Tissue Triage und Einfrieren der Modelle von Skelettmuskelerkrankungen

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Meng, H., Janssen, P. M., Grange, R. W., Yang, L., Beggs, A. H., Swanson, L. C., Cossette, S. A., Frase, A., Childers, M. K., Granzier, H., Gussoni, E., Lawlor, M. W. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J. Vis. Exp. (89), e51586, doi:10.3791/51586 (2014).

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Abstract

Skelettmuskel ist ein einzigartiges Gewebe aufgrund seiner Struktur und Funktion, die spezifische Protokolle zur Gewebesammlung erfordert, um optimale Ergebnisse funktional, zellulären, molekularen und pathologische Auswertungen erhalten. Aufgrund der Feinheit des pathologischen Anomalien in einigen angeborenen Muskelerkrankungen und der Möglichkeit zur Befestigung mit der Anerkennung dieser Funktionen stören gesehen, pathologische Auswertung der gefrorenen Muskel vorzuziehen, feste Muskeln bei der Auswertung der Skelettmuskulatur für angeborene Muskelerkrankung. Darüber hinaus wird das Potenzial zu schweren Einfrieren Artefakte im Muskel produzieren erfordert besondere Vorkehrungen beim Einfrieren der Skelettmuskulatur für die histologische Untersuchung, die nicht häufig verwendet werden, beim Einfrieren von anderen Geweben. Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll zum schnellen Einfrieren von Skelettmuskel mit Isopentan (2-Methylbutan) mit flüssigem Stickstoff gekühlt, um eine optimale Skelettmuskelmorphologie erhalten. Dieses Verfahren ist auch für freezing Gewebe zur genetischen oder Proteinexpressionsstudien vorgesehen. Darüber hinaus haben wir unsere Gefrierprotokoll in eine breitere Verfahren, das beschreibt auch bevorzugte Verfahren für die kurzfristige Triage-Gewebe für (1) Einzelfaser funktionelle Studien und (2) Myoblasten-Zellkultur, mit einem Fokus auf den minimalen Aufwand, der notwendig zu sammeln integriert Gewebe und transportieren sie zu spezialisierten Forschungs oder Referenzlabors, diese Studien abzuschließen. Insgesamt bietet diese Handschrift einen Überblick, wie frisches Gewebe effektiv für eine Vielzahl von phänotypischen Studien verteilt und bietet Standardarbeitsanweisungen (SOPs) für pathologische Untersuchungen zu angeborenen Muskelerkrankung im Zusammenhang damit.

Protocol

Beschriften Sie die Behälter für die Muskelspeicher mit entsprechenden Kennungen für die Tier-und Muskel geerntet werden. Pre-kühlen die Säcke / Behälter und Instrumente, um Einfrieren / Auftauen des Gewebes zu verhindern, wenn es zugegeben wird.

1. Studiendesign Überlegungen für Muskelgewebe Sammlung

  1. Für kleine Tier (Maus-) Modelle der Muskelerkrankung, verwenden Sie eine ganze Muskel für die Studie, da kleine Tiermodelle erfordern oft Auswertung eines gesamten Muskel, um eine ausreichende myofiber Probenahme für die pathologischen Studien. Für Großtier (Hund) Modelle Muskelerkrankung, Muskelabschnitte verwenden, die mindestens 0,3 x 0,3 cm oder mehr in ihre Querrichtung (Querschnitts-) Aspekt sind.
    HINWEIS: Core-Biopsien kann auch verwendet werden, kann aber nicht optimal für die primäre Charakterisierungsstudien durch Probenahme Themen sein.
  2. Für Studien, die die Sarkomer kann die Messung von ultra Sarkomerlänge eine kritische Endpunkt umfassen und kann require spezialisiert Handhabung. Dies ist normalerweise nur bei Erkrankungen relevant, wenn Elemente der Show Sarkomer unangebracht Längen, wie in einigen Ursachen der Nemalin Myopathie. Manche Labors lieber Muskel in seinem nicht vertraglich oder gestreckten Zustand zu beheben, anstatt diese Messungen auf nicht gespannt oder nicht gedehnte Muskeln.
    1. Wenn Sarkomerlänge wird nicht gemessen werden kann, beheben das Muskelgewebe ohne Vorstrecken der Muskel, indem Sie es direkt in die gewünschte EM Fixiermittel (siehe Reagenzien).
    2. Wenn Sarkomer Längen gemessen werden, können verschiedene Techniken vor, dehnen die Muskeln (siehe Diskussion) verwendet werden:
      1. Verwenden Sie eine Spannvorrichtung, um den Muskel zu seiner Ruhe Spannung zu halten, während es noch in der Tier, auszuschneiden die Muskeln um die Außenseite der Klemme, und legen Sie sie direkt in die gewünschte EM Fixiermittel (siehe Reagenzien).
      2. Strecken und Pin den Muskel zu einer Oberfläche (zB ein Stück Kork) bei einer Länge entsprach derjenigen

2. Unterteilung des isolierten Skelettmuskel in Fragmente, die für die entsprechende Wunsch Studien sind (Abbildung 1)

  1. Für gefrorene Muskel Histologie:
    1. Fügen Sie so viel von einem bestimmten Muskel wie möglich Sampling Bias zu minimieren (siehe Schritt 1.1), aber Proben sollten 1,5 cm Vereisung zu vermeiden Artefakte <.
    2. Behandeln alle Muskeln aus der gleichen Studie ähnlich artifactual Unterschiede in der Fasergröße aufgrund der Unterschiede in der Handhabung zu verhindern.
  2. Für die Elektronenmikroskopie (EM):
    1. Schnitt ein ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm Streifen aus Muskel aus der Probe, die mit der Längsachse der Probe parallel zur Längsachse des ursprünglichen Muskel.
      Hinweis: Das Fixiermittel wird nicht ausreichend durchdringen dickeren Gewebestücken, so dass die Aufrechterhaltung der Probendicke von 2 mm oder weniger ist wesentlich, um entsprechende Ergebnisse. Zusätzlichals Orientierung wie kleine Fragmente von Muskel ist oft schwierig ist, ist es ratsam, ein Fragment von Gewebe, das die tatsächliche Ausrichtung des Muskels (dh die längste Aspekt der fixierten Probe die Längsorientierung der Muskel / Muskelfasern) zu verwenden nachahmt Handling zu minimieren und Verwirrung während EM-Verarbeitung.
  3. Für die Zellkultur:
    1. Die gewünschte Zellausbeute kann die Menge der Muskelzellkultur-Einrichtung erforderlich beeinflussen. Einzelne Muskeln (oder Teile von Muskeln) von kleinen Tieren unzureichend Zellzahlen zu Zellkulturen herzustellen bereitzustellen, so dass, wenn notwendig, Pool Gewebe aus mehreren Muskeln.

3. Gewebefixierung und-verarbeitung für Elektronenmikroskopie (EM)

  1. Legen Sie ein Fragment des Muskel nicht mehr als 2 mm in seiner dünnsten Dimension direkt in die gewünschte EM Fixiermittel (siehe Reagenzien).
  2. Setzen Sie den Muskel im EM Fixierungspuffer (siehe Reagenzien) nach 2-48 h fixatiauf. Längerer Fixation (für Wochen oder Monate) kann zum Verlust von ultra Detail auf EM-Studien führen.
  3. An einer EM-Core Facility für die Verarbeitung.

4. Muscle Einfrieren für histologische, biochemische und molekularbiologische Untersuchungen

  1. Entfernen Sie übermäßige Feuchtigkeit in der Probe durch gründliches Abtupfen der Probe mit einem Papiertuch, bis das Gewebe ist etwas verwachsen das Handtuch. Übermäßige Feuchtigkeit erhebliche Einfrieren Artefakte in den Muskel zu produzieren.
    HINWEIS: Gewebe kann weiter durch Rollen in Babypuder getrocknet werden. Dieser Schritt ist in der Regel nicht notwendig, für die Muskeln, wenn sie nicht in einer übermäßig feuchten Umgebung gewesen.
  2. Zeigen Oktober (oder eine ähnliche Klebstoff, wie Tragant) im Boden eines flachen cryomold oder Kork, mit nur genug Oktober, um eine Grundlage für die orientierten Muskel (2C) zu liefern. Beschriften Sie den Korken oder cryomold vor dem Einfrieren kann nützlich sein für die Probenverfolgung.
  3. CAREFUlly legen den Muskel in die Form in der gewünschten Orientierung, mit der Mehrheit der Muskel von OAT vorsteht, so dass geschnittene Muskel ist nicht in Kontakt mit OCT (Fig. 2C).
  4. Hinzufügen Isopentan zu einem Metallbecher, bis sie eine Tiefe von etwa 3-4 cm erreicht.
  5. Setzen Sie auf Wärmeschutzhandschuhe und entfernen Sie den Deckel des Dewar.
  6. Platzieren oder Halten des Metallbecher in Kontakt mit dem flüssigen Stickstoff, so daß der Pegel von flüssigem Stickstoff an der Außenseite des Bechers über dem Niveau des Isopentan auf der Innenseite der Schale ist. Strategien, um diese Behälter anzuordnen sind in Abbildung 2 dargestellt.
    1. Lassen Sie keine flüssigen Stickstoff, um die Metallschale geben, wie es erzeugt einen sprudelnden Schaum, der schwerfällig, um mit zu arbeiten (und ist auch nicht ausreichend kalt für Einfrieren).
  7. Beachten Sie die Isopentan zu bestimmen, wenn es die geeignete Temperatur erreicht hat. Bei der geeigneten Temperatur (optimal zwischen -140 bis -149 ° C), so dassDeckel weiße Kieselsteine ​​von Isopentan gefroren wird gebildet (nach einigen Minuten, und nachdem die anfängliche Schleier oben Isopentan verschwunden ist) auf der Unterseite der Schale, oder die Lösung wird in der Regel verdickt, um die Konsistenz von Melasse. Einfrieren vor dieser Etappe wird Einfrieren atifacts ergeben.
    1. Wenn das Isopentan ganz friert, es taut und Chill-Gefriertemperaturen wieder, bevor die anschließende Verwendung.
  8. Mit vorgekühlten Pinzette, senken Sie die Probe und Kork / Form in die Isopentan für ca. 10-20 Sekunden.
  9. Legen Sie die gefrorene Probe in einen vorgekühlten Behälter.
  10. Halten Sie Probe und Behälter auf Trockeneis zu allen Zeiten bis zum Transfer zu einem -80 ° C Gefrierschrank.

5. Wenn Freezing Artefakt ist bereits Gegenwart in gefrorenem Gewebe, ist es möglich, den Grad der Verbesserung Freezing Artefakt mit dem folgenden "auftauen und wieder einfrieren" Verfahren

  1. Nehmen Sie Blöcke aus dem Tiefkühlfach, ein zu einer ZeitUnd halten sie auf Trockeneis. Der Zeitpunkt dieses Protokoll ist kritisch. Nur auftauen und wieder einfrieren einen Block zu einem Zeitpunkt.
  2. Bewegen Probe von Trockeneis auf RT.
  3. Wenn die Probe in OCT eingebettet ist, entfernen Sie die umliegenden Oktober so vollständig wie möglich mit einem Skalpell.
  4. Die Probe wird bei Raumtemperatur bis zu dem Punkt, wo es vollständig aufgetaut ist auftauen, aber nicht bis zu dem Punkt, wo es austrocknet.
    1. Sanft prod der Probe mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass die Probe vollständig vor der in die nächste Stufe aufgetaut.
  5. Frieren Sie das Muskel wie in Schritten von 4,1 bis 4,10 angegeben.

6. Vorbereitung der Muskel für Skinned Single Fiber Functional Testing

  1. Das Speicherverfahren für die Muskel hängt, wenn der Muskel / Faser wird für die Experimente verwendet.
    1. Für den Einsatz innerhalb von wenigen Wochen, legen Sie den Muskel in einer Lösung von 50% glycerol/50% entspannenden Lösung (siehe Reagenzien), und bei -20 ° C
    2. Für den Einsatz achterner ein paar Wochen, legen Sie den Muskel in einer Lösung von 75% glycerol/25% entspannenden Lösung (siehe Reagenzien) und bei -80 ° C
    3. Alternativ lassen Muskel trocken, Stift Kork, und speichern auf Silica-Granulat bei -80 ° C Diese dehydriert Muskeln kann über Jahre verwendet werden.

7. Vorbereitung von Fresh Muscle für den Versand der Zellkultur bis Aussen Laboratories

Protokolle für die Etablierung von Zellkulturen wurden an anderer Stelle 4-7 gut beschrieben worden.

  1. Füllen Sie eine 50 ml konischen Röhrchen mit sterilen sterile komplette Wachstumsmedien.
  2. Fügen Sie die Muskeln an der Röhre mit einer sterilen Pinzette, das Gewebe in Medien Notlaufeigenschaften.
    1. Füllen des Rests des Rohrs mit Medien Trocknung während des Transports zu verhindern.
  3. In Eisbeutel auf die Styropor-Box und legen Sie die konischen Rohr in der Nähe mehrere Eisbeutel.
    1. Bitte beachten Sie, dass nur Eisbeutel (und nicht Trockeneis) verwendet werdenum Schäden durch Gefrieren der Flüssigkeit und Gewebe zu verhindern.
  4. Schiffs Pakete O / N, aber Gewebe können 2 Tage unter diesen Bedingungen dauern.

Representative Results

Um Beispiele für die Artefakte mit unsachgemäßen Einfrieren gesehen zu schaffen, wurden mehrere Maus Quadrizeps-Muskeln mit verschiedenen Techniken (Abbildung 3) auf häufig anzutreff Fehler replizieren eingefroren. Wie in 3A gezeigt ist, in geeigneter Weise eingefroren Skelettmuskel zeigt eine enge Apposition Muskelfasern des umgebenden Gewebes (gewöhnlich andere Muskelfasern, sondern manchmal das Endomysium Raum zwischen Muskelfasern mit Fibrose oder Entzündungszellen in einer Vielzahl von Krankheiten oder Verletzungen Prozessen gefüllt) und eine deutlich sichtbare cytoplasmatische Fach. Für die pathologische Analyse ist die Fähigkeit, die intrazellulären Raum anzuzeigen oft wichtiger als die Endomysium-Fach, wie es in der Regel wichtig, die Anwesenheit von degenerativen Veränderungen, regenerativen Veränderungen oder andere pathognomonisches Befunde (Zentralkernen, intrazelluläre Einschlüsse) in diese eindeutig zu identifizieren Raum. Somit ist die Anwesenheit von Eiskristallen in dem intrazellulären Kompartiment Uhrichtige Problem in der pathologischen Beurteilung der Muskel.

Ordnungsgemäße Einfrieren des Muskelgewebes erfordert sowohl ausreichend kalten Temperaturen und eine ausreichende Geschwindigkeit des Einfrierens, um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern. Auch bei der Bilanzierung von beiden Faktoren können erhebliche Einfrieren Artefakt immer noch wegen der übermäßigen Feuchtigkeit tritt im Muskelgewebe. Diese Frage wird am häufigsten in der Muskulatur, die zuvor in Kochsalzlösung eingetaucht worden war und nicht ausreichend getrocknet oder als Muskel in direktem Kontakt mit Oktober Montage Medien an der Stelle der Schnitt (3B, 3E) aufgetreten. Während einige Kontakt mit Oktober ist in der Regel unvermeidbar als Folge des Montageprozesses sollten alle Anstrengungen unternommen werden, um den Kontakt zwischen den Bereichen, die histologisch untersucht werden und die für die Montage verwendet Oktober zu vermeiden. Im Gegensatz dazu die Proben eingefroren mit einem -80 ° C Gefrierschrank (3C) und flüssigem Stickstoff (3D) bieten beispielsweises Gefrierpunkt Artefakt, das durch suboptimale Temperatur oder Gefriergeschwindigkeit erzeugt wird. Die langsame Gefrierverfahren, indem Gewebe in einem -80 ° C Gefrierschrank angetroffen stellt ein extremes Beispiel für das Einfrieren Artefakte. Bei Verwendung von flüssigem Stickstoff, ist das Hauptproblem, dass der Kontakt zwischen flüssigem Stickstoff und dem Gewebe verursacht eine Hülle aus gasförmigen Stickstoff in der Gewebe-Flüssigkeit-Grenzfläche zu bilden, und dieses gasförmige Schnittstelle nicht kalt genug, um eine schnelle Einfrieren Muskel 1 herzustellen. Dies kann erhebliche Einfrieren Artefakt in der Nähe der Oberfläche der Probe zu produzieren, aber interne Bereiche der Probe sind mit einer geeigneten Geschwindigkeit eher Flash-freeze und kann vollständig aus Einfrieren Artefakt verschont bleiben. Während das einfache Eintauchen des Muskelgewebes in flüssigem Stickstoff ist bei weitem nicht so nützlich, wie Isopentan-Gefrierprozess, kann es sinnvoll für das Einfrieren der großen Muskelproben in Situationen, in denen Isopentan ist nicht verfügbar (wie klinische Autopsie Proben bei Institutionen seinklinische Muskel Pathologie-Laboratorien). Ergebnisse mit dieser Strategie sind in der Regel besser, wenn große Teile des Gewebes (> 2 cm in mehreren Dimensionen).

Während die Vermeidung von Gefrierartefakten bietet optimale histologischen Ergebnisse wurde eine Technik entwickelt worden (und beschrieben), die im Wesentlichen kehrt Einfrieren Artefakte, die Bewertung der ordnungsgemäß gefrorenem Gewebe zu ermöglichen. Gewebe, die nicht ordnungsgemäß eingefroren wird (Fig. 3E) kann aufgetaut und unter streng kontrollierten Bedingungen (Fig. 3F) eingefroren, um die Umverteilung von Wasser in den Fasern zu ermöglichen, und der Grad der morphologischen Konservierung, die erhältlich ist, kann ausgezeichnet sein. Nach unserer Erfahrung ist dieses Verfahren erhält die intrazelluläre Morphologie des Gewebes zu einem bemerkenswerten Ausmaß, aber oft ein Artefakt Trennung der Fasern innerhalb der Endomysium-Raum. Wie vielen pathologischen Endpunkte sind in den intrazellulären Raum und die in gefundendie endomysiale Raum werden am besten mit Spezialfärbungen (entweder Fibrose hervorzuheben oder andere Zelltypen zu identifizieren), sind diese Änderungen artifactual unwahrscheinlich, dass die pathologische Auswertung der Muskel wirklich beeinträchtigen.

Figur 1
Fig. 1 ist. Triage Gewebe für strukturelle, funktionelle und zelluläre Studien von Skelettmuskel. Abhängig von den Arten von Studien gewünscht, können gesammelt Skelettmuskelgewebe in einer Vielzahl von Möglichkeiten für optimale Ergebnisse verarbeitet werden. Die in diesem Dokument beschriebenen Protokolle beschreiben Verfahren zur Selektierung oder Bearbeitung der Skelettmuskulatur Proben für die Off-Site-Studien, um die Ergebnisse, die aus Expertenkernanlagen zu optimieren.

Figur 2 2. Beispiele für Vorrichtungen zur Muskel Einfrieren verwendet. Wie in dem Protokoll beschrieben, optimale Muskel Einfrieren erfordert Eintauchen des Muskelgewebes in Isopentan, das in seiner Gefriertemperatur ist. Ein sicheres und effizientes Mittel zur Erlangung eiskaltem Isopentan umfasst die Verwendung eines Metallbehälters für das Isopentan, das in einem umgebenden gekühlten Dewar mit flüssigem Stickstoff. Da es oft bequem beide Hände frei zu haben, ist es möglich, eine Klammer wie ein Ringgerüst (A) verwenden, um den Behälter Isopentan in den flüssigen Stickstoff zu halten, während gegen das Vermischen der beiden Flüssigkeiten. Alternativ kann der Behälter auch in den flüssigen Stickstoff manuell (B) gehalten werden. In jedem Fall wird das Gewebe nicht in das Isopentan, bis das Isopentan sichtbar Gefrieren am Boden des Behälters (üblicherweise opake, weiße Kieselsteine), dann sollte für 10-20 Sekunden getaucht werden, um eine vollständige Gefrieren ermöglichen platziert werden. Isopentane bei Gefriertemperatur erzeugt minimal "Nebel", (das heißt, wenn die Temperatur unzureichend beträchtlichen Nebel vorhanden ist). Sobald das Gewebe eingefroren ist, legen Sie sie direkt in die vorgekühlten Behälter (und dann direkt in einen Kühler-oder Gefrierschrank), um ein versehentliches Auftauen nach dem Einfrieren zu verhindern. (C) Passend montiert gefrorenen Muskel sollte die Mehrheit der von einer Basis von gefrorenen OCT hervor Muskelgewebe haben.

Fig. 3
Abbildung 3. Beispiele Artefakt Einfrieren und Auftauen der effektiven / Wiedereinfrieren. Repräsentative Bilder von (A) entsprechend Isopentan eingefroren Muskel, (B) Muskel angemessen in Isopentan eingefroren, aber während in Kontakt mit Oktober Montagemedium, (C) eingefroren Muskel in einem -80 ° C Gefrierschrank und (D (B) gezeigt, der hohe Flüssigkeitsgehalt Oktober produziert signifikante Einfrieren Artefakt in Muskel, der mit ihm in Kontakt ist, so dass nur die minimale Menge von Oktober für die Montage erforderlich verwendet werden sollte, und der Muskel für die histologische Evaluierung sollte "stehend sein out "von seiner Oberfläche. Die Langsamkeit des Gefrierverfahren unter Verwendung einer (C) -80 ° C Gefrierschrank oder (D) flüssiger Stickstoff (bezogen auf die Geschwindigkeit des Einfrierens in eiskaltem Isopentan) können zur Herstellung von signifikanten Einfrieren Artefakte führen. Panels E und F zeigen Muskel aus der gleichen Probe, die war (E) zunächst suboptimal gefroren (aufgrund übermäßiger Kontakt mit OCT) und dann (F) aufgetaut und wieder eingefroren unter Verwendung der hier beschriebenen Technik. Während man einige Artefakt Trennung zwischen den Fasern wieder eingefroren in der Probe zu beobachten, die Verbesserung in die intrazelluläre Morphologie der Muskelfasern ist leicht ersichtlich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Skelettmuskel ist ein strukturell und funktional einzigartige Gewebe und spezialisierte Herstellungsverfahren erforderlich, um die optimale Beurteilung der strukturellen und funktionellen Parameter erlaubt sind. Während eine Vielzahl von Geweben werden üblicherweise für pathologische Untersuchungen in klinischen und Forschungskontexten gefroren Gefrierverfahren für Nicht-Muskelgewebe gewöhnlich die Gesamteintauchen des Gewebes in OCT vor dem Einfrieren. Wie in Fig. 3 gezeigt ist, ist ein solches Protokoll für die pathologische Bewertung der Skelettmuskel nicht geeignet und ist ähnlich genug ist, um das hier beschriebene Protokoll, dass dies eine häufig auftretende Fehler vorhanden. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein einfaches Protokoll für den richtigen Umgang mit Muskel bieten, um Fragen wie diese zu vermeiden. Beratung ist auch auf die richtige Handhabung der Muskel für Off-Site-physiologischen und zellulären Studien in dem Bemühen, den Erwerb von qualitativ hochwertigen Daten, die von außerhalb der Kern Labors, erleichtern zusammengestellt where Vor-Ort-Studien sind nicht bevorzugt oder möglich ist.

Wie in diesem Protokoll angegeben, Elemente, die für die pathologische Studien in der richtigen Verarbeitung von Muskel unbedingt erforderlich sind, umfassen eine Minimierung der Wassergehalt des Gewebes, die Verringerung der Temperatur, bei der der Muskel eingefroren, und die Erhöhung der Geschwindigkeit, mit der Gefrierpunkt erreicht wird. Mäßiger Feuchtigkeit im Gewebe oder übermäßige Langsamkeit des Gefrierprozesses (durch unzureichende Temperaturen oder durch fehlende direkte Kontakt zwischen der Vereisungsmittel und dem Gewebe, hergestellt als mit flüssigem Stickstoff angetroffen wird) wird dem Einfrieren Artefakte, die pathologische Analyse beeinträchtigen können. Wie Oktober eine zusätzliche Quelle der Feuchtigkeit der Gewebe, viele Labors verwenden andere Klebstoffe wie Tragant als Einbettungssubstrat. Selbst in Fällen, wo das Gefrieren angemessen durchgeführt wird, sollte darauf geachtet werden, um anschließend zufällig Auftauen Proben durch Kontakt mit RT Behälter oder Instrumente zu vermeiden.So eine erfolgreiche Gefrierprozess erfordert ein gewisses Maß an Planung, die eine Pre-chilling aller Instrumente und Behälter verwendet werden umfasst. Beim Einfrieren Artefakte auftreten, besteht die für die Wiederherstellung des Gewebes, das für die meisten pathologischen Bewertungen hier beschriebenen Verfahren. Allerdings bedeutet dies Frost / Tau-Zyklus nicht bieten perfekte Histologie und hat das Potenzial, andere molekulare oder enzymatische Untersuchungen des Gewebes (zusätzlich zu der Zeit benötigt, um wieder einfrieren das Gewebe) beeinträchtigen, so mit geeigneten Anfangs Einfrieren Praktiken vorziehen, . In Fällen, in denen das Einfrieren Artefakte auf vorgefrorene Gewebe angetroffen wird jedoch die hier beschriebene Technik kann sehr nützlich sein.

Fixierung und Verarbeitung von Gewebe für die EM können bestimmte technische Herausforderungen, die Planung vor der Gewebesammlung erfordern bieten. Der häufigste Fehler beim Sammeln von Proben für die EM ist die Verwendung von Gewebefragmente, die zu dick sind für Glutaraldehyde zu durchdringen. Wie Glutaraldehyd dringt nur etwa 0,1 cm in das Muskelgewebe aus einer gegebenen Oberfläche, sollte darauf geachtet werden, dass eine Dimension der EM Proben nicht dicker als 0,2 cm. Zusätzlich, wie EM ist ein ausgezeichnetes Mittel zur direkten Auswertung des kontraktilen Apparates, einige Forscher haben Strategien entwickelt, um vorspannen oder Vorstreckung der Muskel vor der Fixierung, um die Messung der kontraktilen Elemente bei einem physiologisch relevanten Spannung zu ermöglichen. Es gibt kein Standardprotokoll für die Vorspannung, sondern zwei Strategien werden kurz in diesem Protokoll beschrieben. Es ist zu beachten, dass vor Spannen der Muskel kann zu unvorhersehbaren Ergebnissen führen, wenn sie nicht in einer ganz bestimmten Art und Weise getan, und es kann von Vorteil sein, die Muskeln im schlaffen Zustand zu fixieren, um Artefakt Veränderungen in Sarkomerlänge durch einen Nicht-Standard zu verhindern versucht werden Vorspannverfahren 8,9. Für Muskeln, in denen diese spezifischen Messungen sind nicht erforderlich (einschließlich der meisten biopsies für klinische Zwecke durchgeführt), Anstrengungen zur Vorspannung des Muskels in der Regel nicht aus, und die Hauptwirkung auf Muskel-Morphologie ist eine nicht-gleichförmigen Abstand von Sarkomeren in den Muskel.

Dieses Papier stellt die erste in einer Reihe auf SOPs für die Durchführung von Prüfungen im Bereich angeborene Muskelerkrankungen bereitzustellen, und es steht für die Bemühungen von mehr als 20 Experten in der angeborenen Muskelerkrankung Feld, die routinemäßig zelluläre, molekulare, funktionelle, physiologische durchzuführen, und pathologische Forschung. Eine Reihe von SOPs veröffentlicht wird im kommenden Jahr zur Verfügung gestellt werden, und die notwendigen Protokolle und geeignete Formate für jede Veröffentlichung wurden mit einer angeborenen Muskelerkrankung Consortium Werkstatt im April 2013 in Washington DC erörtert Das Ziel dieser Bemühungen ist es, SOP bieten ein Fahrplan für die notwendige Prüfung und Analyse der Proben im Bereich angeborene Muskelerkrankung zu 1) zu standardisieren, die Praktiken und Endpunkte in unserem Bereich als m verwendetuch wie möglich, und 2) bieten Unterricht auf Standard-Verfahren für neue Forscher in unserem Bereich. Wir glauben, dass diese Ressourcen den Markteintritt neuer Ermittler in unsere untersuchten Bereich zu erleichtern und verbessern so den Umfang der Forschung, die durchgeführt werden können. Zusätzlich wird eine Vereinheitlichung der Praxis als äußerst hilfreich, um Daten über Studien zu vergleichen und identifizieren Endpunkte bei der Planung und Durchführung von präklinischen und klinischen Studien.

Auch wenn der Schwerpunkt dieses Artikels wird in den entsprechenden Einfrieren und Vorbereitung von Gewebe für eine Vielzahl von Studien verwandt, unsere gemeinsame Gruppe diskutierte auch über die nützliche Endpunkte für den pathologischen Analyse von Muskel-Proben. Derzeit gibt es keine offizielle Konsens über die Vorgehensweise bei der Durchführung von pathologischen Analyse zu nehmen, und eine Vielzahl von verschiedenen Studien werden durchgeführt, um neue Erkenntnisse zu früheren Publikationen für die jeweiligen Krankheiten beziehen. So, dachten wir, dass es sinnvoll zu sein,einige allgemeine Richtlinien für die Planung von pathologischen Endpunkten in Muskel Pathologie Charakterisierung vorschlagen. Vor der Quantifizierung der Pathologie in einer Studie, sollten erhebliche Gedanken in 1 die Methode der Fasergrößenmessung gestellt werden), 2) die Möglichkeit, Fasertyp-spezifischen Anomalien oder Behandlungseffekte, 3) die Möglichkeit, Anomalien oder Effekte, die eingeschränkt werden die einzelnen Muskeln und 4) eine Strategie zur Quantifizierung pathologische Befunde, die charakteristisch für die Krankheit untersucht werden. Fiber ist eine notwendige Größe Endpunkt für die meisten Studien, und leider gibt es umfangreiche Variation, wie es quantifiziert wird. Viele Studien berichten diese Ergebnisse mit Hilfe automatisierter Verfahren zur Quantifizierung von proprietären Imaging-Software zur Verfügung gestellt, aber viele dieser Programme nehmen Abkürzungen (wie unter der Annahme, dass die Fasern Kreise oder Ellipsen), die diese automatisierten Messungen ungenau wiedergeben können. Es ist notwendig zu verstehen, wie diese automatisierte Programme machen ihre Messungen bevor mit Vertrauen in den Messungen, und wir ermutigen die Ermittler, diese Details in Papier Methoden umfassen. Zusätzlich ist die spezifische Messung verwendet, um Fasergröße bezeichnen äußerst variabel, und einige Daten sind gegenüber anderen bevorzugt 10,11. Eine häufig verwendete Messung der Fasergröße ist der Faserquerschnittsfläche (CSA), vor allem, weil die Ermittler Durchführung physiologische Studien zu standardisieren ihre Ergebnisse CSA Messungen mit ihren Instrumenten erhalten. Leider, während CSA Messungen genau widerspiegeln Fasergröße in perfekter Querschnitten, sind sie weitgehend abhängig von der Faserorientierung (in dem Maße, längs oder schräg geschnittene Fasern künstlich hoch CSA Messungen) und sind somit nicht ideal für Messungen Fasergröße. Eine bevorzugte Messung der Fasergröße, die weniger abhängig von der Faserquerschnittsfläche ist die minimale Feret-Durchmesser (MinFeret Durchmesser), die die Messung von the-Moll Durchmesser in der Muskelzelle 12. Die Messung ist nur wenig abhängig von Faserorientierung und ist in der Regel die klinische Goldstandard für Lichtmessung, und Ermittler sind aufgefordert, auf die Verwendung dieser Technik zu bewegen. Diese Messungen können häufig unter Verwendung der gleichen Software, die CSA Messungen 13 erzeugt werden, und sind auch einfach manuell zu messen. In Bezug auf die Bewertung der pathologischen Daten nach Fasertyp, bestimmte Muskel, und im Rahmen der pathologischen Befunde von der jeweiligen Krankheit bezogen, das sind weniger kontroversen Themen, die gerade bei der Planung einer Studie berücksichtigt werden sollten. Fasertyp kann unter Verwendung immunhistochemischer oder ATPase-Färbung ausgewertet werden, aber es ist sinnvoll zu berücksichtigen, dass bestimmte Muskeln und Tierarten haben spezielle Mischungen dieser Fasertypen (also erfordern unterschiedliche Erwartungen und Teststrategien). Muskel-spezifischen pathologischen Beteiligung oder die Wirksamkeit der Behandlungauftreten können, und die Gesamtmuskelmasse im Vergleich zu Kontrollen verwendet werden, um den Grad der Heterogenität der Krankheit vor der Entscheidung über die Muskeln, um krankhaft bewerten zu identifizieren. Schließlich ist es bekannt, dass viele Muskelkrankheiten mit spezifischen pathologischen Veränderungen (wie Nemalin Stangen Nemalin Myopathie) 14,15 verbunden ist, und so ist es auch nützlich, um zu prüfen, ob diese Abweichungen werden in einem Fasertyp-oder Muskel gefunden spezifische Verteilung bei der Durchführung der Analyse 16,17. Insgesamt, während wir eine unflexible Reihe von Standards für die Bewertung der Muskel nicht vor, so glauben wir, dass diese Fragen vor der Durchführung von pathologischen Untersuchungen in jeder Skelettmuskelerkrankung angesehen werden.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For tissue freezing
Liquid nitrogen dewar with a liquid withdrawal device Custom Biogenic Systems Lab-5 Series Any other liquid nitrogen dewar could substitute.
Cold-conductive container Fisher 02-583A
Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen Nalgene 4150-2000
Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer Thomas Scientific 1228Y01 Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing.
For single fiber functional testing
Petri dish Fisher Scientific 08-757-11
Sylgard coating Ellsworth Adhesives  3-6636
Dissection stereomicroscope Harvard Apparatus 693101 Any other dissection microscope could substitute.
For cell culture
Sterile laminar flow hood Thermo Scientific 51022485 Any other cell culture hood could substitute.
For tissue freezing
Plastic bags/containers Nasco B01009WA
Thermal safety gloves Denville G4162
Face shield Fisher Scientific S47640
Long forceps Fisher Scientific  12-460-807
Marker Staples 125328
For cell culture
Sterile 50 ml conical tubes Denville C1060-P
PES filter unit, 500 ml, 0.22 µm Denville F5227
Sterile forceps Fisher Scientific 644320
Ice packs Fisher Scientific NC9909223
Insulated styrofoam box Polar Tech 207F
Packing tape Staples 795570
Tissue freezing
Liquid nitrogen Airgas NI NF160LT350 Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids
Isopentane (2-methylbutane) Sigma M32631-4L Store Isopentane  in a flammable materials cabinet. 
EM fixative (choose one) The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM.
2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer Electron Microscopy Sciences 16537-15
Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) Electron Microscopy Sciences 15732-10
For functional studies (if desired) 
Relaxing solution, containing (in mmol/L)
      40 BES Sigma B9879
      10 EGTA Sigma E4378
      6.56 MgCl2 Sigma M8266
      5.88 Na-ATP Sigma A3377
      1.0 DTT RPI D11000
      46.35 K-propionate Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1
      15 creatine phosphate, pH 7.0 Sigma P7936
      0.4 leupeptin Calbiochem 10895
      0.1 PMSF Sigma P7676
Skinning solution, containing 
      Relaxing solution (See Above)
      0.5% Triton X-100 Sigma T8787
Indicating silica granules
Flat pieces of cork (1 x 1 inch) Electron Microscopy Sciences 63305
Glycerol Sigma G2025
For cell culture (if desired)
Complete Growth Medium, containing (for 500 ml) Sterilize by filtering the solution through a 500 ml 0.22 µm PES filter unit.  Store at 4°C and use within 1 month.
395 ml of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Sigma D5671
100 ml of fetal bovine serum (FBS)  Sigma F6178
5 ml of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) Sigma G1146
See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications

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References

  1. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, Elsevier. 407-442 (2007).
  2. Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
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