp en 2 ugers administration tid og en passende tid prøveudtagning. Kroniske og sub-kronisk administration tider anvendes til at vurdere virkningerne af eksponering lang sigt at sikre tilstrækkelig farmakokinetiske fordeling af testforbindelsen, eller tillade tilstrækkelig ophobning af mutationer fra svage mutagener (for eksempel 28 dages administration tid anbefalet i OECD test retningslinje).

Sampling tid er den kritiske variabel til bestemmelse af, hvorfase af spermatogenesen målcellerne var på tidspunktet for eksponering. Den tid prøveudtagning dikterer, hvor meget tid, og derfor hvor meget yderligere langs spermatogene cyklus, celler passere efter eksponering. For eksempel for at undersøge effekter i stamcelle spermatogonier udtages en prøve> 49 dage er påkrævet, hvis indsamling fuldt modnet sæd, eller> 42 dage, hvis indsamling af umodne kønsceller fra sædkanalerne at sikre, at alle indsamlede celler har haft tid nok til at udvikle sig fra udsatte stamceller. Det er vigtigt at bemærke, at en sampling tid på mindst 70 dage ville være at foretrække at vise en sand stamcelle effekt at give tilstrækkelig tid til farmakokinetisk fordeling af giftstoffet, til eliminering af celler eksponeret på senere faser af spermatogenesen, og at redegøre for en periode med midlertidig sterilitet, der kan opstå ~ 6 uger efter udsættelse for stærkt mutagene forbindelser 22. Tilsvarende vil en sampling tid på 21 dage, at sæd colleCTED fra cauda epididymis ville har netop afsluttet meiose på den sidste dag af eksponering.

Kønsceller kan opsamles som modne sædceller fra cauda epididymis, eller som en blanding af forskellige spermatogene celletyper fra sædkanalerne. Modne sædceller forbliver i cauda til ~ 3 dage, hvilket gør det muligt at bestemme med relativ nøjagtighed celletype eller fase af spermatogenesen hvorfra sæd stammer for enhver given eksperimentelle design. Således analyse af cauda sædceller tillader meget målrettede undersøgelser af trinspecifik mutationelle effekter. På den anden side, cellesuspensioner indsamlet fra sædkanalerne indeholde en blanding af forskellige kim celletyper i forskellige faser, og dermed tilbyde dårligere opløsning af spermatogene fase, hvor mutationer oprindelse. Desuden cellesuspensioner inddrives fra sædkanalerne tendens til at indeholde en overrepræsentation af spermatider, efterfulgt af spermatocytter, og verå få spermatogonier og stamceller (disse andele er repræsenteret ved gradueret hvide søjler i figur 3). Desuden kan suspensioner fremstillet ud fra de sædkanalerne også indeholde forskellige somatiske celler. Således, fordi så mange celletyper er til stede, mutationelle effekter kan være påvirket af en række ikke-målceller. Men indsamling af prøver fra sædkanalerne tilbyder en økonomisk mulighed for samtidig screening af flere kim celletyper, og nem integration af kønsceller analyse i standard OECD test-protokol til somatisk mutation.

For at gentage, afhængigt af behovene i investigator, administration tid, prøveudtagning tid og det opsamlede cellepopulation kan justeres for at afhøre virkningerne af eksponering i forskellige celletyper og i forskellige faser af spermatogenesen. Ved omhyggeligt at udvælge disse variabler, kan man udvikle til målrettede mekanistiske undersøgelser, eller for mere generel regulering testing formål.

For at opnå færdighed i analysen, anbefaler vi brug af en akut oral administration af 100 mg / kg N-ethyl-N-nitrosourinstof (ENU), efterfulgt af en 70 prøveudtagningsdagen tid som positiv kontrol. Analyse af cauda sædceller således målrettet spermatogonstamceller stamceller (figur 3), som typisk udviser en 4-5 fold stigning i mutanthyppigheden (MF) i forhold til kontroller efter denne stærkt mutagene dosis ENU. Det skal bemærkes, at denne dosis er kendt for at inducere sterilitet 6 uger efter behandling, og dermed kan det ikke være en egnet dosis for kortere måletider kontrol. Denne dosis vil også producere en påviselig forøgelse i MF i de fleste somatiske væv 20. De repræsentative resultater, der præsenteres nedenfor, blev genereret efter en akut 70 eksponering regime med tre doser af ENU op til og inklusive 100 mg / kg.

Protocol

Alle protokoller, der vedrører dyrehold, vedligeholdelse og håndtering er blevet godkendt af Health Canadas dyrs pleje udvalg.

1. Animalske Engagementer

  1. Tilfældigt distribuere transgene hanmus (8-12 uger gamle) til at styre grupper og behandlingsgrupper (min = 5 pr gruppe) .Treat mus med testforbindelse og relevant kontrol med en passende eksponeringsvej for den valgte tid til administration. Vælg det rette tidspunkt prøveudtagningen i henhold til den spermatogene celletype af interesse (Figur 3).
  2. Efter prøvetagning tid, aflive mus ved cervikal dislokation under isofluoran anæstesi (eller anden egnet metode). Trække forsigtigt testiklerne fra et snit i maven eller pungen og punktafgifter cauda epididymides. (Figur 4, for at se en detaljeret video af bitestiklen samling se Duselis et al. 24). Alternativt kan indsamle testiklerne hvis analysere sædkanalerneS-celler. Frys i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C til senere brug.

2. Isolering og fordøjelse af cauda Sperm

  1. Afrim cauda epididymis på is. Overførsel optøet cauda til en petriskål og grundigt hakkekød med en skalpel eller barberblad.
  2. Tilføj 700 ul stuetemperatur D-PBS til petriskål. Ved hjælp af en bred boring 1.000 ul pipettespids, frigivelse sæd fra cauda ved at trække og slippe suspensionen, indtil den D-PBS bliver uklar med sæd (ca. 10 gange). BEMÆRK: For at forberede stor indvendig diameter pipettespids skåret 2-3 mm fra enden af ​​en plastik pipette spids.
  3. Filter suspensionen gennem en rustfri stål mesh-filter i et frisk 1,5 ml rør. Vask petriskålen med yderligere 700 pi D-PBS og overføre til samme 1,5 ml rør gennem mesh-filter. Fjern maske, lægge røret på is.
  4. Gentag trin 2.1-2.3 for de resterende prøver.
  5. Spin samplesat 11.000 xg i 3 min. Forsigtigt dekanteres supernatanten. Undgå at forstyrre bundfaldet.
  6. Tilsæt 1,0 ml kold 1x saltvand natriumcitrat (SSC). Vortex indtil pellet fuldstændig re-suspenderet. Det vil undertiden tage flere runder af vortexbehandling.
  7. Tilføj 15 pi 10% SDS. Inverter / rystes kraftigt i 30 sekunder til at forstyrre ikke-sædceller. Rystelser for blidt vil resultere i utilstrækkelig forstyrrelser og pillen vil ikke dannes korrekt i de følgende trin.
  8. Spin på 11.000 xg i 2 min. En løs, "fluffy" pille er tegn på ufuldstændig forstyrrelse af somatiske celler på grund af utilstrækkelig ryster i trin 2.7. Hvis dette sker, blot rystes prøven igen, og respin indtil en stram pellet dannet. Dekanteres forsigtigt supernatanten. Undgå at forstyrre bundfaldet. Kortvarigt spinde igen og fjerne de resterende supernatant med 200 ul pipette.
  9. Tilføj 940 ul 0,2 x koldt SSC og vortex indtil resuspenderes. Denne pille kan være meget svært at re-suspendere og kan tage flere runder af vortexbehandling. Sommetider klumper af sPerm er uundgåelige.
  10. Tilføj 120 pi β-mercaptoethanol, 100 pi 10% SDS, 20 pi 0,5 M EDTA, pH 8, og 20 pi proteinase K (60 mg / ml, fremstillet frisk). Bland godt og fordøje natten over med rotation ved 37 ° C. Fortsæt til phenol / chloroformekstraktion.

3. phenol / chloroform-ekstraktion af DNA fra cauda Sperm

BEMÆRK: Da det nukleare DNA i sen fase spermatider og modne sædceller er kompleksbundet med protaminer, og er stærkt kondenseret forhold til DNA'et af somatiske celler, konventionelle nukleinsyreisolationsfremgangsmåder metoder vil ikke generere DNA tilstrækkelig udbytte og renhed til mutationsanalyse at arbejde effektivt. Flere phenol-chloroformekstraktioner efter en aggressiv fordøjelse er forpligtet til at frigøre og rense sperm DNA (baseret på metoder, fra 15).

  1. Overførsel sædceller fordøje til et 15 ml polypropylenrør.
  2. Tilsæt 2 ml phenol: chloroform-blanding (1: 1). Drej røret ved 22 rpmi 3 minutter.
  3. Der centrifugeres ved 1.600 x g i 10 minutter og overføre vandige toplag sammen med fuzzy grænsefladelag til et frisk 15 ml rør.
  4. Gentag trin 3.1.2 og 3.1.3 3x, men ændre omdriftstider til 3 min, 4 min og 6 minutter hhv. På den sidste gentagelse undgå at overføre noget af "fuzzy" grænsefladelag.
  5. Efter 4. ekstraktion, tilsættes 70 pi 3M NaAc, pH 5,2 per 1 ml vandig ekstrakt og 2 ml chloroform: isoamylalkohol (24: 1). Drej røret ved 22 rpm i 12 min.
  6. Der centrifugeres ved 1.600 x g i 10 minutter og overføre vandige toplag til et frisk 15 ml rør.
  7. Udfælde DNA ved tilsætning af 2 volumener absolut ethanol og forsigtigt at dreje røret på sin side med blid vuggen.
  8. Saml DNA ved opspoling på spidsen af ​​en varmeforseglet græsarealer pipette. Skyl DNA ved hvirvlende pipettespidsen i 70% ethanol og lufttørre i 5 min.
  9. Efter ekstraktion, opløses DNA bundfaldet i 40 til 100 ul Tris-EDTA-buffer, pH 8. Opbevar ved 4 ° C. Tillad DNA opløses ved 4 ° C i mindst to dage før man går videre til lacZ mutationsanalyse. Hvis opløselighed støder på problemer, kan DNA opløses yderligere ved 65 ° C i 15 minutter før brug. Bestem koncentrationen af DNA'et med et spectrophotometre på A 260 og sikre, at koncentrationen af det opløste DNA er mellem 200-2,000 ng / ul.

4. Isolering og fordøjelse af kønsceller fra sædkanalerne

  1. Hvis produktet er frosset, optø testikel på is (ca. 1 time). Overførsel testis til jorden glasplade.
  2. Hold den ene ende af testiklerne med en pincet. I den anden ende af testiklerne, punktere et hul i epitel kapsel anvendelse af en anden tang eller et par dissektion saks (figur 5A). Klem sædkanalerne gennem punktering og kassér epiteliale kapsel (figur 5B).
  3. Endd 500 pi stuetemperatur D-PBS til decapsulated sædkanalerne.
  4. Vinkel væv valse (silikonegummi stramt over et frit roterende 5 mm i diameter rustfrit stålrør eller lignende apparater), således at den ene ende er i kontakt med pladen med en omtrentlig vinkel på 5-10 ° (figur 5C). Uden at anvende noget pres, forsigtigt flytte rullen frem og tilbage over tubuli, indtil de er flade og D-PBS bliver uklar med frigjorte celler (ca. 5-10x).
  5. Tilføj yderligere 500 pi D-PBS over tubuli og forsigtigt rulle over tubuli et par ekstra gange.
  6. Overfør cellesuspension til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og samtidig minimere mængden af fritliggende tubuli overføres (figur 5D).
  7. Gentag trin 4,5-4,6 at samle flere celler, hvis nødvendigt.
  8. Tillad 1 - 2 min for eventuelle uheld indsamlede tubuli at sedimentere til bunden af ​​røret. Overfør D-PBS til en frESH 1,5 ml rør efterlader de afviklede tubuli (ca. 100 ul af D-PBS). En lille prøve af denne suspension kan kontrolleres under et mikroskop (fasekontrast) til vurdering af sammensætningen af ​​cellepopulationen.
  9. Spin ned cellerne ved 11.000 xg i 30 sek. Dekanteres forsigtigt supernatanten uden at forstyrre bundfaldet. Cellepelleten kan fryses ved -80 ° C på dette tidspunkt, hvis nødvendigt.
  10. Optøs cellerne, hvis det kræves. Overføres til en 15 ml rør og resuspender polypropylen-celler i 5 ml lyseringsbuffer (10 mM Tris, pH 7,6, 10 mM EDTA, 100 mM NaCI, 1 mg / ml proteinase K, 1% SDS). Digest natten over i inkubator med rotation ved 37 ° C.
  11. Fortsæt til phenol / chloroformekstraktion.

5. Phenol / Chloroform Ekstraktion af DNA fra sædkanalerne kønsceller

BEMÆRK: En mindre aggressiv ekstraktion anvendes til at isolere sædkanaler kimcelle DNA, da disse celletyper endnu ikke er nået til nDe nukleare kondens.

  1. Der tilsættes 5 ml phenol: chloroform blanding (1: 1) til natten sædkanalerne celle fordøjelse. Drej røret ved 22 rpm i 20 min.
  2. Der centrifugeres ved 1.600 x g i 10 minutter og overføre vandige øverste lag, samtidig med at den "fuzzy" grænsefladelag, til et frisk 15 ml rør.
  3. Tilsæt 100 pi af 5 M NaCl per 5 ml vandigt ekstrakt (normalt 5 ml udvindes)
  4. Der tilsættes 5 ml chloroform: isoamylalkohol (24: 1). Drej røret ved 22 rpm i 12 min.
  5. Der centrifugeres ved 1.600 x g i 10 minutter og overføre vandige toplag til et frisk 15 ml rør.
  6. Udfælde DNA ved tilsætning af 2 volumener absolut ethanol og forsigtigt roterende og vende rør.
  7. Saml DNA ved opspoling på spidsen af ​​en afspærret græsarealer pipette. Skyl DNA ved hvirvlende pipettespidsen i 70% ethanol og lufttørre i 5 min.
  8. Opløs DNA i 40-100 pi Tris-EDTA-puffer, pH 8. Opbevar ved 4 ° C. Tillad DNA opløses ved 4 ° C i mindst todage før du fortsætter til lacZ mutation assay (se trin 3.9). Hvis opløselighed støder på problemer, kan DNA opløses yderligere ved 65 ° C i 15 minutter før brug. Bestem koncentrationen af DNA med en spectrophotometre på A 260 og sikre, at koncentrationen er mellem 200 og 2.000 ng / ul.

6. LacZ mutation assay

Bakteriel eller svampeangreb kan forstyrre emballage effektivitet samt plak vækst og scoring. Det er derfor afgørende at udføre lacZ assay under anvendelse af de passende aseptiske forholdsregler for at undgå kontaminering af emballagen reaktionen værtskulturen og vækstmedier.

  1. Dag før analyse: Forbered Bund agar og Overnight Kultur
    1. Otte plader (4 plader til rette mutanter, 4 plader at tælle titer) indeholdende 8 ml bunden agar hver kræves per prøve (dvs.., 64 ml per prøve). Den nederste agar er identisk for bådede mutante og titer tæller plader. Forbered tilstrækkelig bund agar til antallet af prøver, der behandles. Aseptisk hældes i 90 mm petriskåle (8 ml pr skål) og tillade agar at størkne. BEMÆRK: Bottom agarplader kan fremstilles op til 1 uge i forvejen.
    2. I et 50 ml rør tilsættes 10 ml LB-bouillon, 100 pi af 20% maltose opløsning, 25 pi ampicillin (20 mg / ml) og 20 pi kanamycin (5 mg / ml). Podes med E. coli (lacZ - / galE -) 25 og vokse natten over ved 37 ° C med rystning ved 240 rpm.
  2. Dag 1: subkultur Celler
    1. Subkultur celler ved fremstilling af en 1: 100 fortynding af natten over kultur i frisk LB (ingen antibiotika). Er behov for en volumen på 8 ml subkultur per prøve. Der inkuberes ved 37 ° C med omrystning ved 240 rpm i omkring 3,5 timer, indtil OD 600 = 1.
    2. Når OD600 = 1, dividere cellesuspension jævnt i 50 ml rør og centrifugeres ved 1300 xg ved 15 ° C i 10min. Fjern supernatanten og resuspender cellerne i halvdelen af det oprindelige volumen (dvs.., 4 ml per prøve) i LB indeholdende 10 mM MgSO4. Put celler til side, indtil behov [trin 6.2.4.3].
  3. Dag 1: Emballage DNA i Lambda fagpartikler
    1. Opvarm vandbad til 30 ° C.
    2. Ved hjælp af en bred boring 10 pi pipettespids, overførsel 4 pi DNA til et 1,5 ml rør. BEMÆRK: Dette trin kan udføres en dag eller mere i forvejen at reducere forberedelsestid.
    3. Opvarm første rør (rød) fra en fag pakningsekstrakt kit (1 rør for hver 2 prøver). Kort fortalt spinde at indsamle ekstrakt i bunden af ​​røret.
    4. Overfør 4.8 pi pakningsekstrakt fra det første rør til DNA-prøven og bland ved forsigtig omrøring med pipettespidsen. Kortvarigt spin ned prøver i rør. Der inkuberes i 1,5 timer i 30 ° C vandbad.
    5. Varm op den anden (blå) pakningsekstrakt rør (1 rør til ~ 15 prøver). Kort fortalt spinde at indsamle uddrag nederstaf røret.
    6. Overfør 4,8 pi pakningsekstrakt fra det andet rør til DNA-prøven og bland ved forsigtig omrøring. Kortvarigt spin ned prøver i rør. Der inkuberes i en yderligere 1,5 time i 30 ° C vandbad.
    7. Resuspender emballerede fagpartikler i 500 pi SM-puffer, og der blandes ved at rotere i 30 minutter ved 20 omdrejninger i minuttet.
    8. Efter rotation kortvarigt vortex prøver og centrifugeres ved 11.000 xg i 30 sek at indsamle prøver på bunden af ​​rørene. Fagpartikler er klar til infektion [trin 6.2.4].
  4. Dag 1: Forbered Top Agar
    1. Udarbejde særskilte top-agar for titeren plader og mutant selektionsplader. Hver prøve kræver 4 titer plader og 4 mutant plader. Hver plade kræver 8 ml topagar. Tilsæt selektive middel phenyl-β-D-galactopyranosid (P-Gal) til mutantselektion topagar alene. Forbered både top agarer i forvejen (assaydagen) og holdes ved 50 ° C før tilsætning af MgSO4 til både top agarer, og PGal til mutant udvælgelse agar.
  5. Dag 1: inficerer Celler med emballerede Fag og Belægning
    1. Mærk to 50 ml rør per prøve: 1 "mutant" rør per prøve og 1 "titer" rør per prøve
    2. Label 8 agarplader per prøve: 4 "mutant" plader pr prøve og 4 "titer" plader pr prøve
    3. Alikvot 2 ml resuspenderet celler [fra trin 6.2.1.2] til hvert rør.
    4. Tilsæt 500 pi pakkede fagpartikler [fra trin 6.2.2.8] til "mutant" 50 ml rør (indeholdende celler). Bland forsigtigt og tillade fagpartikler at inficere celler i 30 minutter ved stuetemperatur.
    5. Efter 30 minutter, kort vortex-inficerede celler og overføre 15 pi af inficerede celler til den passende 50 ml "titeren" rør (indeholdende celler).
    6. Til plade titer prøven, tilsættes 30 ml varm (50 ° C) "titer" top-agar (ikke indeholdende P-Gal) til "titer" 50 ml rør. Umiddelbart distribute agar / celleblandingen blandt de 4 "titer" plader (~ 8 ml per plade). Arbejde hurtigt, så den øverste agar ikke afkøles i pipetterne, og prøv ikke at indføre luftbobler.
    7. Plade "mutant" prøver næste. Sikre P-Gal tilføjes til "mutant udvælgelse" top-agar. Der tilsættes 30 ml varm "mutant udvælgelse" agar (indeholdende P-Gal) til "mutant" 50 ml rør. Umiddelbart distribuere agar / celleblandingen blandt de 4 "mutant" plader (~ 8 ml per plade).
    8. Lad pladerne at størkne (~ 15 min) og derefter vendes og inkuberes ved 37 ° C natten over.
  6. Dag 2: Tælle Plaketter
    1. Efter inkubation natten over, tælle antallet af plaque på de mutante og titer plader. For store antal plaques tæller kun en del af pladen for at beregne det samlede antal (f.eks. Ofte ¼ af titerplade vil have mellem 100-200 plaques). Et minimum af 100 plaques skal regnes pr plade når couningsrettigheder en del af pladen.
    2. Beregn antallet af plakdannende enheder (PFU) pr ul celler. Dette gøres ved at dividere antallet af plaques på "titer" plader af mængden af ​​celler udpladet (15 ul).
    3. Brug af antallet af PFU / ul at beregne det samlede antal PFU i den samlede mængde af inficerede celler udpladet på "mutant" plader (PFU / ul * [2 ml celler + 0,5 ml pakkede fagpartikler - 15 pi for titer plader] ).
    4. Vurdere MF ved at dividere det samlede antal mutant plaques tælles på 4 "mutant" plader af den skønnede samlede antal PFU'er i den samlede mængde af inficerede celler bestemt ud fra "titer" plader.
  7. Når den spontane lacZ MF er i størrelsesordenen 3 x 10 -5 i kontrolgruppen, som det for MutaMouse kimceller OECD guideline anbefaler mindst 125.000 til 300.000 ikke-mutant PFU per dyr være skærmened til mutation for at opnå en pålidelig baseline signal. Andre transgene modeller kan have lavere spontan MF, i hvilket tilfælde et større antal PFU ville være påkrævet. En statistisk styrke test kan udføres for at bestemme det mindste antal PFU'er og dyr, der kræves for at opnå den ønskede opløsning. Data fra flere gentagelser kan samles for at opfylde dette minimum PFU krav, forudsat at de ikke producerer markant forskellige mutanthyppighed.

7. Statistik

Den eksperimentelle enhed for analysen er musen. Producerede data fra denne analyse er generelt ikke normalt fordelt. Som sådan, skal du vælge den statistiske metode til analyse baseret på fordelingen karakteristisk af data.

BEMÆRK: Standard parametriske analyser (. F.eks ANOVA) kan anvendes, hvis det er relevant datatransformation påføres udligne variansen af respons over hele spektret af obsertion. Poisson eller binomial regressionsanalyserne er ofte mere passende. Parametrisk analyse kan også anvendes. Vi rutinemæssigt ansætte Poisson regression ved hjælp af den generelle lineære model procedure (dvs.., Proc GENMOD) i SAS v.9.2 (SAS Institute, Cary, NC) som beskrevet af Lemieux et al 26.

Representative Results

Med en gennemsnitlig plak optælling af 200.000 plaques pr dyr, vi typisk observere en gennemsnitlig baggrund MF på ca 2,8 x 10 -5 i mandlige kønsceller med en standardafvigelse på 1,7 x 10 -5 i vores kontrolgrupper (baseret på data fra otte uafhængige eksperimenter). Med denne plak tælle, baggrund niveau og varians, dosisgrupper med n = 5 dyr hver er tilstrækkeligt til at påvise en 2 gange stigning i MF med effekt> 0,8.

Resultaterne er typisk rapporteret i tabelform eller grafisk format. Tabel 2 og figur 6 viser repræsentative resultater fra cauda spermier MutaMouse mænd (n = 5 pr gruppe) udsat for en enkelt akut oral dosis på 0, 25, 50 og 100 mg / kg N-ethyl-N-nitrosourinstof (ENU) efterfulgt af en 70 dage prøveudtagning. Denne 70 dage periode tillader måling af mutationsbegivenheder der fandt sted i sæd, der var spermatogonstamceller stamceller på tidspunktet for eksponering (figur 3). Typiske plaque tætheder på mutante og titer plader er vist i figur 7. Som vist i tabel 2 og figur 6, akut ENU eksponering inducerede en signifikant dosis-afhængig stigning i MF spermatogonmitoser stamceller. Den lave dosis inducerede betydelig 2,6 fold stigning i forhold til kontroller, der havde en baseline MF af 2,6 x 10 -5. Maksimal induktion skete i den høje dosis, som fremkaldte en 4,4 gange stigning i forhold til kontroller.

Et eksempel på dette assay udført på sædkanalerne kimceller kan findes i Douglas et al. 27, hvor MF blev bestemt i tubulus kimceller ved forskellige tidsintervaller efter en 5 dages gentagelse intraperitoneal injektion af 50 mg / kg ENU. I denne undersøgelse, mutanthyppighed i seminiferous celler øges op til 15 dage efter behandling og forblev konstant derefter.

Exposikker regime Indsamlede væv Opsamlet celletype (målcelle) Fase af målet celle i begyndelsen af eksponering Faser passerede under eksponeringen
Akut + 70 Cauda Modne sædceller Stamceller Stamceller
14 + 21 Cauda Modne sædceller Spermatogonia Sædcelleantal
14 + 35 Cauda Modne sædceller Stamceller Spermatocyte
28 + 3 Cauda Modne sædceller Spermatocyte Spermatocyte
Sædcelleantal
Modne sædceller
Tubuli Stamceller Stamceller Stamceller
Spermatogonia Spermatogonia Spermatogonia
Spermatocyte Spermatocyte
Sædcelleantal Sædcelleantal
28 + 49 Cauda Modne sædceller Stem cel Stamceller
Tubuli Stamceller
Spermatogonia
Spermatocyte
Sædcelleantal
Stamceller Stamceller

Tabel 1. celletyper og faser af spermatogenesen, der er målrettet den transgene gnavere mutationsanalyse ved forskellige eksperimentelle design.

Dosisgruppe Animal # Mutant PFU Samlet PFU MF (x10 -5) Gennemsnitspris MF (x 10 -5) Fold forandring p-værdi
Kontrol 1 5 180245 2.8 2.6 1.0 -
2 4 137835 2.9
3 11 385672 2.9
4 2 431396 0,5
5 6 152413 3.9
25 mg / kg 6 17 162353 10.5 6.9 2.6 0,0002
7 14 150094 9.3
8 4 154401 2.6
9 9 154401 5.8
10 12 196978 6.1
50 mg / kg 11 17 155727 10.9 9.3 3.6 <0,0001
12 11 135847 8.1
13 25 193499 12.9
14 12 133.859 </ Td> 9,0
15 14 252807 5.5
100 mg / kg 16 26 170968 15.2 11.5 4.4 <0,0001
17 28 234584 11.9
18 10 145289 6.9
19 35 292236 12.0
20 22 190848 11.5

Tabel 2. lacZ mutanthyppigheden i cauda sæd transgene mandlig mis udsat akut til ENU, når de var spermatogonstamceller stamceller (administration tid = 1 dag, prøveudtagning tid = 70 dage). PFU = enhed plaquedannende, MF = mutanthyppigheden.

Figur 1
Figur 1. En skematisk repræsentation af Agt10 fag konstruktionen.

Figur 2
Figur 2. En oversigt over de transgene gnavere kimcellens mutation assay.

Figur 3
Figur 3. Et skematisk diagram af spermatogenesen hos mus og celletyper og PHA'eres, der er målrettet den transgene gnavere mutationsanalyse ved forskellige eksperimentelle designs. BEMÆRK: graduerede hvide søjler repræsenterer den relative andel af celletyper stede i cellesuspensioner fremstillet fra sædkanalerne (dvs. spermatider> spermatocytter> spermatogonia> stamceller). Venligst Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Indsamling af musen cauda epididymis. A) Lav et snit i maven til pungen. B) fastslå epididymal fedtpuden. C) Træk forsigtigt fedtpuden at trække testiklerne og bitestiklerne. D) Find og udskære cauda epididymis.


Figur 5. Forberedelse af suspension af kønsceller fra sædkanalerne. A) En incision i epitel kapsel testiklerne, udsætter sædkanalerne. B) sædkanalerne er presset ud af kapslen. C) Et væv rulle forsigtigt forbigået tubuli ved 5-10 ° vinkel frigive kønsceller indeholdt i. d) kimcellens suspension opsamles til videre forarbejdning.

Figur 6
Figur 6. Grafisk repræsentation af lacZ mutanthyppigheden i MutaMouse sædceller udsættes akut som stamceller til ENU (n = 5). Hvertrekant repræsenterer MF af et dyr. * p <0,05 som bestemt ved Poisson regression.

Figur 7
Figur 7. Repræsentative agarplader fra transgene gnavere mutationsanalyse med plaques dannet på en plæne af E. coli værtsbakterier. A) De "mutant" plader vil have meget få plaques (markeret med pile), især i den dosis kontrol grupper, som lejlighedsvis vil have nul plaque på nogle plader. B) "titer" plader kan have hundredvis af plaques.

Discussion

Sammenlignet med traditionelle metoder, TGR kimcellens mutationsanalyse giver en hurtigere, mere økonomiske og mere følsomme midler kvantificere induceret in vivo kønscellemutationer. Ved at vurdere transgen MF direkte i sperm, i modsætning til afkom, antal dyr, der er tid og ressourcer, der kræves for at vurdere mutagenicitet kønscellerne af en enkelt forbindelse, reduceres betydeligt. Med hensyn til følsomhed, var vi i stand til at påvise en signifikant 2,6 gange stigning i spermatogonier stamcelle MF efter udsættelse for 25 mg / kg ENU ved hjælp af kun 5 dyr pr. I modsætning hertil den specifikke locus-analysen var i stand til at opdage enhver betydelig ændring i MF på samme dosis ved hjælp af> 3.000 mus i den udsatte gruppe og> 500.000 kontrolmus 28.

Ud over sin egnethed til både mekanistiske og regulatoriske undersøgelser, denne metode giver mulighed for sammenlignende undersøgelser mellem somatiske og kønsceller Mutatipå raterne. Nylige undersøgelser tyder på, at for nogle agenter kønscellemutationer kan fremkaldes ved lavere koncentration end nødvendigt for somatisk mutation. For eksempel, langvarig udsættelse for N-hydroxymethylacrylamide, en metabolit af maden kræftfremkaldende acrylamid 12, øger hyppigheden af dominerende dødelige kønscellemutationer i mus uden at påvirke mikrokernetesten frekvens i de røde blodlegemer, en traditionel måling af somatiske celler cytogenetiske skader 13. Derudover eksponering af mus for både mainstream og sidestrømsemissioner tobaksrøg forårsager forhøjede mutationsfrekvenser på tandemgentagelse DNA loci i sædceller ved doser, som ikke øger blod micronucleus frekvens 14. Disse resultater udfordrer den antagelse, at somatiske genotoksicitetstestning er altid beskyttende overfor mikrobelinien og styrke efterspørgslen efter en mere effektiv og omkostningseffektive middel til at kvantificere kimcellens mutationshyppighed. Beviserne for præferentielle kimcellemutagener er dog stadig svag, Hovedsagelig på grund af mangel på tilgængelige data til at sammenligne mutationsrater i somatiske og kønscellevirkninger væv. TGR mutationsanalyse tillader parallel afprøvning og sammenligning af inducerede mutationsrater i flere væv, der anvender samme transgen. Således sammenlignende mutation test med TGR analysen vil hjælpe med at udfylde datahuller omkring muligheden for at præferentielle kønscelleeffekter.

Samtidig vurdering af somatiske og kønsceller mutation til lovmæssige forsøg vil også forbedre effektiviteten ved at reducere antallet af dyr, der kræves. OECD guideline for somatisk mutation anbefaler en 28 dages administration tid, efterfulgt af en tre dages prøveudtagning (28 + 3). Analyse af cauda sædceller kan give dårlig følsomhed på dette tidspunkt, da den er rettet mod celler mest udsat under spermatocyte og sædcelleantal faser af spermatogenesen (Figur 3). Celler i disse faser ikke syntetisere DNA og gradvist mister deres evne til DNA-reparation 6 </ Sup>. Desuden vil prøveudtagning cauda sædceller på dette tidspunkt ikke at påvise mutationer, der forekommer i spermatogonia og stamceller. Således til integration i design 28 + 3, OECD guideline anbefaler indsamling af kønsceller fra sædkanalerne. Denne blandede population indeholder celler afledt af DNA-syntese og reparation dygtige celletyper, herunder stamceller og udsættes tværs størstedelen af ​​sædcelledannende faser. Men på grund af den blandede natur af disse celler, sædkanaler celleanalyse ikke giver fase-specifikke oplysninger. Desuden er der bekymring for, at tilstedeværelsen af ikke-target-celler kan påvirke den observerede MF (f.eks falsk positive kimcellemutagen opkald på grund af forurening af muterede somatiske celler, eller fortynding af en muteret kim celle signal fra DNA-reparation-manglende kønsceller) . I øjeblikket er der ikke tilstrækkelige data til at konkludere, om resultaterne fra sædkanalerne celler ved 28 + 3 tilbyde den samme følsomhed og specificitet as cauda sperm på senere tidspunkter. Vores laboratorium er i øjeblikket sammenligne inducerede MFIer i sædkanalerne celler og cauda sæd opsamlet efter forskellige prøveudtagning for at løse dette punkt. Vi bemærker, at OECD guideline antyder en alternativ prøveudtagning tid på 28 dage for langsomt delende væv, såsom leveren, der kan også være egnet til kønsceller analyse. Ikke desto mindre er de foreliggende data er stadig utilstrækkelig, og vi er i øjeblikket ude af stand til at anbefale en enkelt eksperimentelle design til samtidig analyse af somatiske celler og kimceller hjælp af TGR mutationsanalyse til lovmæssige forsøg.

Et kendetegn ved dette assay, der bør bemærkes, er, at mutationsbegivenheder vurderes på et ikke-murint transgen. Men der er rigeligt med beviser for, at den transgen reagerer på miljømæssige mutagener på en lignende måde til endogene gener 20. Hertil kommer, fordi de præcise oprindelse af uafhængige mutationsbegivenheder er vanskelige atløse, er resultaterne generelt rapporteret som en mutant frekvens (i modsætning til en mutation frekvens). Den aktuelle Mutationsfrekvensen kan løses, hvis resultater er korrigeret for klonal ekspansion (dvs.. Deling og formering af en enkelt muteret celle, der kan bidrage til den observerede hyppighed af transgene mutanter) ved DNA-sekventering. Sekventering af de mutante transgener kan udføres for at karakterisere lacZ mutationer og identificere mutanter, der kan være afledt fra klonale ekspansion arrangementer, selv om dette gør det betydeligt tiden og omkostningerne for analysen. I tillæg til lacZ-genet, theλgt10 transgene vektor rummer en alternativ temperaturafhængige mutation reportergen: en variant af λ cll-genet, som er kortere (294 bp vs 3021 bp lacZ, figur 1) og lettere at sekventere 29. Sekventering tillader også analyse af den inducerede mutation spektrum, der giver indsigt i mutatioudg mekanisme af den pågældende forbindelse. Et ekstremt eksempel på klonal ekspansion er forekomsten af en "jackpot" mutation (dvs.., Transgene mutationer på et meget tidligt stadie af et organ udvikling, der bidrager til en dramatisk forhøjet MF, undertiden flere hundrede til flere tusinde gange større end baggrunden). Dyr eller væv med en "jackpot" mutation bør fjernes fra analysen.

Assayet, som vi har beskrevet, er bredt anvendelig til andre TGR modeller såsom BigBlue mus og rotter, og lacZ-plasmid mus, som alle harbor lignende mutation reporter vektorerne (gennemgået i 20). Langt størstedelen af kønscellevirkninger undersøgelser udført til dato, der anvender lignende metoder har fokuseret næsten udelukkende på velbeskrevne mutagener såsom ENU og stråling (revideret i 30). Det forventes, at med den nylige løsladelse af OECD test guideline for TGR analysen, vil denne analyse væremere populært for kemisk screening og lovgivningsmæssige evaluering. Inkorporering af TGR kimcellens mutationsanalyse i et lovmæssige forsøg batteri vil udfylde det eksisterende hul ved at tillade en effektiv vurdering af mutation induktion i kønsceller 11. Desuden kan dette assay anvendes til at måle MF i stort set alle væv, hvilket giver et egnet middel til at sammenligne de relative følsomheder af somatiske celler og kimceller til induktion af mutationer af miljøskadelige stoffer ved identiske genetiske mekanismer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MutaMouse Covance -
E. coli (lacZ-/galE-) Covance - See reference 25 in manuscript
Chloroform Caledon 3001-2-40
Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) Gibco 14190-250
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M, pH 8 Sigma-Aldrich 03690 FLUKA
Isoamyl alcohol Caledon 2/10/7900
Lennon LB broth base Invitrogen 12780-029
Stainless steel mesh filter Sigma-Aldrich S3770
Transpack packaging extract Agilent Technologies 200220
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) Commercial Alcohols -
Ampicilin Gibco 11593-027 prepare 20 mg/ml in dH2O
Kanamycin Gibco 11815-024 prepare 5 mg/ml in dH2O
Phenol Invitrogen 15509-097 Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction
Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) Sigma-Aldrich P6501 dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide
Proteinase K Invitrogen 25530-031 prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample
Sodium acetate (NaAc) Fisher Scientific BP333-500 prepare 3 M solutution, pH 5.2
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L4390 prepare 10% solution in dH2O
1 M MgSO4 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
LB Broth 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1 L dH2O. Autoclave and cool
Saline sodium citrate (SSC) 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 
SM Buffer 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1 L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahmadi, A., Ng, S. C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J. Exp. Zool. 284, (6), 696-704 (1999).
  2. Crow, J. F. The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation. Nat. Rev. Genet. 1, (1), 40-47 (2000).
  3. Nelson, K., Holmes, L. B. Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants. N. Engl. J. Med. 320, (1), 19-23 (1989).
  4. Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father's age to disease risk. Nature. 488, (7412), 471-475 (2012).
  5. Michaelson, J. J., et al. Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation. Cell. 151, (7), 1431-1442 (2012).
  6. Marchetti, F., Wyrobek, A. J. DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage. DNA Repair (Amst). 7, (4), 572-581 (2008).
  7. Marchetti, F., Wyrobek, A. J. Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities. Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75, (2), 112-129 (2005).
  8. Demarini, D. M. Declaring the existence of human germ-cell mutagens. Environ. Mol. Mutagen. 53, (3), 166-172 (2012).
  9. Epstein, S. S. Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals. Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).
  10. Russell, W. L. X-ray-induced mutations in mice. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).
  11. Singer, T. M., Yauk, C. L. Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century. Environ. Mol. Mutagen. 51, (8-9), 919-928 (2010).
  12. Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. Acrylamide: A cooking carcinogen. Chem. Res. Toxicol. 13, (6), 517-522 (2000).
  13. Witt, K. L., et al. Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay. Environ. Mol. Mutagen. 41, (2), 111-120 (2003).
  14. Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, (31), 12811-12814 (2011).
  15. Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus. Mutat. Res. 500, (1-2), 147-156 (2002).
  16. Niwa, O. Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci. Mutat. Res. 598, (1-2), 61-72 (2006).
  17. Campbell, C. D., et al. Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population. Nat. Genet. 44, (11), 1277-1281 (2012).
  18. Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism. Mutat. Res. 750, (2), 96-106 (2012).
  19. Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements. Mutagenesis. 25, (6), 609-616 (2010).
  20. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat. Res. 590, (1-3), 1-280 (2005).
  21. OECD. OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. (2011).
  22. Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice. Toxicol. Lett. 17, (1-2), 77-80 (1983).
  23. Russell, L. B. Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse. Genetica. 122, (1), 25-36 (2004).
  24. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting sperm and artificial insemination of mice. J. Vis. Exp. (3), 184 (2007).
  25. Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20, (12), 3254 (1992).
  26. Lemieux, C. L., et al. Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse. Environ. Mol. Mutagen. 52, (9), 756-765 (2011).
  27. Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, (16), 7485-7489 (1995).
  28. Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, (11), 3589-3591 (1982).
  29. Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. The cII locus in the MutaMouse system. Environ. Mol. Mutagen. 34, (2-3), 201-207 (1999).
  30. Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays. Mutat. Res. 598, (1-2), 164-193 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics