MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell'epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell'epitelio pigmentato retinico

Biology

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Summary

I microRNA (miRNA) profili di staminali umane pluripotenti indotte-(iPS), cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivati ​​da umana indotta staminali pluripotenti (iPS) (iPS-RPE), e RPE fetale, sono stati confrontati.

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Greene, W. A., Muñiz, A., Plamper, M. L., Kaini, R. R., Wang, H. C. MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (88), e51589, doi:10.3791/51589 (2014).

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Abstract

L'obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per confrontare il microRNA (miRNA) profili di umana indotta staminali pluripotenti (iPS), dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivato da cellule iPS umane (iPS-RPE), e RPE fetale. I protocolli includono raccolta di RNA per l'analisi mediante microarray e l'analisi dei dati di microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi tra i tre tipi di cellule. I metodi per la coltura di cellule iPS e RPE fetale sono spiegati. Il protocollo utilizzato per la differenziazione di RPE da IP umano è anche descritto. La tecnica di estrazione dell'RNA descriviamo stato selezionato per consentire il recupero massimo molto piccolo RNA per l'uso in un microarray miRNA. Infine, via cellulare e analisi della rete dei dati di microarray è spiegato. Queste tecniche facilitare il confronto dei profili miRNA di tre differenti tipi cellulari.

Introduction

Le cellule staminali hanno la capacità di replicarsi senza limiti e il potenziale di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica. Lo sviluppo di tecniche per riprogrammare cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti ha suscitato grande entusiasmo nella comunità della ricerca e tra i medici, come l'avvento di rigenerazione del tessuto personalizzato è all'orizzonte 1. Induced-staminali pluripotenti (iPS) presentano le stesse caratteristiche di illimitato potenziale replicativo e pluripotenza come staminali embrionali (ES), le cellule che aggirano i dilemmi etici associati con i CES. Inoltre, le cellule staminali del paziente non stimolare una risposta immunitaria, aumentando notevolmente la probabilità di successo applicazioni terapeutiche 2-3. Sotto specifiche condizioni di coltura, le cellule iPS hanno dimostrato di differenziarsi in diversi tipi cellulari in vitro, compresi cardiomiociti, neuroni, cellule beta pancreatiche, epatociti e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) 4-12.

La RPE è uno strato specializzato di cellule epiteliali pigmentate situati nella parte posteriore della retina che svolge diverse funzioni che sono essenziali per la salute visiva e funzione come assorbimento della luce diffusa, fagocitosi dei segmenti esterni dei fotorecettori, e l'elaborazione di retinoidi per la produzione di chromophore visiva. Disfunzione del RPE causa di danni o malattia colpisce profondamente la salute dei fotorecettori e la funzione visiva come testimoniano le malattie accecante che sono il risultato della sottostante patologia RPE come la degenerazione maculare legata all'età (AMD), la malattia di Stargardt, e retinite pigmentosa (RP) 13. Trattamenti veramente efficaci che possono ripristinare la visione non sono stati raggiunti, e la sostituzione di RPE malato con sano RPE può essere l'opzione migliore per prevenire la perdita della visione 14-15. RPE derivate da iPS (iPS-RPE) è una possibile fonte di cellule per sostituire il RPE danneggiato. iPS-RPE esprime caratteristiproteine ​​RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF e RPE65; visualizza la classica altamente pigmentato esagonale RPE morfologia; e svolge funzioni RPE come la fagocitosi, l'elaborazione retinoidi, e la secrezione di 11 - cis 5,16 retinica. Tuttavia, prima di iPS-RPE può essere utilizzato terapeuticamente, IPS-RPE deve essere accuratamente caratterizzato. Comprensione dei fattori che regolano la differenziazione RPE è necessario per migliorare la resa e la purezza delle cellule da utilizzare per applicazioni cliniche.

La differenziazione cellulare è il risultato dell'espressione genica altamente regolato. Rimodellamento epigenetico del genoma e del coordinamento dei fattori di trascrizione sono necessari per le decisioni destino delle cellule che si verificano durante la differenziazione e lo sviluppo 17. Regolamento del messaggio RNA messaggero (mRNA), traduzione di microRNA (miRNA) presenta ancora un altro livello di regolamentazione che riguarda il destino delle cellule 1. MiRNAs sono brevi, ~ 22 nt, lunghezze di nucleotidi che sia la traduzione di soppressione dalegame al 3 'UTR del mRNA bersaglio o l'mRNA per degradazione. MiRNAs sono stati rilevati in quasi tutti i tessuti e ad oggi oltre 2.000 microRNA umani unici sono stati registrati nel database miRBase. Poiché miRNA richiedono complementarità soltanto parziale di legarsi al mRNA bersaglio, un singolo miRNA può potenzialmente legarsi a decine o centinaia di bersagli, e viceversa, cioè un singolo mRNA può essere bersaglio di diversi miRNA diversi. Questa caratteristica vincolante promiscua aumenta notevolmente il livello di complessità della regolamentazione, così come il livello di difficoltà di determinare le funzioni dei singoli miRNA e il ruolo ognuno gioca in funzioni cellulari 18-21. Tuttavia, studi hanno dimostrato che miRNA raffina genica durante il differenziamento influenzando stato di metilazione del DNA 17. In uno studio più specifico al RPE, miR-204/211 ha dimostrato di promuovere il fenotipo epiteliale della RPE 22. Un altro gruppo ha analizzato il profilo di miRNAdi RPE durante il differenziamento di cellule ES e ha rivelato insiemi distinti di miRNA sono espressi durante il processo di differenziazione 23. In realtà, i profili miRNA possono distinguere in modo inequivocabile tipi cellulari, comprese le cellule staminali, cellule precursori e cellule terminalmente differenziate 24,25. Oltre 250 miRNA sono espressi nella retina. Sulla base di questi studi, ipotizziamo che i microRNA svolgono un ruolo importante durante la differenziazione di RPE da iPS.

L'obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per il differenziamento di RPE da IMR90-4 cellule iPS, la raccolta di RNA per l'analisi mediante microarray e l'analisi dei dati di microarray per identificare miRNA che sono differenzialmente espressi fra tre tipi di cellule, le cellule iPS , iPS-RPE e RPE fetale. L'RNA totale è stato estratto da colture di ogni tipo di cellula e ibridato a un microarray miRNA, contenente sonde specifiche per il 1205 miRNA umani e 144 miRNA virali. I risultati microarray sono stati confrontanod per determinare quali miRNA sono differenzialmente espressi tra i diversi tipi cellulari. miRNA con 2 volte o più fold change in espressione sono stati selezionati per ulteriore analisi. Un programma software di analisi miRNA è stato usato per identificare potenziali target dei miRNA differenzialmente espressi e generare reti cellulari regolati dai miRNA selezionati.

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Protocol

1. Preparazione della Cultura Reagenti e piastre di coltura

  1. mTeSR1 Media: Preparare il supporto mTeSR1 secondo le istruzioni del produttore. Scongelare 100 ml di mTeSR1 5x supplemento notte a 4 ° C. Aggiungere 100 ml di mTeSR1 5x complemento a 400 ml di mTeSR1 terreni di base e mescolare bene. Questo supporto è stabile a 4 ° C per 2 settimane ed a -20 ° C per 6 mesi.
  2. Differenziazione dei media: Preparare il supporto differenziazione DMEM/F12 per produrre 0.1mm β-mercaptoetanolo, 0,1 mm aminoacidi non essenziali, 2.0 mM L-glutammina, siero knockout del 10%, e 10 mg / ml di gentamicina.
  3. iPS-RPE supporto: preparare iPS-RPE media in MEM cedere supplemento 1x N1, 0,1 mm aminoacidi non essenziali, 250 mg / ml taurina, 13 ng / ml sale di sodio triiodo-L-thyronine, 20 ng / ml idrocortisone, 5 mcg / ml gentamicina, e 15% FBS 26.
  4. Soluzione madre sale sodico triiodo-L-thyronine. Per preparare soluzione madre sciogliere 1,0 mg di triiodo-L-thyroninesale di sodio in 1 N di idrossido di sodio agitando delicatamente. Successivamente aggiungere 49,0 ml di mezzi di comunicazione di base per rendere 50,0 ml di 20 mg / ml di sale di sodio triiodo-L-thyronine. Preparare aliquote e congelare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Utilizzare volume adeguato per raggiungere la concentrazione desiderata in mezzi di coltura finale.
  5. Idrocortisone soluzione madre: Per preparare una soluzione madre idrocortisone, solubilizzare 1 mg di idrocortisone in 1 ml di etanolo assoluto agitando. Successivamente aggiungere 19,0 ml di mezzi di comunicazione di base per la soluzione di 20 ml di idrocortisone magazzino di 50 mg / ml. Aliquotare e congelare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Utilizzare volume adeguato per raggiungere la concentrazione desiderata in mezzi di coltura finale.
  6. Fetale crescita media RPE. Preparare i mezzi di crescita miscelando tutti i reagenti nel kit RTEGM nei media basale, secondo le istruzioni del produttore eccezione del FBS.
  7. Mezzi di placcatura RPE fetale. Preparare terreni in piastra trasferendo una piccola quantità di terreni di crescita in un contenitore sterile eFBS dd ad una concentrazione finale del 2%.
  8. Dispasi: Preparare la soluzione di lavoro del dispasi di 1 mg / ml in DMEM/F12.
  9. Matrigel rivestite con lastre: Preparare Matrigel in DMEM/F12 a 0,08 mg / ml.
  10. Coat ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con 1,0 ml della soluzione di matrigel.
  11. Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente per 1,0 ore.
  12. Dopo l'incubazione 1,0 ore, aspirare il DMEM/F12 eccesso.
  13. Aggiungere 0,5 ml di media mTeSR1 per evitare l'essiccamento. Le piastre Matrigel rivestite sono ora pronti per l'uso.

2. Cultura iPS

  1. Prima della semina delle cellule iPS hanno tutti i tubi, i media caldi mTESR1 a temperatura ambiente, e le piastre Matrigel rivestite pronte.
  2. Scongelare rapidamente le cellule IMR90-4 iPS in un bagno d'acqua a 37 °. Quindi rimuovere il esageratamente dal bagnomaria e sterilizzare utilizzando 70% di etanolo.
  3. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml con una pipetta 2 ml per minimizzare rottura di aggregati cellulari.
  4. Drop-saggio aggiungere 5 ml di warm supporti mTeSR1 alle cellule e delicatamente mescolare. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante.
  5. Risospendere con attenzione gli aggregati di cellule in 2 ml di media mTeSR1 e seminare le cellule su un pozzetto di una piastra ben sei.
  6. Porre la piastra in un incubatore e la cultura 37 ° con il 5% di CO 2, 95% di umidità.
  7. Cambiare la coltura delle cellule iPS quotidiana. Colonie indifferenziati appariranno 5-7 giorni dopo la semina. Verificare la presenza di colonie indifferenziati che sono pronti per il passaggio (colonie con un centro denso).

3. Passaging di cellule iPS

  1. Prima di iniziare a passaggio le cellule iPS, hanno tutte le provette, soluzione dispasi, DMEM/F12 e mTERS1 supporti riscaldata a temperatura ambiente, e la Matrigel rivestite piastre pronta.
  2. Prima passaging cellule iPS, rimuovere le aree di differenziazione raschiando l'area e aspirare il media. Differenziazione dovrebbe rimanere inferiore al 20% del pozzo per altacolture di qualità. Sciacquare accuratamente la cella contenente bene con 2 ml DMEM/F12 iPS e aggiungere 1 ml di 1 mg / ml dispasi a ciascun bene.
  3. Incubare a 37 ° C per 7 minuti. Aspirare il dispasi e lavare delicatamente le colonie di cellule con 2 ml di DMEM/F12 due volte.
  4. Dopo il risciacquo, aggiungere 2 ml di mTSER1 a ciascun pozzetto.
  5. Usando una pipetta da 5 ml raschiare delicatamente le colonie della piastra a formare aggregati.
  6. Trasferire le colonie staccate in una provetta da 15 ml. Aggiungi mezzi mTeSR1 sufficienti per seminare il prossimo passaggio di cellule.

4. Differenziazione delle cellule iPS per iPS-RPE

  1. Piastra le cellule iPS su un piatto rivestito di recente nei media mTESR1.
  2. Lasciare colonie di cellule iPS per espandere per 4-5 giorni di coltura.
  3. Supporti di sostituzione mTeSR1 con i media di 4 ml di differenziazione. Cambiare metà dei mezzi ogni 3 giorni.
  4. Consentire foci pigmentate diventino abbastanza grandi per essere sezionato manualmente della cultura (40-50 giorni).
  5. Utilizzare un200 microlitri pipetta punta a tagliare intorno e sollevare le colonie pigmentate.
  6. Raccogliere e mettere in comune le colonie sezionato in un tubo da 15 ml.
  7. Aggiungere quindi 5 ml di DMEM/F12 alle cellule RPE pool e centrifugare a 300 xg per 5 min due volte.
  8. Preparare una soluzione singola cellula tramite l'incubazione del pool iPS-RPE con il 0,25% tripsina EDTA.
  9. Lavare le cellule iPS-RPE con i media iPS-RPE e piastra le cellule raccolte su un nuovo Matrigel rivestite bene in 4 ml di mezzi iPS-RPE.
  10. Coltivare le cellule per 3 settimane prima di passaggio. Modificare i media ogni 3 giorni. Per l'esperimento, piastra IPS-RPE a 100.000 cellule / cm 2. Raccogliere le cellule il giorno 17. Contare il giorno della semina come giorno 0.

5. Raccolta dei campioni

  1. iPS cellule Collection
    1. Cultura le cellule iPS fino colonie indifferenziati sono osservate per essere denso al centro.
    2. Sciacquare le colonie in DMEM/F12.
    3. Dissociarsi nelle singole cellule utilizzando accutas e. Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospendere in 2 ml di DMEM/F12.
  2. Fetale RPE Collection
    1. Sciacquare colture cellulari fetale RPE con DMEM/F12 e dissociare nelle singole cellule utilizzando 0,25% tripsina EDTA.
    2. Raccogliere le cellule in una provetta da 15 ml. Centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospendere in 2 ml di DMEM/F12.
  3. iPS-RPE cellulare Collection
    1. Quando il iPS-RPE raggiungere passaggio 3 e il passaggio 5, raccogliere le celle Giorno 17 dopo il passaggio. Sciacquare iPS-RPE due volte in PBS e preparare una sospensione singola cella mediante incubazione con 1,0 ml di 0,25% tripsina.
    2. Neutralizzare la tripsina con 2 ml di ghiaccio freddo supporti iPS-RPE.
    3. Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante.
    4. Risospendere la sospensione cellulare in 3 ml di tampone colorazione del kit microbead.
ve_title "> 6. Negativo Selezione del iPS-RPE per rimuovere le cellule indifferenziate

  1. Conservare tutti i reagenti a 4 ° C fino al momento dell'uso, ma non funzionano sul ghiaccio. Sospensione cellulare centrifuga dal punto 5.3.4 a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante.
  2. Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone colorazione del kit microbead a 2 x 10 6 cellule.
  3. Aggiungere 10 ml di anti-TRA-1-60-PE anticorpi per 2 x 10 6 cellule.
  4. Mescolare bene e incubare a 4 ° C per 10 min.
  5. Lavare le cellule in 1-2 ml di tampone per 2 x 10 6 cellule. Centrifugare per 10 min a 300 x g. Aspirare il surnatante.
  6. Risospendere le cellule in 80 ml ​​di tampone di colorazione per 2 x 10 6 cellule. Aggiungere 20 ml di microsfere anti-PE etichettati (dal kit) per 2 x 10 6 cellule. Mescolare bene. Incubare per 15 minuti a 4 ° C.
  7. Aggiungere 1-2 ml di tampone di colorazione per 2 x 10 6 cellule. Centrifugare per 10 min a 300 x g. Aspirare il surnatante.
  8. Risospendere le cellule in 500 & #956; l di tampone di colorazione.
  9. Separazione cellulare magnetico:
    1. Mettere colonna cell sorter magnetico. Risciacquare colonna con 3 ml di tampone di colorazione.
    2. Applicare sospensione cellulare dal 6,8 su colonna.
    3. Collocare un tubo al porto negativo per raccogliere le cellule negative TRA-1-60 anni.

7. RNA totale estrazione

  1. Lisare le cellule eseguendo i campioni attraverso una colonna microcentrifuga omogeneizzatore mini giro disponibile in commercio progettato per minipreps acidi nucleici.
  2. Estrarre l'RNA totale da cellule iPS, iPS-RPE e RPE fetale con il kit di estrazione di RNA disponibile in commercio progettato per preservare piccole molecole di RNA 27.
  3. Determinare le concentrazioni di RNA totale utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop.

8. Bioanalyzer e Microarray Assay

  1. Controllare l'integrità dell'RNA con Bioanalizzatore in combinazione con kit di qualità RNA disponibile in commercio.
  2. Incubare 100 ng diRNA totale con fosfatasi intestinale di vitello a 37 ° C per 30 min
  3. Denaturare l'RNA utilizzando il 100% DMSO a 100 ° C per 5 min.
  4. Etichettare i campioni con PCP-Cy3 utilizzando T4 ligasi tramite incubazione a 16 ° C per 1 ora.
  5. Ibridare su un formato 8_x_15K matrice miRNA umani.
  6. Lavare le matrici secondo le istruzioni del fabbricante e la scansione ad una risoluzione di 5 micron utilizzando uno scanner.
  7. Acquisire i dati usando la funzione microarray software di estrazione compatibili con il microarray miRNA.
  8. Elaborare i segnali miRNA per determinare il livello relativo di espressione in ogni campione.
  9. Confrontare i livelli di espressione di ciascuno miRNA tra i gruppi campione. Selezionare miRNA con espressione differenziale di almeno due volte per ulteriori analisi.
  10. Utilizzo del software disponibile in commercio per l'analisi dei dati, seguire le istruzioni per generare mappe di calore per la visualizzazione dei miRNA differenzialmente espressi 28.

9. Analisi Pathway

  1. Salvare i dati dai miRNA selezionati in 8.9 in formato Excel.
  2. Accedere al programma online di analisi di RNA percorso. Caricare il file di Excel. Selezionare "Format flessibile" per il formato di file e selezionare "Agilent" dal menu a discesa per il tipo identificativo.
  3. Alla voce dati grezzi, assegnare "ID" per sondare colonna ID e assegnare "Osservazione 1" e "rapporto log" alla colonna razione log. Selezionare "ignora" per tutte le altre colonne.
  4. Selezionare i parametri per l'analisi come segue: Fiducia: sperimentalmente osservato solo; comprendere le relazioni dirette e indirette; e comprendono prodotti chimici endogeni; Selezionare il Knowledge base Ingenuity come l'insieme di riferimento. Scegliere il database di molecole di riferimento che include i dati di tutte le specie, tutte le linee di cellule e tessuti, e tutte le mutazioni.
  5. Rete Esegui e percorso di analisi.

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Representative Results

cellule iPS (Figura 1A) sono state coltivate in condizioni di differenziazione di indurre il differenziamento in cellule iPS-RPE. IPS-RPE esposto classico fenotipo RPE di esagonale morfologia cellulare pigmentato (Figura 1B) simile a RPE fetale (Figura 1C).

Per comprendere meglio il ruolo che può svolgere miRNA durante il processo di differenziazione da iPS a iPS-RPE, analisi di microarray di espressione dei miRNA è stata condotta. L'RNA totale è stato raccolto da cellule iPS, RPE fetale, e IPS-RPE utilizzando il kit di isolamento Mirvana miRNA per garantire la conservazione massima di piccoli RNA. L'RNA è stato quantificato e testato per la purezza prima ibridazione al LabChip microarray. Sonde che rappresentano 1.205 umana e 144 miRNA virali sono stati usati per analizzare l'espressione dei miRNA da ciascun set di campioni. I segnali sono stati analizzati per determinare i livelli relativi di espressione di ciascun miRNA da ciascun campione. I dati sono stati utilizzati per confrontare il miRNA e Profilo xpression di iPS-RPE iPS e RPE fetale. Mappe di calore sono stati generati per consentire la visualizzazione di espressione miRNA differenziale tra i gruppi (Figura 2a). 83 miRNA che sono stati differenzialmente espressi nelle iPS rispetto al iPS-RPE, con 47 miRNA upregulated nei iPS rispetto al iPS-RPE, e 36 downregulated nei iPS (Figura 2b). 110 miRNA differenziale sono stati espressi in RPE fetale rispetto ai iPS-RPE, con 61 miRNA upregulated nel fRPE, e 49 inibiti nel fRPE rispetto al iPS-RPE (Figura 2C). Analisi con software Ingenuity Pathway IPA indicato i miRNA differenzialmente espressi trascritti bersaglio per geni coinvolti nello sviluppo cellulare, la crescita, la proliferazione e la sopravvivenza, ciclo cellulare, e il movimento cellulare. MiRNAs espressi nei tessuti oculari in vivo sono stati trovati ad essere arricchito in iPS-RPE e RPE fetale rispetto ai iPS (figure 3 e 4).

t "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 1
Figura 1. Immagini Brightfield di iPS, fetale RPE, e IPS-RPE. Immagini Brightfield (100X) di cellule iPS prima differenziazione, RPE fetale, e RPE derivate da iPS. Sia l'RPE fetale e iPS-RPE visualizzare classica RPE morfologia forma esagonale e la pigmentazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Profilo di espressione di miRNA da iPS-RPE rispetto al iPS e RPE fetale. A) mappe di calore rappresentano il relativo grado di espressione differenziale dei miRNA. Il colorescala rappresenta i livelli di espressione dei miRNA come sopra (rosso), sotto (verde), o al livello medio di espressione (nero) in tutti i campioni. B) Confronto dei profili di miRNA di IPS-RPE cellule iPS. C) Confronto di profili di miRNA di IPS-RPE a RPE fetale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. A) Analisi Rete dei profili di espressione dei miRNA dei genitori cellule iPS contro la RPE iPS-derivato. I primi quattro reti sono indicati separatamente (a sinistra) e la fusione (al centro). B) Analisi Pathway dei miRNA differenzialmente espressi. Please clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. A) Analisi Rete dei profili di espressione dei miRNA di RPE fetale rispetto al RPE iPS-derivato. I primi 7 reti sono indicati separatamente (a sinistra) e fuse (al centro) analisi. B) Percorso dei miRNA differenzialmente espressi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In conclusione, la relazione descrive i metodi utilizzati per la coltura delle cellule iPS, iPS-RPE e RPE fetale. RPE derivate da iPS sono morfologicamente e funzionalmente simile a RPE fetale. IPS-RPE esprime anche caratteristici geni RPE tra cui RPE65, CRALBP, PEDF, e LRAT 16. Per caratterizzare ulteriormente queste cellule, l'RNA è stato estratto e utilizzato per eseguire analisi microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi. Analisi delle intensità di segnale rivelato che è stato rilevato il maggior numero di miRNA differenzialmente espressi nel feto RPE rispetto confronti iPS-RPE, suggerendo la iPS-RPE può essere più maturo. Studi futuri sono previsti per convalidare questi risultati con RT-PCR.

Ci sono diversi punti critici durante questo esperimento che devono essere eseguite con attenzione per assicurare il successo del dosaggio e l'acquisizione di dati accurati. Il primo passo fondamentale si verifica durante la coltura delle cellule iPS. cellule iPS devono rimanere in una pluripotent stato per mantenere la loro staminalità. Le cellule devono essere attentamente controllate ogni giorno per i segni di differenziazione. Cellule iPS indifferenziate crescono come colonie multicellulari compatte. Le cellule devono avere un elevato rapporto nucleare citoplasma e nucleoli prominenti. Le colonie iPS sono caratterizzati da un bordo distinto, con diversi strati di cellule al centro. Segni di differenziazione includono la perdita di confini definiti colonie, morfologia cellulare non uniforme, e la comparsa di tipi di cellule evidenti, come i neuroni e fibroblasti. Singole cellule che si sono differenziate possono essere rimossi dispasi e risciacquo, tuttavia, colonie con queste caratteristiche devono essere rimossi manualmente dalla coltura 29.

Preparazione di RNA per l'analisi microarray è il prossimo passo critico. Incoerente qualità RNA è una significativa fonte di variabilità nei dati di microarray. Estrazione di RNA dovrebbe produrre ad alto peso molecolare e RNA minimamente degradato per i migliori risultati. Di successoEstrazione di RNA produrrà RNA totale con degradazione minima e priva di RNasi contaminanti. Dopo la determinazione della concentrazione di RNA per spettrofotometria a 260 nm, la purezza del campione deve essere determinata a 230 e 280 nm per rivelare la contaminazione con polisaccaridi o proteine. Il rapporto 230:260:280 per RNA deve essere 01:02:01 indicare RNA di alta qualità senza contaminazione 30.

Quando si pianifica l'esperimento microarray, la fase più critica è l'inclusione di controlli negativi per garantire l'ibridazione delle sonde è specifica, e di eseguire ciascun campione in triplicato per assicurare che i segnali rilevati sono validi per quella serie campione. Durante l'analisi dei risultati microarray, un punto chiave è una correzione del fondo, in cui il rumore di fondo è sottratto dal segnale osservato che invia l'intensità del segnale vero per ogni particolare sonda. Questo passaggio eliminare i falsi positivi, evidenziando i veri segnali positivi. </ P>

Infine, durante l'analisi sentiero dei risultati microarray rete e, il passo più importante è quello di stabilire i parametri e filtri corretti prima di eseguire l'analisi. Questo passaggio determinerà quali database sarà utilizzato dal software per generare le reti e individuare percorsi cellulari che sono interessate dai miRNA dimostrato di essere espresso in modo differenziale nei confronti.

Dopo l'acquisizione dei dati utilizzando i metodi descritti in questo rapporto, è necessario considerare le limitazioni di questi saggi durante l'interpretazione dei risultati. Sebbene sia improbabile, rimane la possibilità che la cultura RPE non è una popolazione omogenea di cellule RPE. Il processo di ordinamento anti-TRA-1-60 è un processo di selezione negativa che rimuove le cellule che ancora esprimono marcatori di cellule staminali; tuttavia non garantisce le cellule rimanenti sono cellule RPE puri. Anche se morfologicamente le cellule mostrano classica morfologia RPE di pigmentazione unnd forma poligonale cella, è possibile che non tutte le cellule sono RPE.

Esperimenti microarray possono produrre falsi positivi per l'espressione di RNA, in particolare nel caso di microRNA causa delle brevi sequenze. Sebbene il sistema microarray utilizzato per questo esperimento comprendeva sonde multiple per indirizzare le diverse regioni di ciascun obiettivo, i risultati devono essere sempre convalidati da qRT-PCR.

L'analisi dei dati di microarray da Ingenuity IPA dipende dalla quantità e qualità delle informazioni nel database Ingenuity. Molte delle informazioni sulla funzione genica e vie cellulari è derivato da esperimenti condotti su linee cellulari trasformate o nell'ambito della ricerca sul cancro. Pertanto, i risultati delle analisi e via rete usando questo programma potrebbe non essere sempre rilevante per cellule primarie o, in questo caso, le cellule staminali.

Nonostante questi limiti, i metodi descritti in questa relazione possono essere utilizzati percoltura di cellule iPS e RPE fetale, derivante RPE da cellule iPS, e l'estrazione di RNA per l'analisi microarray di miRNA. I dati generati da questi saggi possono essere utilizzati per identificare miRNA coinvolti nel processo di differenziazione, così come quelli che regolano le funzioni RPE.

Anche se sono stati trovati per essere espresso in modo differenziale nel feto RPE vs confronto iPS-RPE rispetto ai iPS vs confronto iPS-RPE più miRNA, ci sono molte ragioni possibili per questo. Prima di tutto, quando il presente saggio è stato eseguito, la piattaforma microarray miRNA era in grado di rilevare 1.205 umana e 144 miRNA virali. Da quel momento, la piattaforma è stata ampliata per includere sonde per oltre 2.000 miRNA umani. E 'certamente possibile che i profili di espressione differenziale dei miRNA cambia se vengono rilevati più miRNA. Dei 1,349 miRNA identificati da questa analisi, la maggior parte dei miRNA ha mostrato alcuna differenza di espressione tra i tipi cellulari (Figure 2B e 2C

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

I pareri o le affermazioni contenute nel presente documento sono le opinioni personali degli autori e non devono essere interpretate come ufficiale o quanto riflette le opinioni del Dipartimento dell'Esercito o il Dipartimento della Difesa.

Questa ricerca è stata eseguita mentre Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, e Ramesh R. Kaini gli autori hanno tenuto una Postdoctoral Research Associateship Consiglio Nazionale delle Ricerche presso l'USAISR.

Microarray sono stati eseguiti dai bambini del Greehey Cancer Research Institute Microarray Nucleo Facility e Bioinformatica Dipartimento presso UT Health Science Center a San Antonio.

Questo lavoro è stato supportato dal US Army programma clinico di Medicina Riabilitativa Research (CRMRP) e militare Programma di Ricerca Operativa Medicina (MOMRP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5X supplement Stem Cell Technologies 5850
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-β-mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-l-thyronine sodium salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Fetal RPE media RTEGM kit Life Technologies 195406
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Trypsin Hyclone(Fisher) 25200-072
Miltenyi Biotec washing buffer StemGent 130-092-987
Miltenyi Biotec rinsing buffer StemGent 130-092-222
Anti-TRA-1-60 microbead kit StemGent 130-095-816
Miltenyi Biotec cell sorter column StemGent 130-021-101
RNeasy micro kit Qiagen 74004
QIA shredder Qiagen 79654
RNA 6000 Pico LabChip kit Agilent G2938-90046
Human miRNA microarray v16 Agilent G4471A

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References

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