मानव आईपीएस कोशिकाओं के microRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल, आईपीएस से व्युत्पन्न रेटिना वर्णक उपकला, और भ्रूण रेटिना वर्णक उपकला

Biology

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Summary

microRNA (miRNA) मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) कोशिकाओं (आईपीएस RPE), और भ्रूण RPE से व्युत्पन्न मानव प्रेरित pluripotent स्टेम की प्रोफाइल (आईपीएस) कोशिकाओं, रेटिना वर्णक उपकला (RPE), की तुलना में थे.

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Greene, W. A., Muñiz, A., Plamper, M. L., Kaini, R. R., Wang, H. C. MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (88), e51589, doi:10.3791/51589 (2014).

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Abstract

इस रिपोर्ट का उद्देश्य microRNA (miRNA) मानव आईपीएस कोशिकाओं (आईपीएस) RPE से व्युत्पन्न मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) कोशिकाओं, रेटिना वर्णक उपकला (RPE), और भ्रूण RPE के प्रोफाइल की तुलना के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए है. प्रोटोकॉल माइक्रोएरे द्वारा विश्लेषण के लिए शाही सेना का संग्रह है, और विभिन्न प्रकार से तीन प्रकार की कोशिकाओं के बीच व्यक्त कर रहे हैं कि miRNAs की पहचान करने के लिए माइक्रोएरे डेटा का विश्लेषण शामिल हैं. आईपीएस कोशिकाओं और भ्रूण RPE की संस्कृति के लिए तरीकों से समझाया जाता है. मानव आईपीएस से RPE के भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल भी वर्णन किया गया है. हम वर्णन शाही सेना निकासी तकनीक एक miRNA माइक्रोएरे में उपयोग के लिए बहुत छोटे आरएनए की अधिक से अधिक वसूली की अनुमति के लिए चुना गया था. अंत में, सेलुलर मार्ग और माइक्रोएरे डेटा के नेटवर्क विश्लेषण समझाया गया है. इन तकनीकों में तीन अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं की miRNA प्रोफाइल के तुलना की सुविधा होगी.

Introduction

स्टेम कोशिकाओं सीमा और किसी भी दैहिक सेल प्रकार में अंतर करने की क्षमता के बिना दोहराने की क्षमता है. व्यक्तिगत ऊतक उत्थान के आगमन के क्षितिज 1 पर है के रूप में pluripotent स्टेम सेल में दैहिक कोशिकाओं reprogram करने के लिए तकनीक का विकास, अनुसंधान समुदाय में और चिकित्सकों के बीच काफी उत्साह भी हासिल हुआ है. ESCs के साथ जुड़े नैतिक दुविधाओं circumventing जबकि प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) कोशिकाओं (ते) कोशिकाओं को भ्रूण स्टेम रूप में असीमित replicative क्षमता और pluripotency की एक ही सुविधाओं दिखा रहे हैं. इसके अलावा, रोगी व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं बहुत सफल चिकित्सीय अनुप्रयोगों 2-3 की संभावना बढ़ रही है, एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रोत्साहित नहीं करेंगे. विशिष्ट संस्कृति शर्तों के तहत, आईपीएस कोशिकाओं cardiomyocytes, न्यूरॉन्स, अग्नाशय बीटा कोशिकाओं, hepatocytes, और रेटिना वर्णक उपकला (आरपी ​​सहित इन विट्रो में कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं में अंतर दिखाया गया हैई) 4-12.

RPE उत्पादन के लिए एक विशेष तरह के फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों के आवारा प्रकाश, phagocytosis के अवशोषण के रूप में दृश्य स्वास्थ्य और समारोह के लिए आवश्यक हैं कि कई कार्य करता है कि रेटिना के पीछे स्थित pigmented उपकला कोशिकाओं की परत, और retinoids के प्रसंस्करण है दृश्य क्रोमोफोर की. ऐसी उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (AMD) Stargardt रोग, और रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आर) के रूप में अंतर्निहित RPE विकृति का परिणाम हैं कि चकाचौंध रोगों से सबूत के रूप में होने के कारण क्षति या बीमारी के लिए RPE की शिथिलता गहराई से फोटोरिसेप्टर स्वास्थ्य और दृश्य समारोह को प्रभावित करता है 13. दृष्टि बहाल कर सकते हैं कि वास्तव में प्रभावी उपचार हासिल नहीं किया गया है, और स्वस्थ RPE साथ रोगग्रस्त RPE के प्रतिस्थापन दृष्टि 14-15 के नुकसान को रोकने के लिए सबसे अच्छा विकल्प हो सकता है. आईपीएस (आईपीएस) RPE से व्युत्पन्न RPE क्षतिग्रस्त RPE को बदलने के लिए कोशिकाओं का एक संभावित स्रोत है. आईपीएस RPE characteris व्यक्त करता हैटिक RPE प्रोटीन LRAT, CRALBP, PEDF, और RPE65; शास्त्रीय अत्यधिक pigmented हेक्सागोनल RPE आकारिकी प्रदर्शित करता है; सीआईएस रेटिना 5,16 - और इस तरह phagocytosis, retinoid प्रसंस्करण, और 11 के स्राव के रूप में RPE कार्य करता है. आईपीएस RPE therapeutically इस्तेमाल किया जा सकता है हालांकि, इससे पहले, आईपीएस RPE अच्छी तरह से विशेषता किया जाना चाहिए. RPE भेदभाव को नियंत्रित करने वाले कारकों को समझना नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा कोशिकाओं की उपज और पवित्रता में सुधार करने के लिए आवश्यक है.

सेल भेदभाव उच्च विनियमित जीन अभिव्यक्ति का परिणाम है. प्रतिलेखन कारक के जीनोम और समन्वय के epigenetic remodeling भेदभाव और विकास 17 के दौरान होने वाले सेल भाग्य के फैसले के लिए आवश्यक हैं. MicroRNA (miRNA) द्वारा संदेश शाही सेना (mRNA) अनुवाद का विनियमन सेल भाग्य 1 को प्रभावित करता है कि विनियमन का एक और स्तर प्रस्तुत करता है. MiRNAs कम कर रहे हैं, ~ 22 NT, nucleotides की लंबाई कि दबाने अनुवाद के द्वारा या तोmRNA की 3 'UTR के लिए बाध्य या गिरावट के लिए mRNA लक्ष्य. MiRNAs लगभग सभी ऊतकों में पाया गया है और आज तक 2,000 से अधिक अद्वितीय मानव microRNAs miRBase डेटाबेस में पंजीकृत किया गया है. यानी एक ही mRNA कई अलग miRNAs द्वारा लक्षित किया जा सकता है; miRNAs लक्ष्य mRNA करने के लिए बाध्य करने के लिए केवल आंशिक पूरकता की आवश्यकता के बाद से, एक भी miRNA संभावित दसियों या लक्ष्य के सैकड़ों, और इसके विपरीत करने के लिए बाध्य कर सकते हैं. यह अनेक बंधन विशेषता नाटकीय रूप से नियमन की जटिलता के स्तर के साथ ही व्यक्ति miRNAs के कार्यों का निर्धारण करने की कठिनाई के स्तर और भूमिका सेलुलर कार्यों 18-21 में प्रत्येक नाटकों बढ़ जाती है. फिर भी, पढ़ाई miRNA डीएनए मेथिलिकरण स्थिति 17 को प्रभावित करने से भेदभाव के दौरान जीन अभिव्यक्ति को परिष्कृत दिखाया है. RPE को अधिक विशिष्ट एक अध्ययन में, miR-204/211 RPE 22 की उपकला फेनोटाइप बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया था. एक अन्य समूह miRNA प्रोफाइल का विश्लेषणRPE के ES कोशिकाओं से भेदभाव के दौरान और miRNA के अलग सेट से पता चला भेदभाव प्रक्रिया 23 के दौरान व्यक्त कर रहे हैं. वास्तव में, miRNA प्रोफाइल के असंदिग्ध रूप ES कोशिकाओं, अग्रदूत साबित कोशिकाओं, और टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं 24,25 सहित सेल प्रकार भेद कर सकते हैं. 250 से अधिक miRNAs रेटिना में व्यक्त कर रहे हैं. इन अध्ययनों के आधार पर, हम miRNAs आईपीएस से RPE के भेदभाव के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा परिकल्पना है कि.

इस रिपोर्ट का उद्देश्य IMR90-4 आईपीएस से RPE के भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए है कोशिकाओं, माइक्रोएरे द्वारा विश्लेषण के लिए शाही सेना का संग्रह है, और विभिन्न प्रकार से तीन प्रकार की कोशिकाओं के बीच व्यक्त कर रहे हैं कि miRNAs, आईपीएस कोशिकाओं की पहचान करने के लिए माइक्रोएरे डेटा का विश्लेषण , आईपीएस RPE और भ्रूण RPE. कुल शाही सेना प्रत्येक कोशिका प्रकार की संस्कृतियों से निकाली गई और 1,205 मानव miRNAs और 144 वायरल miRNAs के लिए विशेष जांच युक्त, एक miRNA माइक्रोएरे संकरित किया गया था. माइक्रोएरे परिणामों की तुलना गयाmiRNAs विभिन्न विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच व्यक्त कर रहे थे, जो निर्धारित करने के लिए डी. 2 गुना या अभिव्यक्ति में अधिक से अधिक गुना परिवर्तन के साथ miRNAs आगे के विश्लेषण के लिए चयन किया गया था. एक miRNA विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम विभिन्न व्यक्त miRNAs के संभावित ठिकानों की पहचान करने के लिए और चयनित miRNAs द्वारा विनियमित सेलुलर नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

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Protocol

संस्कृति अभिकर्मकों और संस्कृति प्लेटों के 1. तैयारी

  1. mTeSR1 मीडिया: निर्माता के निर्देशों के अनुसार mTeSR1 मीडिया तैयार करें. रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर mTeSR1 5x पूरक की 100 मिलीलीटर पिघलना MTeSR1 बेसल मीडिया के 400 मिलीलीटर के लिए mTeSR1 5x पूरक की 100 मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. यह मीडिया के लिए 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है.
  2. भेदभाव मीडिया: 10 माइक्रोग्राम / एमएल gentamicin 0.1mm β-mercaptoethanol, 0.1 मिमी nonessential अमीनो एसिड, 2.0 मिमी एल glutamine, 10% पीटा सीरम, और उपज के लिए DMEM/F12 में भेदभाव मीडिया तैयार करें.
  3. आईपीएस RPE मीडिया: 1x एन 1 पूरक, 0.1 मिमी nonessential अमीनो एसिड, 250 माइक्रोग्राम / एमएल बैल की तरह, 13 एनजी / एमएल triiodo एल thyronine सोडियम नमक, 20 एनजी / एमएल hydrocortisone, 5 ग्राम उपज के लिए सदस्य में आईपीएस RPE मीडिया की तैयारी / एमएल gentamicin, और 15% FBS 26.
  4. Triiodo एल thyronine सोडियम नमक शेयर समाधान. शेयर समाधान तैयार करने के लिए triiodo एल thyronine की 1.0 मिलीग्राम भंगधीरे घूमता द्वारा 1 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड में सोडियम नमक. अगला triiodo एल thyronine सोडियम नमक की 20 ग्राम / एमएल के 50.0 मिलीलीटर बनाने के लिए आधार मीडिया की 49.0 मिलीलीटर जोड़ें. Aliquots तैयार है और जब तक जरूरत -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर. अंतिम संस्कृति मीडिया में वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए उचित मात्रा का प्रयोग करें.
  5. Hydrocortisone शेयर समाधान:, एक hydrocortisone शेयर समाधान तैयार कोमल आंदोलन से निरपेक्ष इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में hydrocortisone के 1 मिलीग्राम solubilize लिए. अगले 50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर से 20 मिलीलीटर hydrocortisone शेयर समाधान के लिए आधार मीडिया की 19.0 मिलीलीटर जोड़ें. -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और फ्रीज की जरूरत तक. अंतिम संस्कृति मीडिया में वांछित एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए उचित मात्रा का प्रयोग करें.
  6. भ्रूण RPE मध्यम विकास. FBS के लिए छोड़कर निर्माता के निर्देशों के अनुसार, बेसल मीडिया में RTEGM किट में सभी अभिकर्मकों मिश्रण से विकास मीडिया तैयार करें.
  7. भ्रूण RPE चढ़ाना मीडिया. एक बाँझ कंटेनर और एक के लिए विकास मीडिया की एक छोटी राशि के हस्तांतरण से चढ़ाना मीडिया की तैयारी2% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए डीडी FBS.
  8. Dispase: DMEM/F12 में 1 मिलीग्राम / एमएल की dispase का काम कर समाधान तैयार करें.
  9. Matrigel लेपित प्लेट: 0.08 मिलीग्राम / एमएल DMEM/F12 में Matrigel तैयार करें.
  10. कोट प्रत्येक Matrigel समाधान के 1.0 मिलीलीटर के साथ 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से.
  11. 1.0 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर लेपित प्लेटें सेते हैं.
  12. 1.0 घंटे ऊष्मायन के बाद, अतिरिक्त DMEM/F12 aspirate.
  13. सुखाने से बचने के लिए mTeSR1 मीडिया की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें. Matrigel लेपित प्लेटें अब इस्तेमाल के लिए तैयार हैं.

2. आईपीएस संस्कृति

  1. आईपीएस सेल बोने से पहले सभी ट्यूबों, कमरे के तापमान को गर्म mTESR1 मीडिया, और तैयार Matrigel लेपित प्लेटें है.
  2. जल्दी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में IMR90-4 आईपीएस कोशिकाओं पिघलना. फिर पानी के स्नान से cryovial निकालें और 70% इथेनॉल का उपयोग बाँझ.
  3. सेल समुच्चय के टूटने को कम से कम एक 2 एमएल पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण.
  4. ड्रॉप वार वा के 5 मिलीलीटर जोड़ेंआरएम धीरे mTeSR1 कोशिकाओं को मीडिया और मिश्रण. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  5. ध्यान mTeSR1 मीडिया के 2 मिलीलीटर में सेल समुच्चय resuspend और एक छह अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह पर कोशिकाओं बीज.
  6. 5% सीओ 2, 95% आर्द्रता के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर और संस्कृति में थाली प्लेस.
  7. दैनिक आईपीएस सेल संस्कृति मीडिया बदलें. Undifferentiated कालोनियों 5-7 दिनों बोने के बाद दिखाई देगा. पारित होने (एक घने केंद्र के साथ कालोनियों) के लिए तैयार कर रहे हैं कि undifferentiated कालोनियों के लिए जाँच करें.

आईपीएस कोशिकाओं के 3. Passaging

  1. पिछले पारित होने के लिए शुरुआत करने के लिए आईपीएस कोशिकाओं, सभी ट्यूबों, dispase समाधान, DMEM/F12 और mTERS1 मीडिया के कमरे के तापमान पर गरम किया है, और Matrigel प्लेटें तैयार लेपित.
  2. आईपीएस कोशिकाओं passaging से पहले इस क्षेत्र को स्क्रैप और मीडिया aspirating द्वारा भेदभाव के किसी भी क्षेत्र को हटा दें. भेदभाव उच्च के लिए अच्छी तरह से 20% से नीचे रहना चाहिएगुणवत्ता संस्कृतियों. ध्यान आईपीएस कोशिका युक्त अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर DMEM/F12 कुल्ला और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल dispase के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. 7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. Dispase Aspirate और धीरे दो बार DMEM/F12 के 2 मिलीलीटर के साथ सेल कालोनियों कुल्ला.
  4. Rinsing के बाद, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए mTSER1 के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
  5. एक 5 एमएल पिपेट का उपयोग धीरे समुच्चय के रूप में करने के लिए थाली की कालोनियों परिमार्जन.
  6. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को अलग कालोनियों स्थानांतरण. कोशिकाओं के अगले बीतने के बीज के लिए पर्याप्त mTeSR1 मीडिया जोड़ें.

आईपीएस RPE को आईपीएस कोशिकाओं के 4. भेदभाव

  1. MTESR1 मीडिया में एक नव लेपित प्लेट पर आईपीएस कोशिकाओं प्लेट.
  2. आईपीएस कोशिका कालोनियों संस्कृति में 4-5 दिनों के लिए विस्तार करने की अनुमति.
  3. 4 मिलीलीटर भेदभाव मीडिया के साथ स्थानापन्न mTeSR1 मीडिया. हर 3 दिनों मीडिया से एक आधा बदलें.
  4. Pigmented foci (40-50 दिन) मैन्युअल संस्कृति से बाहर विच्छेदित किया काफी बड़े विकसित करने की अनुमति.
  5. एक प्रयोग करें200 μl विंदुक टिप के आसपास कटौती और pigmented कालोनियों उठा.
  6. लीजिए और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में विच्छेदित कालोनियों पूल.
  7. तब दो बार 5 मिनट के लिए 300 XG पर जमा RPE कोशिकाओं अपकेंद्रित्र DMEM/F12 के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
  8. 0.25% trypsin EDTA के साथ जमा आईपीएस RPE incubating द्वारा एक एकल कोशिका समाधान तैयार करें.
  9. आईपीएस RPE मीडिया के साथ आईपीएस RPE कोशिकाओं कुल्ला और पर एकत्र कोशिकाओं की थाली एक ताजा Matrigel लेपित आईपीएस RPE मीडिया के 4 एमएल में अच्छी तरह से.
  10. संस्कृति से पहले पारित होने के लिए 3 सप्ताह के लिए कोशिकाओं. हर 3 दिनों मीडिया बदलें. प्रयोग के लिए, थाली आईपीएस RPE / 2 सेमी 100,000 कोशिकाओं पर. 17 दिन पर कोशिकाओं को इकट्ठा. 0 दिवस के रूप में बोने के दिन गिन लो.

5. नमूना संग्रह

  1. आईपीएस कोशिका संग्रह
    1. संस्कृति आईपीएस कोशिकाओं undifferentiated कालोनियों केंद्र में घने होने के लिए मनाया जाता है जब तक.
    2. DMEM/F12 में कालोनियों कुल्ला.
    3. Accutas का उपयोग एकल कक्षों में अलग कर देना ई. 5 मिनट के लिए 300 XG पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं को इकट्ठा. सतह पर तैरनेवाला Aspirate. DMEM/F12 के 2 मिलीलीटर में Resuspend.
  2. भ्रूण RPE संग्रह
    1. DMEM/F12 साथ भ्रूण RPE सेल संस्कृतियों कुल्ला और 0.25% trypsin EDTA का उपयोग एकल कक्षों में अलग कर देना.
    2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा. 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला Aspirate. DMEM/F12 के 2 मिलीलीटर में Resuspend.
  3. आईपीएस RPE सेल संग्रह
    1. आईपीएस RPE बीतने के 3 और पारित होने के 5 तक पहुँचते हैं, पारित होने के बाद 17 दिन पर कोशिकाओं को इकट्ठा. दो बार पीबीएस में आईपीएस RPE कुल्ला और 1.0 मिलीलीटर 0.25% trypsin के साथ ऊष्मायन द्वारा एक एकल कक्ष निलंबन तैयार करते हैं.
    2. बर्फ के ठंडे आईपीएस RPE मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर.
    3. 5 मिनट के लिए 300 XG पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं को इकट्ठा. सतह पर तैरनेवाला Aspirate.
    4. Microbead किट से धुंधला बफर के 3 मिलीलीटर में सेल निलंबन Resuspend.
undifferentiated कोशिकाओं को दूर करने के आईपीएस RPE के> 6 ve_title ". नकारात्मक चयन

  1. उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी अभिकर्मकों रखें, लेकिन बर्फ पर काम नहीं करते. 5 मिनट के लिए 300 XG पर कदम 5.3.4 से सेल निलंबन अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला Aspirate.
  2. 2 x 10 6 कोशिकाओं प्रति microbead किट से धुंधला बफर के 100 μl में Resuspend कोशिकाओं.
  3. 2 x 10 6 कोशिकाओं प्रति विरोधी टीआरए-1-60-पीई एंटीबॉडी के 10 μl जोड़ें.
  4. अच्छी तरह मिक्स और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  5. 2 x 10 6 कोशिकाओं प्रति बफर के 1-2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को धो लें. 300 x जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला Aspirate.
  6. 2 x 10 6 कोशिकाओं प्रति धुंधला बफर के 80 μl में Resuspend कोशिकाओं. 2 x 10 6 कोशिकाओं प्रति विरोधी पीई लेबल microbeads की 20 μl (किट) से जोड़ें. अच्छी तरह से मिलाएं. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते
  7. 2 x 10 6 कोशिकाओं प्रति धुंधला बफर के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें. 300 x जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला Aspirate.
  8. 500 & # में कोशिकाओं Resuspend956; धुंधला बफर के एल.
  9. चुंबकीय सेल जुदाई:
    1. चुंबकीय सेल सॉर्टर में स्तंभ रखें. धुंधला बफर के 3 मिलीलीटर के साथ स्तंभ कुल्ला.
    2. स्तंभ पर 6.8 से सेल निलंबन लागू करें.
    3. टीआरए 1-60 नकारात्मक कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए नकारात्मक बंदरगाह पर एक ट्यूब रखें.

7. कुल शाही सेना निष्कर्षण

  1. Lyse न्यूक्लिक एसिड minipreps के लिए बनाया गया एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microcentrifuge homogenizer मिनी स्पिन स्तंभ के माध्यम से नमूने चलाकर कोशिकाओं.
  2. आईपीएस कोशिकाओं, आईपीएस RPE, और छोटे आरएनए अणुओं 27 की रक्षा के लिए बनाया गया व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शाही सेना निकासी किट के साथ भ्रूण RPE से कुल शाही सेना निकालें.
  3. एक Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कुल शाही सेना सांद्रता निर्धारित करते हैं.

8. Bioanalyzer और माइक्रोएरे परख

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शाही सेना गुणवत्ता किट के साथ संयोजन के रूप में Bioanalyzer के साथ शाही सेना अखंडता की जाँच करें.
  2. 100 एनजी की सेते30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बछड़ा आंतों फॉस्फेट के साथ कुल शाही सेना
  3. 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर 100% DMSO का उपयोग शाही सेना denature.
  4. पीसीपी-Cy3 1 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा टी -4 ligase उपयोग करने के साथ नमूने लेबल.
  5. एक 8_x_15K प्रारूप मानव miRNA सरणी पर संकरण.
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सरणियों धो लें और एक स्कैनर का उपयोग कर 5 माइक्रोन के एक प्रस्ताव पर स्कैन.
  7. MiRNA माइक्रोएरे के साथ संगत माइक्रोएरे सुविधा निष्कर्षण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा मोल.
  8. प्रत्येक नमूने में अभिव्यक्ति की रिश्तेदार स्तर निर्धारित करने के लिए miRNA संकेतों को संसाधित.
  9. नमूना समूहों के बीच प्रत्येक miRNA की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना करें. आगे के विश्लेषण के लिए कम से कम दो गुना अंतर अभिव्यक्ति के साथ miRNAs का चयन करें.
  10. विभिन्न व्यक्त miRNAs 28 के दृश्य के लिए गर्मी नक्शे उत्पन्न करने के लिए निर्देशों का पालन करें, डेटा विश्लेषण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करना.

9. मार्ग विश्लेषण

  1. एक्सेल प्रारूप में 8.9 में चयनित miRNAs से डेटा को बचाओ.
  2. ऑनलाइन आरएनए मार्ग विश्लेषण कार्यक्रम में प्रवेश करें. एक्सेल फाइल अपलोड करें. फ़ाइल स्वरूप के लिए "लचीला प्रारूप" का चयन करें और पहचानकर्ता प्रकार के लिए ड्रॉप डाउन सूची से "Agilent" का चयन करें.
  3. कच्चे डेटा शीर्षक के अंतर्गत, आईडी कॉलम जांच करने के लिए "आईडी" असाइन और "अवलोकन 1" आवंटित करने और प्रवेश राशन स्तंभ को "अनुपात लॉग". अन्य सभी स्तंभों के लिए "उपेक्षा" चुनें.
  4. इस प्रकार के रूप में विश्लेषण के लिए मापदंडों का चयन करें: विश्वास: प्रयोगात्मक ही मनाया; प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से रिश्तों में शामिल हैं; और अंतर्जात रसायन शामिल हैं; संदर्भ सेट के रूप में सरलता नॉलेज बेस चुनें. सभी प्रजातियों से डेटा, सभी सेल लाइनों और ऊतकों, और सभी परिवर्तन भी शामिल है कि संदर्भ अणुओं का डेटाबेस चुनें.
  5. भागो नेटवर्क और मार्ग विश्लेषण करती है.

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Representative Results

आईपीएस कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) आईपीएस RPE कोशिकाओं में भेदभाव उत्पन्न करने के लिए भेदभाव की स्थिति में बड़े हो रहे थे. आईपीएस RPE हेक्सागोनल pigmented सेल आकारिकी भ्रूण RPE (चित्रा 1C) के समान (चित्रा 1 बी) के क्लासिक RPE फेनोटाइप प्रदर्शन किया.

बेहतर miRNA आईपीएस से आईपीएस RPE को भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान निभा सकते हैं कि भूमिका को समझते हैं, miRNA अभिव्यक्ति की माइक्रोएरे विश्लेषण का आयोजन किया गया था. कुल शाही सेना आईपीएस कोशिकाओं को भ्रूण RPE, और छोटे RNAs के अधिक से अधिक प्रतिधारण सुनिश्चित करने के लिए mirVana miRNA अलगाव किट का उपयोग आईपीएस RPE से एकत्र किया गया था. शाही सेना माइक्रोएरे labchip को संकरण से पहले मात्रा निर्धारित और शुद्धता के लिए परीक्षण किया गया था. 1,205 मानव और 144 वायरल miRNAs का प्रतिनिधित्व जांच प्रत्येक नमूना सेट से miRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया. संकेतों प्रत्येक नमूने से प्रत्येक miRNA की अभिव्यक्ति के रिश्तेदार का स्तर निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया गया. डेटा miRNA ई तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था आईपीएस और भ्रूण RPE को आईपीएस RPE की है xpression प्रोफाइल. गर्मी नक्शे समूह (2A चित्रा) के बीच अंतर miRNA अभिव्यक्ति के दृश्य सक्षम उत्पन्न किया गया. विभिन्न आईपीएस में व्यक्त किया गया है कि 83 miRNAs 47 आईपीएस RPE की तुलना में आईपीएस में upregulated miRNAs, और आईपीएस (चित्रा 2 बी) में downregulated 36 के साथ, आईपीएस RPE की तुलना में. 110 miRNAs विभिन्न fRPE में upregulated 61 miRNAs साथ, आईपीएस RPE की तुलना में भ्रूण RPE में व्यक्त, और 49 आईपीएस RPE (चित्रा -2) की तुलना में fRPE में downregulated थे. सरलता आईपीए सॉफ्टवेयर के साथ मार्ग विश्लेषण सेलुलर विकास, विकास, प्रसार और अस्तित्व, सेल चक्र, और सेलुलर आंदोलन में शामिल जीनों के लिए विभिन्न व्यक्त miRNAs लक्ष्य टेप संकेत दिया. MiRNAs विवो में नेत्र ऊतकों में व्यक्त आईपीएस (आंकड़े 3 और 4) की तुलना में आईपीएस RPE और भ्रूण RPE में समृद्ध होने के पाए गए.

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चित्रा 1. आईपीएस, भ्रूण RPE, और आईपीएस RPE के Brightfield छवियों. पूर्व भेदभाव, भ्रूण RPE, और आईपीएस से व्युत्पन्न RPE को आईपीएस कोशिकाओं की Brightfield छवियों (100x). भ्रूण RPE और आईपीएस RPE दोनों हेक्सागोनल आकार और रंजकता के शास्त्रीय RPE आकारिकी प्रदर्शित करते हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
आईपीएस RPE से चित्रा 2. MiRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल आईपीएस और भ्रूण RPE की तुलना में. ए) हीट नक्शे miRNAs के अंतर अभिव्यक्ति के रिश्तेदार डिग्री को दर्शाती है. रंगपैमाने (लाल) के रूप में ऊपर, नीचे miRNA (हरा) की अभिव्यक्ति के स्तर का प्रतिनिधित्व करता है, या आईपीएस कोशिकाओं की. सी) की तुलना करने के आईपीएस RPE के miRNA प्रोफाइल के सभी नमूनों में अभिव्यक्ति स्तर (काला) मतलब. बी पर) तुलना भ्रूण RPE को आईपीएस RPE के miRNA प्रोफाइल. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
आईपीएस व्युत्पन्न RPE बनाम पैतृक आईपीएस कोशिकाओं की miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल के चित्रा 3. ए) नेटवर्क विश्लेषण. शीर्ष 4 नेटवर्क को अलग से दिखाया (बाएं) और (बीच में) विभिन्न व्यक्त miRNAs की. बी) मार्ग विश्लेषण विलय कर रहे हैं. मिसालएएसई इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
आईपीएस व्युत्पन्न RPE बनाम भ्रूण RPE के miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल की चित्रा 4. ए) नेटवर्क विश्लेषण. शीर्ष 7 नेटवर्क को अलग से दिखाया (बाएं) और विभिन्न व्यक्त miRNAs की. बी) मार्ग विश्लेषण (बीच में) विलय कर रहे हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

अंत में, इस रिपोर्ट संस्कृति आईपीएस कोशिकाओं तरीकों का इस्तेमाल किया, आईपीएस RPE, और भ्रूण RPE का वर्णन करता है. आईपीएस से व्युत्पन्न RPE आकृति विज्ञान और कार्यात्मक भ्रूण RPE के समान हैं. आईपीएस RPE भी RPE65, CRALBP, PEDF, और LRAT 16 सहित विशेषता RPE जीन व्यक्त करता है. आगे इन कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए, शाही सेना निकाली और विभिन्न व्यक्त miRNA की पहचान करने के लिए माइक्रोएरे विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. संकेत तीव्रता का विश्लेषण विभिन्न व्यक्त miRNAs की सबसे बड़ी संख्या आईपीएस RPE अधिक परिपक्व हो सकता है, सुझाव आईपीएस RPE तुलना बनाम भ्रूण RPE में पता चला था कि पता चला. भविष्य के अध्ययन RT-पीसीआर के साथ इन परिणामों को मान्य करने की योजना बनाई है.

ध्यान से सटीक डाटा की परख और अधिग्रहण की सफलता सुनिश्चित करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए कि इस प्रयोग के दौरान कई महत्वपूर्ण बातें हैं. पहला महत्वपूर्ण कदम आईपीएस कोशिकाओं की संस्कृति के दौरान होता है. आईपीएस कोशिकाओं एक plu में ही रहना चाहिएउनके stemness बनाए रखने के लिए राज्य ripotent. कोशिकाओं ध्यान से भेदभाव के संकेत के लिए दैनिक निरीक्षण किया जाना चाहिए. Undifferentiated आईपीएस कोशिकाओं कॉम्पैक्ट बहुकोशिकीय कालोनियों के रूप में विकसित. कोशिकाओं के cytoplasm अनुपात और प्रमुख nucleoli के लिए एक उच्च परमाणु होनी चाहिए. आईपीएस कालोनियों केंद्र में कोशिकाओं की कई परतों के साथ, एक अलग सीमा की विशेषता है. भेदभाव के लक्षण परिभाषित कॉलोनी सीमाओं, गैर वर्दी सेल आकारिकी, और इस तरह के न्यूरॉन्स और fibroblasts के रूप में स्पष्ट प्रकार की कोशिकाओं की उपस्थिति का नुकसान शामिल है. भेदभाव किया है कि एकल कक्षों dispase और rinsing द्वारा हटाया जा सकता है, हालांकि, इन विशेषताओं के साथ कालोनियों को मैन्युअल संस्कृति 29 से हटाया जाना चाहिए.

माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए शाही सेना की तैयारी अगले महत्वपूर्ण कदम है. असंगत शाही सेना गुणवत्ता माइक्रोएरे डेटा में परिवर्तनशीलता का एक महत्वपूर्ण स्रोत है. शाही सेना निकासी उच्च आणविक वजन और अच्छे परिणाम के लिए न्यूनतम अपमानित शाही सेना उपज चाहिए. सफलशाही सेना निकासी कम से कम गिरावट और किसी भी contaminating RNases से मुक्त साथ कुल शाही सेना निकलेगा. 260 एनएम स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा शाही सेना एकाग्रता के निर्धारण के बाद, नमूना की शुद्धता polysaccharides या प्रोटीन के साथ संदूषण का पता लगाने के लिए 230 और 280 एनएम पर निर्धारित किया जाना चाहिए. शाही सेना के लिए 230:260:280 अनुपात कोई संदूषण 30 के साथ उच्च गुणवत्ता शाही सेना से संकेत मिलता है 01:02:01 होना चाहिए.

माइक्रोएरे प्रयोग की योजना बना रहा है, सबसे महत्वपूर्ण कदम जांच करने के संकरण विशिष्ट है यह सुनिश्चित करने के लिए, और पता लगाया संकेत है कि नमूना सेट के लिए मान्य हैं यह सुनिश्चित करने के लिए तीन प्रतियों में प्रत्येक नमूने को चलाने के लिए नकारात्मक नियंत्रण का समावेश है. माइक्रोएरे परिणामों के विश्लेषण के दौरान, एक प्रमुख मुद्दा पृष्ठभूमि शोर एक विशेष जांच के लिए सच संकेत तीव्रता देने के लिए मनाया संकेत से घटाया जाता है, जिसमें पृष्ठभूमि सुधार है. सच सकारात्मक संकेतों पर प्रकाश डाला, जबकि इस कदम, झूठी सकारात्मक समाप्त होगा. </ P>

अंत में, नेटवर्क और माइक्रोएरे परिणाम का मार्ग विश्लेषण के दौरान, सबसे महत्वपूर्ण कदम विश्लेषण चलाने से पहले सही मापदंडों और फिल्टर स्थापित करने के लिए है. यह कदम नेटवर्क पैदा करते हैं और विभिन्न तुलना में व्यक्त किया जा दिखाया गया miRNAs से प्रभावित कर रहे हैं कि सेलुलर रास्ते की पहचान करने के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा उपयोग किया जाएगा जो डेटाबेस का निर्धारण करेगा.

इस रिपोर्ट में वर्णित तरीकों का उपयोग कर डेटा के अधिग्रहण के बाद, यह परिणामों की व्याख्या के दौरान इन assays की सीमाओं पर विचार करना आवश्यक है. संभावना नहीं है, यह RPE संस्कृति RPE कोशिकाओं का एक समरूप आबादी नहीं है कि संभव बना रहता है. विरोधी टीआरए 1-60 छँटाई प्रक्रिया अभी भी सेल मार्कर स्टेम व्यक्त कि कोशिकाओं को हटा एक नकारात्मक चयन प्रक्रिया है; हालांकि यह शेष कोशिकाओं को शुद्ध RPE कोशिकाओं रहे हैं गारंटी नहीं है. आकृति विज्ञान कोशिकाओं रंजकता एक की क्लासिक RPE आकारिकी प्रदर्शन हालांकिएन डी polygonal सेल आकार, यह नहीं है कि सभी कोशिकाओं RPE हैं कि संभव है.

माइक्रोएरे प्रयोगों के कारण बहुत ही कम दृश्यों के लिए विशेष रूप से microRNA के मामले में, शाही सेना की अभिव्यक्ति के लिए झूठी सकारात्मक उत्पादन हो सकता है. इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल माइक्रोएरे प्रणाली प्रत्येक लक्ष्य के विभिन्न क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए कई जांच शामिल है, परिणाम हमेशा QRT-पीसीआर द्वारा मान्य किया जाना चाहिए.

सरलता आईपीए द्वारा माइक्रोएरे डेटा का विश्लेषण सरलता डेटाबेस में मात्रा और जानकारी की गुणवत्ता पर निर्भर है. जीन समारोह और सेलुलर रास्ते पर जानकारी के बहुत बदल सेल लाइनों पर या कैंसर अनुसंधान के संदर्भ में किए गए प्रयोगों से प्राप्त होता है. इसलिए, इस कार्यक्रम का उपयोग मार्ग और नेटवर्क विश्लेषण के परिणाम हमेशा प्राथमिक कोशिकाओं के लिए प्रासंगिक नहीं हो सकता है या, इस मामले में, स्टेम सेल.

इन सीमाओं के बावजूद, इस रिपोर्ट में वर्णित विधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैआईपीएस कोशिकाओं और भ्रूण RPE, आईपीएस कोशिकाओं से पाने RPE, और miRNA के माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए शाही सेना की निकासी की संस्कृति. इन assays द्वारा उत्पन्न डेटा भेदभाव प्रक्रिया में शामिल miRNAs की पहचान है, साथ ही RPE कार्यों को विनियमित कि उन लोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

अधिक miRNAs विभिन्न आईपीएस RPE तुलना बनाम आईपीएस की तुलना में आईपीएस RPE तुलना बनाम भ्रूण RPE में व्यक्त किया जा पाए गए हैं, इस के लिए कई संभावित कारण हैं. सबसे पहले, इस परख प्रदर्शन किया गया था उस समय, miRNA माइक्रोएरे मंच 1,205 मानव और 144 वायरल miRNAs पता लगाने में सक्षम था. उस समय से, मंच 2,000 से अधिक मानव miRNAs के लिए जांच में शामिल करने के लिए विस्तारित किया गया है. यह अधिक miRNAs पता चला रहे हैं miRNA अंतर अभिव्यक्ति प्रोफाइल बदल जाएगा कि निश्चित रूप से संभव है. इस परख से पता चला 1,349 miRNAs की, miRNAs की सबसे प्रकार की कोशिकाओं (आंकड़े 2 बी और -2 सी के बीच अभिव्यक्ति में कोई अंतर नहीं दिखाया

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यहाँ निहित राय या दावे लेखकों के निजी विचार हैं और अधिकारी के रूप में या सेना के विभाग या रक्षा विभाग के विचारों को दर्शाती के रूप में लगाया जा नहीं रहे हैं.

लेखकों व्हिटनी ए ग्रीन, अल्बर्टो Muñiz, और रमेश आर Kaini USAISR पर एक राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद Postdoctoral रिसर्च एसोसिएटशिप आयोजित करते हुए इस शोध का प्रदर्शन किया गया था.

माइक्रोएरे assays Greehey बच्चों के कैंसर रिसर्च इंस्टीट्यूट माइक्रोएरे कोर सुविधा और केन्द्र शासित प्रदेशों के स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र सैन एंटोनियो में जैव सूचना विभाग द्वारा प्रदर्शन किया गया.

यह काम अमेरिकी सेना क्लीनिकल पुनर्वास चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम (CRMRP) और सैन्य संचालन चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम (MOMRP) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5X supplement Stem Cell Technologies 5850
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-β-mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-l-thyronine sodium salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Fetal RPE media RTEGM kit Life Technologies 195406
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Trypsin Hyclone(Fisher) 25200-072
Miltenyi Biotec washing buffer StemGent 130-092-987
Miltenyi Biotec rinsing buffer StemGent 130-092-222
Anti-TRA-1-60 microbead kit StemGent 130-095-816
Miltenyi Biotec cell sorter column StemGent 130-021-101
RNeasy micro kit Qiagen 74004
QIA shredder Qiagen 79654
RNA 6000 Pico LabChip kit Agilent G2938-90046
Human miRNA microarray v16 Agilent G4471A

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References

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