İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

MıkroRNA (miRNA) insan kaynaklı-pluripotent kök (iPS) hücreleri (iPS-RPE), ve fetal RPA'nin türetilen insan kaynaklı-pluripotent kök profilleri (iPS) hücreleri, retina pigment epiteli (RPE), karşılaştırıldı.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Greene, W. A., Muñiz, A., Plamper, M. L., Kaini, R. R., Wang, H. C. MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (88), e51589, doi:10.3791/51589 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu raporun amacı, MicroRNA (miRNA) insan iPS hücrelerinden (IPS-RPE) türetilen insan kaynaklı-pluripotent kök (iPS) hücreleri, retina pigment epiteli (RPE), ve fetal RPE profilleri karşılaştırmak için protokolleri tanımlamaktır. Protokoller mikro-dizisi ile analiz için RNA'nın toplanması ve diferansiyel olarak üç hücre türleri arasında ifade edilmiştir miRNA'lar tanımlamak için mikro-dizi veri analizi bulunmaktadır. IPS hücreleri ve fetal RPE kültürü için yöntemler açıklanmıştır. İnsan iPS ikinci RPE farklılaşması için kullanılan protokol, aynı zamanda açıklanmaktadır. Biz tarif RNA ekstraksiyon tekniği miRNA mikrodizi kullanılmak için çok küçük RNA maksimum iyileşme sağlamak için seçildi. Son olarak, hücresel yol ve mikroarray verilerinin ağ analizi açıklanmıştır. Bu teknikler, üç farklı hücre tiplerinin miRNA profillerinin karşılaştırılmasını kolaylaştıracaktır.

Introduction

Kök hücreler sınırı ve herhangi bir somatik hücre tipi içine ayırt etmek için potansiyeli olmadan çoğaltmak için kapasitesine sahiptir. Kişiselleştirilmiş doku rejenerasyonu gelişiyle ufukta 1 olduğu gibi pluripotent kök hücrelerinin içine somatik hücreleri yeniden programlamak tekniklerinin geliştirilmesi, araştırma topluluğu ve klinisyenler arasında büyük heyecan yol açmıştır. EKH ile ilişkili etik ikilemleri engellemeyi ise İsteyerek-pluripotent kök (iPS) hücreler (ES) hücreler, embriyonik kök olarak sınırsız Replikatif potansiyeli ve pluripotensin aynı özellikleri gösterirler. Buna ek olarak, bir hastada elde edilen kök hücreleri büyük ölçüde başarılı terapötik uygulamalar 2-3 olasılığını artırarak, bir bağışıklık tepkisi uyarmak değildir. Özel kültür koşulları altında, iPS hücreleri kardiyomiyositlerde, nöronlar, pankreatik beta hücreleri, hepatositler ve retinal pigment epitel (RP de dahil olmak üzere, in vitro olarak birkaç farklı hücre tipleri, içine ayırt gösterilmiştirE) 4-12.

RPE üretimi için özel bir tür fotoreseptör dış bölümlerinin parazit ışık, fagositoz emilme görsel sağlık ve fonksiyonu için gerekli olan bir çok işlevi yerine retinanın arka tarafında yer alan pigmentli epitel hücre tabakası ve retinoidlerin işleme Görsel kromofor. Gibi yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), Stargardt hastalığı ve retinitis pigmentosa (RP) gibi altta yatan RPE patoloji sonucu kör hastalıklar kanıtladığı gibi hasar veya hastalık RPE disfonksiyonu derinden fotoreseptör sağlığı ve görme fonksiyonu etkiler 13. Vizyon geri yükleyebilirsiniz gerçekten etkili tedaviler elde edilmemiştir ve sağlıklı RPE hastalıklı RPA'nin yedek görme 14-15 kaybını önlemek için en iyi seçenek olabilir. IPS (iPS-RPE) türetilmiş RPE hasarlı RPE değiştirmek için hücrelerin olası kaynaktır. iPS-RPE özelliklerini gös ifadetlc RPE proteinler LRAT, CRALBP, PEDF ve RPE65; klasik yüksek pigmentli altıgen RPE morfolojisi görüntüler; cis retinal 5,16 - ve bu fagositoz, retinoid işleme ve 11 salgılama ile RPE işlevleri yerine getirmektedir. IPS-RPE tedavi edici olarak kullanılabilir önce, ancak, iPS-RPE iyice karakterize edilmelidir. RPE farklılaşmayı idare eden faktörlerin anlaşılması klinik uygulamalar için kullanılacak hücrelerin verimini ve saflığını geliştirmek için gereklidir.

Hücre farklılaşması oldukça düzenli bir gen ifadesinin bir sonucudur. Transkripsiyon faktörleri genomunun ve koordinasyonu epigenetik yeniden farklılaşması ve gelişimi sırasında meydana gelen 17 hücre hayati kararlar için gereklidir. MicroRNA (miRNA) tarafından mesaj RNA (mRNA) çeviri Yönetmelik hücre kaderini etkileyen 1. yönetmeliğin henüz bir seviye sunuyor. MiRNA'lar kısa, ~ 22 nt, nükleotidlerin uzunlukları bu bastir çeviri yoluylamRNA'nın 3 'UTR bağlanabilen ya da indirgenmesi için mRNA hedef. MiRNA'lar hemen hemen tüm dokularda tespit edilmiştir ve bugüne kadar 2000'den fazla eşsiz insan microRNA miRBase veritabanında kayıtlı edilmiştir. Yani, tek bir mRNA birkaç farklı miRNAs hedeflenebilir; miRNAs hedef mRNA bağlamak için sadece kısmi tamamlayıcılık gerektirir, tek miRNA potansiyel olarak onlarca veya yüzlerce hedefleri ve tersi bağlanabilir. Bu rastgele bağlanma özelliği dramatik düzenleme karmaşıklık düzeyini yanı sıra bireysel miRNA'ların işlevleri belirlenmesinde zorluk seviyesi ve rol hücresel fonksiyonlarda 18-21 her çalış artar. Bununla birlikte, araştırmalar miRNA DNA metilasyon durumunu 17 etkileyerek farklılaşması sırasında gen ekspresyonunu iyileştirir göstermiştir. RPE için daha özel bir çalışmada, miR-204/211 RPE 22 epitel fenotipine yol gösterilmiştir. Başka bir grup miRNA profili analizRPE ES hücrelerinden farklılaşması sırasında ve miRNA farklı setleri ortaya farklılaşma sırasında 23 olarak ifade edilmiştir. Aslında, miRNA profil açıkça ES hücreleri, ön-madde hücreleri, ve terminal olarak farklılaşmış hücreler 24,25 dahil olmak üzere hücre tipleri, ayırt edebilir. 250'den fazla miRNA'ların retinada ifade edilir. Bu çalışmalara dayanarak, biz miRNA'ların iPS gelen RPE farklılaşması sırasında önemli bir rol oynamaktadır varsayımında.

Bu raporun amacı, IMR90-4 iPS gelen RPE farklılaşması için protokolleri tanımlamak için hücreler, mikroarray ile analiz için RNA'nın toplanması ve diferansiyel üç hücre tipleri arasında ifade edilir miRNA'lar, iPS hücrelerini tanımlamak için mikroarray veri analizi iPS-RPE ve fetal RPE. Toplam RNA, her bir hücre tipi kültürlerinden ekstre edilmiş ve 1205 ve 144 insan miRNAs viral miRNAs spesifik problar ihtiva eden bir miRNA mikroarray hibridize edildi. Mikrodizi sonuçları karşılaştırmak edildimiRNAs farklı olarak farklı hücre tipleri arasında ifade edildi belirlemek için d. 2 kat ya da daha fazla ifade kat değişiklik ile miRNAs daha ileri analiz için seçildi. A MiRNA analiz yazılım programı, farklı şekilde eksprese miRNAs olası hedefleri tanımlamak için ve seçilen miRNAs düzenlenir hücre ağları oluşturmak için kullanılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Kültür Reaktifler ve Kültür Plakaların 1. Hazırlanması

  1. mTeSR1 ortam üreticinin talimatlarına göre mTeSR1 ortamını hazırlayın. Gece boyunca 4 ° C'de 5x mTeSR1 ek 100 ml çözülme MTeSR1 bazal ortam 400 ml mTeSR1 5x ek 100 ml ekleyin ve iyice karıştırın. Bu ortam kadar 2 hafta boyunca 4 ° C'de 6 ay boyunca -20 ° C 'de stabildir.
  2. Farklılaşma media: 10 ug / ml gentamisin 0.1 mM β-merkaptoetanol, 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler, 2.0 mM L-glutamin,% 10 nakavt serum ve vermek üzere DMEM/F12 ortamı farklılaşma hazırlayın.
  3. iPS-RPE media: 1x N1 ek, 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler, 250 ug / ml taurin, 13 ng / ml triiyodo-L-tironin sodyum tuzu, 20 ng / ml hidrokortizon, 5 ug verecek şekilde MEM içinde iPS-RPE ortamını hazırlayın / ml gentamisin ve% 15 FBS 26.
  4. Triiyodo-L-tironin sodyum tuzu stok solüsyonu. Stok çözelti hazırlamak için triiyodo-L-tironin 1.0 mg çözülürhafifçe dönen 1 N sodyum hidroksit içinde, sodyum tuzudur. Sonraki triiyodo-L-tironin sodyum tuzunun 20 ug / ml 'lik 50.0 ml yapmak için taban ortamının 49.0 ml. Hacimde hazırlayın ve ihtiyaç kadar -20 ° C'de dondurma. Nihai kültür ortamı içinde arzu edilen bir konsantrasyon elde etmek için uygun bir hacmi kullanın.
  5. Hidrokortizon stok çözeltisi: Bir hidrokortizon stok çözelti hazırlamak hafif çalkalama ile mutlak etanol içinde 1 ml hidrokortizon, 1 mg çözünür hale getirmek için. Sonraki 50 ug / ml, 20 ml hidrokortizon stok çözeltisi için taban ortamının 19.0 ml. -20 ° C'de alikot ve dondurularak gerekli olana kadar. Nihai kültür ortamı içinde arzu edilen konsantrasyonu elde etmek için uygun bir hacmi kullanın.
  6. Fetal RPE büyüme ortamı. FBS haricinde üreticinin talimatlarına göre, bazal ortam maddesi içinde RTEGM kit tüm reaktifleri karıştırarak büyüme ortamı hazırlayın.
  7. Fetal RPE kaplama medya. Steril bir kap ve bir büyüme ortamı küçük bir miktar aktararak kaplama ortamı hazırlamak% 2'lik bir nihai konsantrasyona kadar dd FBS.
  8. Dispase: DMEM/F12 'de 1 mg / ml' lik dispase çalışma çözeltisi hazırlayın.
  9. Matrigel kaplı plakalar: 0.08 mg / ml DMEM/F12 içinde Matrigel hazırlayın.
  10. Coat her Matrigel çözeltisi 1.0 ml'lik bir 6-yuvalı plakanın.
  11. 1.0 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin kaplanmış plakalar.
  12. 1.0 saat inkübe edildikten sonra, fazlalık DMEM/F12 aspire.
  13. Kurumayı önlemek için mTeSR1 medya 0.5 ml ekleyin. Matrigel kaplanmış plakalar artık kullanıma hazırdır.

2.. IPS Kültür

  1. IPS hücre ekimi öncesinde tüm tüpler, oda sıcaklığına kadar sıcak mTESR1 ortam ve hazır Matrigel kaplı plakalar.
  2. Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde IMR90-4 iPS hücrelerini eritin. Daha sonra su banyosundan çıkarın ve dondurarak saklamaya uygun vialler% 70 etanol kullanılarak sterilize edin.
  3. Hücre agrega kırılmasını en aza indirmek için, 2 ml bir pipet kullanarak 15 ml konik tüp hücreleri aktarın.
  4. Bırak-bilge wa 5 ml ekleyinrm yavaşça mTeSR1 hücrelere medya ve karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler supernatant çıkarın.
  5. Dikkatle mTeSR1 ortam, 2 ml hücre agrega tekrar süspansiyon ve altı çukurlu bir levhanın bir kuyu üzerine hücreleri tohum.
  6. % 5 CO2,% 95 nem ile 37 ° C inkübatör içine ve kültür plakası yerleştirin.
  7. Günlük iPS hücre kültür ortamı değiştirin. Farklılaşmamış kolonileri 5-7 gün tohumlama sonra görünecektir. Pasaj (yoğun merkezi ile koloniler) için hazırız farklılaşmamış koloniler kontrol edin.

IPS Hücreler 3. Pasajlanması

  1. Önceki kanalına başlangıcına iPS hücreleri, bütün tüpler, dispaz çözeltisi ve mTERS1 DMEM/F12 ortamı oda sıcaklığına ısıtıldı gelmiştir ve Matrigel kaplı plakalar, hazır.
  2. IPS hücreleri pasaj önce, bölgeyi kazıma ve medya aspire tarafından herhangi bir diferansiyasyon alanları kaldırmak. Farklılaşma yüksek için kuyunun% 20'nin altında kalmalıdırkalite kültürleri. Dikkatlice iPS hücresi içeren de 2 ml DMEM/F12 yıkayın ve her bir oyuğa, 1 mg / ml dispase 1 ml ekleyin.
  3. 7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Dispaz aspire ve yavaşça iki kez 2 ml DMEM/F12 ile hücre kolonileri yıkayın.
  4. Durulamadan sonra, her bir kuyucuğa mTSER1 2 ml ekleyin.
  5. 5 ml'lik bir pipet kullanarak yavaşça agregatlar oluşturması için plakanın koloniler kazıyın.
  6. 15 ml konik tüp müstakil koloniler aktarın. Hücrelerin bir sonraki geçişini tohum için yeterli mTeSR1 ortam ekleyin.

IPS-RPE iPS Hücreler 4. Farklılaşma

  1. MTESR1 ortam içinde bir yeni kaplanmış plaka üzerinde iPS hücreleri Plate.
  2. IPS hücre kolonileri kültüründe 4-5 gün boyunca genişletmek için izin verir.
  3. 4 ml farklılaşma ortamı ile Yedek mTeSR1 ortam. Her 3 gün medyanın yarısını değiştirin.
  4. Pigmentli odakları (40-50 gün) el kültürün dışında disseke edilmesi için yeterince büyük büyümek için izin verir.
  5. Bir kullanın200 ul pipet ucu etrafında kesmek ve pigmentli koloniler kaldırın.
  6. Toplayın ve 15 ml konik tüp içinde disseke koloniler havuzu.
  7. Daha sonra iki kere 5 dakika için 300 x g de RPE hücreleri toplanmış ve santrifüj DMEM/F12 5 ml ekleyin.
  8. % 0.25 tripsin EDTA ile bir araya getirilmiş iPS-RPE inkübe edilmesi ile tek bir hücre çözeltisi hazırlayın.
  9. IPS-RPE medya ile iPS-RPE hücreleri durulayın ve üzerine toplanan hücreleri plaka taze matrigel kaplı iPS-RPE medya 4 ml iyi.
  10. Kültür önce geçide 3 hafta için hücreler. Her 3 gün medya değiştirin. Deney için, levha iPS-RPE / cm 2 100.000 hücre. Günün 17 hücreleri toplamak. Günü 0 olarak tohumlama günü sayın.

5.. Örnek Toplama

  1. iPS hücre Collection
    1. Kültür iPS hücreleri farklılaşmamış koloniler merkezinde yoğun olduğu gözlenmektedir kadar.
    2. DMEM/F12 koloniler durulayın.
    3. Accutas kullanan tek hücrelere ayrıştırmaları e. 5 dakika boyunca 300 x g'de, 15 ml konik bir tüp ve santrifüj içine hücreleri toplamak. Süpernatant aspire. 2 ml DMEM/F12 içinde yeniden süspanse edin.
  2. Fetal RPE Koleksiyonu
    1. DMEM/F12 Fetal RPE hücre kültürleri yıkayın ve% 0.25 tripsin EDTA kullanılarak tek hücrelere ayrışır.
    2. Bir 15 ml konik bir tüp içinde hücreleri toplamak. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Süpernatant aspire. 2 ml DMEM/F12 içinde yeniden süspanse edin.
  3. iPS-RPE Hücre Koleksiyonu
    1. IPS-RPE geçiş 3 ve geçit 5 ulaştığınızda, geçit 17. günden sonra hücreleri toplamak. Iki defa PBS içinde iPS-RPE yıkayın ve 1.0 ml% 0.25 tripsin ile inkübasyon sonucunda tek bir hücre süspansiyonu hazırlanır.
    2. Buz iPS-RPE medya 2 ml tripsin nötralize.
    3. 5 dakika boyunca 300 x g'de, 15 ml konik bir tüp ve santrifüj hücreleri toplamak. Süpernatant aspire.
    4. Mikroboncuk kiti lekeleme tampon maddesi, 3 ml hücre süspansiyonu yeniden süspanse edin.
farklılaşmamış hücreler çıkarmak iPS-RPE> 6 ve_title ". Negatif Seçim

  1. Kullanılıncaya kadar 4 ° C'de tüm reaktifler tutun, ancak buz üzerinde çalışmaz. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ikinci aşama 5.3.4 hücre süspansiyonu. Süpernatant aspire.
  2. 2 x 10 6 hücre başına microbead kiti boyama tamponu 100 ul yeniden süspanse hücreleri.
  3. 2 x 10 6 hücre başına anti-TRA-1-60-PE antikor 10 ul ekle.
  4. İyice karıştırın ve 10 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  5. 2 x 10 6 hücre başına tampon 1-2 ml hücreleri yıkayın. 300 x g 10 dakika boyunca santrifüj. Süpernatant aspire.
  6. 2 x 10 6 hücre başına lekeleme tampon maddesi 80 ul içinde süspanse hücreler. 2 x 10 6 hücre başına anti-PE etiketli mikrotaneciklerin 20 ul (kit) ekleyin. İyice karıştırın. 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe
  7. 2 x 10 6 hücre başına lekeleme tampon 1-2 ml ilave edilir. 300 x g 10 dakika boyunca santrifüj. Süpernatant aspire.
  8. 500 & # süspansiyon hücrelerin956, lekeleme tamponu l.
  9. Manyetik hücre ayırma:
    1. Manyetik hücre sıralayıcı sütun yerleştirin. Lekeleme tampon maddesi 3 ml ile sütun durulayın.
    2. Sütunu üzerine 6.8 hücre süspansiyonu uygulanır.
    3. TRA-1-60 negatif hücreleri toplamak için olumsuz limanında bir tüp yerleştirin.

7. Toplam RNA Ekstraksiyon

  1. Lyse nükleik asit miniprep için tasarlanmış ticari olarak temin edilebilen bir mikrosantrifüj homojenleştirici küçük spin kolon yoluyla örnekleri çalıştırarak hücreleri.
  2. IPS hücreleri, iPS-RPE ve küçük RNA molekülleri 27 korumak için tasarlanmış ticari olarak piyasada mevcut RNA özütleme kiti ile fetal RPE toplam RNA ekstrakte edin.
  3. Nanodrop spektrofotometre kullanılarak toplam RNA konsantrasyonları belirler.

8. Bioanalyzer ve Microarray Deneyi

  1. Piyasada mevcut RNA kaliteli kiti ile birlikte Bioanalyzer ile RNA bütünlüğünü kontrol edin.
  2. 100 ng of inkübe30 dakika boyunca 37 ° C 'de dana bağırsak fosfatazı ile total RNA
  3. 5 dakika boyunca 100 ° C 'de% 100 DMSO kullanılarak RNA denatüre.
  4. PCP-Cy3 1 saat boyunca 16 ° C'de inkübasyon yoluyla T4 ligazı kullanılarak örnekleri etiketleyin.
  5. Bir 8_x_15K formatta insan miRNA dizi üzerinde melezleşir.
  6. Üreticinin talimatlarına göre diziler yıkayın ve bir tarayıcı kullanarak 5 mikron çözünürlükte tarayın.
  7. MiRNA mikroarray ile uyumlu mikrotertip özellik çıkarma yazılımı kullanarak veri elde.
  8. Her bir numunedeki ifadenin rölatif seviyesini belirlemek üzere miRNA sinyalleri işler.
  9. Örnek gruplar arasında, her miRNA ekspresyon seviyelerini karşılaştırın. Daha fazla analiz için en az iki kat diferansiyel ekspresyonu ile miRNA'lar seçin.
  10. Farklı olarak ifade miRNAs 28 görselleştirilmesi için ısı haritaları oluşturmak için yönergeleri izleyin, veri analizi için ticari olarak satılan yazılım kullanma.

9. Yol Analizi

  1. Excel formatında 8.9 seçilen miRNAs verileri kaydetmek.
  2. Online RNA yolu analiz programına oturum açın. Excel dosyasını yükleyin. Dosya biçimi için "Esnek Format" seçeneğini seçin ve tanımlayıcı türü için açılır listeden "Agilent" seçeneğini seçin.
  3. Ham veri başlığının altında, kimlik sütunu prob "ID" atamak ve "Gözlem 1" atamak ve günlük rasyon sütuna "oranı log". Diğer tüm sütunlar için "görmezden" seçeneğini seçin.
  4. Aşağıdaki gibi analiz için parametreleri seçin: Güven: deneysel sadece görülmektedir; doğrudan ve dolaylı ilişkiler arasında; ve endojen kimyasallar içerir; Referans kümesi olarak marifet Bilgi tabanını seçin. Tüm türler veri, tüm hücre hatları ve dokuları ve tüm mutasyon içeren bir referans moleküllerin bir veritabanı seçin.
  5. Run ağ ve yolu analizleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

iPS hücreleri (Şekil 1A)-RPE iPS hücrelerine farklılaşmasını teşvik için farklılaşma koşullarda yetiştirildi. IPS-RPE altıgen pigmentli hücre morfolojisi fetal RPE (Şekil 1C) benzer (Şekil 1B) klasik RPE fenotip sergiledi.

Daha iyi miRNA iPS iPS-RPE farklılaşma sürecinde oynayabileceği rolü anlamak için, miRNA ifade mikroarray analizi yapıldı. Toplam RNA, iPS hücreleri, fetal RPE ve küçük RNA'ların maksimal tutulmasını sağlamak için Mirvana miRNA izolasyon kiti kullanılarak iPS-RPE toplanmıştır. RNA mikrodizi labchip için hibridizasyon önce miktarı ve saflık için test edildi. 1205 insan ve 144 viral miRNA'lar temsil Probes Her numune dizisinden MiRNA ifadesini analiz etmek için kullanıldı. Sinyaller, herbir örnekten her miRNA ekspresyon göreli düzeylerini belirlemek için analiz edildi. Veriler miRNA e karşılaştırmak için kullanıldı iPS ve fetal RPE iPS-RPE XPression profili. Isı haritaları grup (Şekil 2A) arasında ayırıcı MiRNA ifade görselleştirme sağlamak için oluşturulmuştur. Diferansiyel iPS ifade edildi 83 miRNA'ların 47 iPS-RPE kıyasla iPS upregüledir miRNAs ve iPS (Şekil 2B) downregüle ile 36, iPS-RPE karşılaştırdık. 110 miRNAs diferansiyel fRPE upregüle 61 miRNAs ile iPS-RPE ile karşılaştırıldığında fetal RPE olarak ifade edilir ve 49 iPS-RPE (Şekil 2C) ile karşılaştırıldığında fRPE olarak azaldı. Fikrim IPA yazılımı ile patika analizi hücresel gelişim, büyüme, çoğalma ve hayatta kalma, hücre döngüsü ve hücre hareketinde yer genlerin farklı şekilde ifade miRNA'ların hedef transkript belirtti. MiRNA in vivo olarak okular dokularda ifade edilen iPS (Şekiller 3 ve 4) ile karşılaştırıldığında iPS-RPE ve fetal RPE zenginleştirilmiş bulunmuştur.

t "fo: keep-together.within-page =" always "> Şekil 1
Şekil 1. IPS, fetal RPE ve iPS-RPE aydınlık görüntüler. Öncesinde farklılaşma, fetal RPE ve iPS türetilmiş RPE iPS hücreleri aydınlık görüntüleri (100X). Fetal RPE ve iPS-RPE Hem altıgen şekil ve pigmentasyon klasik RPE morfolojisi gösterilecek. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,
IPS-RPE Şekil 2.. MiRNA ifade profil iPS ve fetal RPE göre. A) Isı haritaları miRNA'ların diferansiyel ifade göreli derecesini betimliyor. Renkölçek (kırmızı) yukarıdaki gibi, aşağıdaki miRNA (yeşil) ekspresyon seviyelerini temsil etmektedir, ya da iPS hücrelerinin. C) karşılaştırması iPS-RPE miRNA profilleri tüm örnekler arasında ekspresyon seviyesi (siyah) anlamına gelir. b) Karşılaştırma Fetal RPE iPS-RPE miRNA profilleri. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,
IPS türetilmiş RPE karşı parental iPS hücrelerinin miRNA ekspresyon profilleri Şekil 3. A) ağ analizi. Ilk 4 ağları ayrı ayrı gösterilir (sol) ve (merkez) farklı olarak ifade miRNA'ların. B) Yol analizi birleştirilir. Please bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 4,
IPS türetilmiş RPE karşı fetal RPA'nin miRNA ifade profilleri Şekil 4. A) Ağ analizi. Üst 7 ağları ayrı ayrı gösterilir (sol) ve farklı olarak ifade miRNA'ların. B) Yol analizi (merkez) birleştirilir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sonuç olarak, bu rapor kültür iPS hücreleri için kullanılan yöntemler, iPS-RPE ve fetal RPE açıklar. IPS türetilen RPE morfolojik ve fonksiyonel olarak fetal RPE benzer. IPS-RPE de RPE65, CRALBP, PEDF ve LRAT 16 gibi karakteristik RPE genleri ifade eder. Bundan başka bu hücrelerin karakterize etmek için, RNA ekstre edilmiş ve farklı şekilde eksprese miRNA belirlemek için mikrodizi analizi için kullanılmıştır. Sinyal yoğunluklarının analizi farklı şekilde ifade miRNA'ların büyük sayı iPS-RPE daha olgun olabilir düşündüren, iPS-RPE karşılaştırmalar karşı fetal RPE tespit edildiğini ortaya çıkardı. Gelecek çalışmalar RT-PCR ile bu sonuçları doğrulamak için planlanmaktadır.

Dikkatle doğru verilerin tahlil ve satın alma başarısını sağlamak için yapılmalıdır, bu deney sırasında birçok kritik noktalar vardır. Ilk anahtar adım iPS hücrelerinin kültürü sırasında meydana gelir. iPS hücreleri plu kalmalıdırkendi stemness korumak için durum ripotent. Hücreler dikkatle farklılaşma belirtileri için günlük kontrol edilmelidir. Farklılaşmamış iPS hücreleri kompakt çok hücreli koloniler olarak büyür. Hücreler sitoplazma oranı ve belirgin nukleoli yüksek bir nükleer olmalıdır. IPS koloniler merkezde hücre çeşitli katmanları ile, ayrı bir çerçeve ile karakterize edilir. Farklılaşma belirtileri tanımlandığı koloni sınırları, düzgün olmayan bir hücre morfolojisi ve bu nöronlar ve fibroblastlar gibi hücre tiplerinde belirgin, görünümünü kaybıdır. Farklılaşmış olan hücrelerin tek dispase ve durulanması ile kaldırılabilir, ancak bu özelliklere sahip koloniler elle kültürü 29 uzaklaştırılmalıdır.

Mikro-dizi analizi için RNA hazırlanması sonraki kritik adımdır. Tutarsız RNA kalite mikroarray verilerinin değişkenlik önemli bir kaynağıdır. RNA ekstraksiyonu, yüksek bir moleküler ağırlığa ve en iyi sonuçlar için minimal bozulmuş RNA verim gerekir. BaşarılıRNA ekstraksiyon az kayıpla ve herhangi bir kirletici RNases ücretsiz total RNA verecektir. 260 nm'de spektrofotometri ile RNA konsantrasyonunun belirlenmesinden sonra, numunenin saflığı polisakaridler veya protein ile kirlenmesini tespit etmek için 230 ve 280 nm 'de tespit edilmelidir. RNA için 230:260:280 oranı kirlenme 30 ile yüksek kalitede RNA göstermek için 01:02:01 olmalıdır.

Mikrodizi denemeyi planlarken, en kritik adım problarına melezleme özgü sağlamak için, ve algılanan sinyaller o numune seti için geçerli olmasını sağlamak için üç nüsha halinde her bir numune çalışmasına negatif kontrollerin dahil. Mikrodizi sonuçların analizi sırasında, önemli bir noktadır arka plan gürültü her bir prob için gerçek sinyal yoğunluğu vermek için gözlenen sinyalden çıkartılır edildiği, arka plan düzeltmedir. Gerçek pozitif sinyaller vurgulayarak Bu adım, yanlış pozitif ortadan kaldıracaktır. </ P>

Son olarak, ağ ve mikroarray sonuçlarının yol analizi sırasında, en önemli adım analiz çalıştırmadan önce doğru parametreleri ve filtreleri kurmaktır. Bu adım, ağlar oluşturmak ve diferansiyel karşılaştırmalar ifade edilmesi için gösterilen miRNAs etkilenen hücresel yollar tanımlamak için yazılım tarafından kullanılacak olan veritabanları belirleyecektir.

Bu rapor içinde açıklanmış yöntemleri kullanarak veri satın alınmasından sonra, bu sonuçların yorumlanması sırasında bu tahlillerin sınırlamaları dikkate alınması gerekmektedir. Mümkün olsa da, bu RPE kültür RPE hücreleri homojen bir popülasyon olmadığını mümkün kalır. Anti-TRA-1-60 ayırma işlemi hala hücre belirteçleri kök ifade hücreleri temizler negatif bir seçim süreci; ancak bu kalan hücreler saf RPE hücreleri garanti etmez. Morfolojik hücreler pigmentasyon a klasik RPE morfoloji rağmennd çokgen hücre şekli, bu tüm hücreler RPE olması mümkündür.

Mikrodizi deneyleri nedeniyle çok kısa dizilere özellikle microRNA durumunda, RNA ekspresyonu için yanlış pozitif üretebilir. Bu deney için kullanılan mikro-sistem, her hedefin farklı bölgeleri hedef için birden sondalar dahil olmasına rağmen, sonuçlar her zaman Mah-PCR ile valide edilmelidir.

Fikrim IPA ile mikro-dizi veri analizi, Ingenuity veritabanındaki miktar ve bilgileri ve kalitesine bağlıdır. Gen fonksiyonu ve hücresel yolların üzerinde bilgilerin çoğu dönüştürülmüş hücre çizgileri ya da kanser araştırma bağlamında gerçekleştirilen deneylerden elde edilir. Bu nedenle, bu programı kullanarak yolun ve ağ analizi sonuçları her zaman birincil hücreler için uygun olmayabilir ya da, bu durumda, kök hücreler.

Bu kısıtlamalara rağmen, bu raporda açıklanan yöntemler kullanılabiliriPS hücreleri ve fetal RPE, iPS hücrelerinden kaynaklanan RPE ve miRNA mikro-dizi analizi için RNA ekstraksiyon kültürü. Bu tahliller tarafından oluşturulan veriler, farklılaşma sürecine dahil miRNA'lar belirlemek, hem de RPE işlevlerini düzenleyen olanlar için kullanılabilir.

Daha miRNA'ların diferansiyel iPS-RPE karşılaştırma vs iPS daha iPS-RPE karşılaştırma vs fetal RPE'de ifade bulunmuş olmasına rağmen, bu birçok olası nedeni vardır. Her şeyden önce, bu deney gerçekleştirilmiştir zamanda, mikro-dizi miRNA platformu 1205 insan ve 144 viral miRNA'lar tespit etme yeteneğine sahip oldu. O zamandan beri, bir platform 2.000 'den fazla insan miRNAs için sondalar kapsayacak şekilde genişletilmiştir olmuştur. Daha miRNA'ların tespit edilirse miRNA diferansiyel ifade profilleri değişecek elbette ki mümkün değildir. Bu deneyde tespit 1349 miRNAs arasında, miRNAs çoğu hücre tipi (Şekil 2B ve 2C arasında ekspresyonunda bir farklılık gösterdi

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Burada yer alan görüşler ya da iddiaların yazarların özel görünümleri ve resmi gibi ya da Ordu Departmanı ya da Savunma Bakanlığı görüşlerini yansıtan tefsir edilmesi değildir.

Yazarlar Whitney A. Greene, Alberto Muniz'in ve Ramesh R. Kaini USAISR bir Ulusal Araştırma Konseyi Doktora Sonrası Araştırma Associateship tutarken Bu araştırma yapıldı.

Mikroarray deneyler Greehey Çocuk Kanser Araştırma Enstitüsü Mikrodizi Çekirdek Tesis ve UT Sağlık Bilimleri Merkezi San Antonio Biyoinformatik Bölümü tarafından yapılmıştır.

Bu çalışma ABD Ordusu Klinik Rehabilite Tıp Araştırma Programı (CRMRP) ve Askeri Tıp Yöneylem Araştırma Programı (MOMRP) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5X supplement Stem Cell Technologies 5850
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-β-mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-l-thyronine sodium salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Fetal RPE media RTEGM kit Life Technologies 195406
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Trypsin Hyclone(Fisher) 25200-072
Miltenyi Biotec washing buffer StemGent 130-092-987
Miltenyi Biotec rinsing buffer StemGent 130-092-222
Anti-TRA-1-60 microbead kit StemGent 130-095-816
Miltenyi Biotec cell sorter column StemGent 130-021-101
RNeasy micro kit Qiagen 74004
QIA shredder Qiagen 79654
RNA 6000 Pico LabChip kit Agilent G2938-90046
Human miRNA microarray v16 Agilent G4471A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
  2. Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
  3. Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
  4. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
  5. Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
  6. Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
  7. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
  8. Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
  9. Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
  10. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
  11. Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
  12. Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
  13. la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
  15. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
  16. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
  17. Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
  18. Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
  19. Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
  20. Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
  21. Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
  22. Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
  23. Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
  24. Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
  25. Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
  26. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
  27. Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. (2013).
  28. Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. (2011).
  29. Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. (2010).
  30. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics