소설 보컬 폴드 생물 반응기의 구조 및 특성

1Biomedical Engineering Program, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware
Published 8/01/2014
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Bioengineering

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Zerdoum, A. B., Tong, Z., Bachman, B., Jia, X. Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor. J. Vis. Exp. (90), e51594, doi:10.3791/51594 (2014).

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Abstract

Introduction

상피 층으로 구성된 인간의 성대는 고유 층 (LP) 및 vocalis 근육, 사운드 제작을위한 음향 파에 폐에서 공기 흐름을 변환하는 전문 부드러운 조직이다. 1 성대가 정상 발성을하는 동안 정기적으로 진동, 에 이르기까지 기본 주파수에서 최대 30 %의 변종을 나타내는 100 ~ 300 Hz에서에서. 2 성인 성대 LP는 표면 (SLP)로 구성된 그라데이션 구조, 중간 (ILP)과 깊이 (DLP) 층이다. 또한 분류 그룹 상피 세포와 점막 층으로 SLP, 그리고 보컬 인대에 ILP 및 DLP를 결합합니다. 3 인대가 성숙 콜라겐과 엘라스틴 섬유가 풍부하면서 SLP 층, 띄엄 띄엄 분산 된 콜라겐 섬유와 주로 비정질 매트릭스를 포함 충분한 강도를 제공 할 수 있습니다. 4의 구조와 신생아 성대의 역학은 성숙한 대응 크게 다릅니다. 비록 메커니즘성대의 발전과 성숙을 조절의는 아직 완전히 실험적인 증거가 발성 파생 기계적 스트레스의 정의 역할을 지적했다, 이해되지 않습니다.

음성 남용, 감염, 화학적 자극 및 수술 등 여러 가지 건강 상태는 성대가 손상 될 수 있습니다. 성대 장애는 미국 인구의 추정 3-9% 영향을 미친다. 성대 질환에 대한 현재의 치료 방법은 5 개 제한하고 줄기 세포 기반 조직 공학 방법은 성대 기능 복원을위한 유망한 전략으로 떠오르고있다. 중간 엽 줄기 세포 (MSC) 성대 조직 공학에 대한 기본 성대 섬유 아 세포에 대한 적절한 대안입니다. 6-9 줄기 세포의 운명 사양 및 이후의 조직 개발은 기계 상태가되는가에있는 특정 틈새 시장에 의해 매개되는 중요한 요소. 10 기계적 힘은 조직의 형태 형성에 필수적인 레귤레이터이다ND 특히 일상적으로 조직 공학의 관점에서로드. 11을 실시하고 조직에 대한 항상성은, 그것은 노출 생리학 관련 기계적 자극이 세포 분화 및 조직 별 매트릭스 리모델링 줄기 촉진하는 것으로 입증되었다. 12-15

조직 배양 용 바이오 리액터는 시험 관내 세포 또는 조직 성장을위한 바람직한 생리적 환경을 시뮬레이션하기 위해 설계된다. 성대 조직 공학의 경우, phonating 성대의 기계적인 환경을 재현하는 것이 특히 중요합니다. 이상적인 성대 생물 반응기 효과적으로 주파수, 진폭과 진동의 기간 동안 손쉬운 제어를 허용, 배양 세포에 진동 신호를 제공한다. Titze 및 동료 기질 단백질의 세포 생산을 자극하는 높은 주파수 (20 ~ 200 Hz에서) 진동과 정적 스트레칭을 결합한 성대 생물 반응기 (T1 생물 반응기) 16을 고안했습니다. 저기서g이 생물 반응기, 웹의 동료 (17)은 히알루 론산 (HA) 기반의 하이드로 겔에서 배양 피부 섬유 아세포에서 10 일, 100 Hz에서 진동의 영향을 연구했다. 진동이 구문은 HA 합성 효소-2 (HAS2) 정적 컨트롤을 기준으로, decorin, fibromodulin 매트릭스 메탈-1 (MMP1)의 높은 발현을 보였다. 자극 효과가 따라 시간이 될 것으로 밝혀졌다. 더 최근에는, 단체 (18)는 전력 증폭기, 함수 발생기, 봉입 시끄러운 스피커 및 세포 부착에 진동 공기 전송 원주 정박 실리콘 막을 사용 성대 생물 반응기 (J1 생물 반응기)를 조립했다. J1 생물 반응기에서 배양 신생아 포피의 섬유 아 세포는 최대 0.05 %의 평면 변형으로, 60, 110 또는 300 Hz에서 진동이 1 시간을 실시 하였다. qPCR의 결과는 몇 가지 ECM 유전자의 발현이 적당히 다양한 진동 주파수에 대한 응답으로 변경된 것을 제안및 진폭.

이러한 생물 반응기 설계, 음모를 꾸미는 동안, 몇 가지 제한이 있습니다. 예를 들어, T1 시스템이 달성 가능한 최대 주파수를 제한하는 기계적 결합을위한 커넥터와 바의 다수를 필요로한다. 또한, 세포는 데이터 해석을 복잡 바람직 기계적 교반 및 액체 섭동을 거치게된다. J1 생물 반응기는, 반면에, 상대적으로 낮은 에너지 변환 효율을 나타내고 사용자 친화적 아니다. 또, 진동이 빈번 내부 실리콘 막에서 세포 함유 구조물을 분리. J1 버전과 동일한 원칙에 따라 설계 여기에보고 J2 성대 생물 반응기는, 일관성과 재현성에 최적화되어 있습니다. 발성을 흉내 낸 진동은 MSC-채워 섬유 폴리 (ε-카프로 락톤) (PCL) 발판이 effectiv 있습니다 개별적으로 장착되어 진동 챔버에 공기 역학적으로 생성됩니다엘리 확보했다. 레이저 도플러 진동계 (LDV)는 사용자가 멤브레인 / 지지체 조립체의 진동 프로파일을 확인한다. 우리의 데모에서는 중간 엽 줄기 세포 7 일 동안 12 시간의 매일의 총 1 시간 -에 - 1 - 시간 - 오프 (의) 패턴으로 200 Hz의 정현파 진동에 노출되어 있습니다. 부과 된 진동 신호에 대한 세포 반응을 체계적으로 조사하고 있습니다. 전반적으로, J2 성대 동적 세포 배양 연구는 높은 처리량과 재생 가능한 방식으로 수행 할 수 있도록, 가장 사용자 친화적 인 기능을 제공합니다.

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Protocol

1. 생물 반응기 조립 (비디오 1)

  1. 미리 정해진 내부 및 외부 치수 알루미늄 형 (원형 다이 + 스페이서 핀) (그림 1) 확인합니다.
  2. 에서 (그림 1의 스페이서 핀에 의해 형성 12mm, 두께 ~ 0.25 mm, 직경) 입지를 굳힌 슬리브 단계 1.1에서 금형을 사용하여, 실리콘 막 (1.5 mm, 그림 1 : 42mm, 두께 직경) 제작 시판되는 실리콘 엘라스토머 키트를 사용하여 중간.
  3. 일치하는 능선과 홈과 블록 (0.9 cm 두께) 상단을 조각 (1.8 cm 두께)과 하단, 중간에 : 원형 개구 (24mm 직경)와 아크릴 블록 쌍 (그림 2 (4, 5)) 확인 . 10
  4. 페어링 아크릴계 블록 사이 실리콘 막을 샌드위치. 일정한 힘 (35 CN · m)로 설정 마이크로 토크 드라이버를 사용하여 네 모서리의 나사를 사용하여 어셈블리를 고정합니다. 결과적으로, 방수, 24mm 폭 18mm 깊이 진동 챔버 (그림 2C)가 생성됩니다.
  5. 바닥 아크릴 블록에 각 나사의 또 다른 세트를 통해 진동 실 아래 3 "확장 된 범위의 미니 우퍼 (그림 2D, 8 Ω/20 W)를 설치합니다. 이 시점에서, 개별 진동 모듈 조립된다.
  6. 7 개의 추가 진동 모듈을 복제합니다. 바로 절단 균등하게 원형 구멍 (: 7cm, 두께 2cm 직경)의 스피커 기지를 배치하여 두 개의 고정 된 알루미늄 바 (40cm X 10cm X 2.5 cm) 중 하나에 4 개를 붙입니다. 각각의 원형 구멍에 알루미늄 막대의 측면을 통해 나사를 삽입하여 각 스피커를 안정.
  7. 개별 스피커를 선택하여 스피커를 제어 할 수 있습니다. 선택의 해당 출력에 다음 스피커 본체의 양극과 음극 입력에 와이어를 연결하여 선택 개별 스피커를 연결합니다. 스피커의 선택은 수 t의 신호그 함수 발생기는, 전력 증폭기를 통과 한 후, 일단 (도 2E)에 모두 팔 스피커에 도달한다.
  8. 반대로 습도가 인클로저에 두 개의 챔버 어레이 스피커 선택 및 관련 전자 제품을 놓습니다. 상업 세포 배양 인큐베이터에서 전체 어셈블리를 집.
  9. 인큐베이터의 뒤쪽에 필터 조립체를 통해 파워 앰프와 스피커를 연결 선택기 (의료용 PVC 튜빙을 통해) 메인 케이블 피드.

2. 비계 제조 및 특성

  1. 15 중량 %의 농도로 클로로포름 PCL 펠릿을 용해. 21 G의 무딘 엔드 바늘로 덮인 10 ML의 주사기에 솔루션을로드합니다.
  2. 프로그램 주사기 펌프에 주사기를 잠그고 / 시간 1 ㎖에 유량을 설정합니다.
  3. ~ 18cm의 바늘 끝 - 투 - 컬렉터 거리를 수평으로 바늘 맞은 편에 알루미늄 호일 덮인 집 놓습니다.
  4. 긍정적 인 알리 클램프바늘의 중간, 알루미늄 집 전체에 접지 악어 클립 게이터 클립은, 다음에 15 kV의 고전압 전원 장치에 전압을 설정한다. 주의 : 고전압, 바늘에서 거리를 유지.
  5. 순차적으로 주사기 펌프와 전원 공급 장치의 전원을 켭니다; 신속 클린 / 안정 섬유 제트 전에 건조 종이 타월을 이용하여 바늘의 선단부를 둘러싸는 잔류 중합체 용액을 제거하고 테일러 콘 (19)을 형성한다.
  6. 섬유는 250 ~ 300 μm의 ~의 두께로 알 수집기에 축적 할 수 있도록 (~ 현재 회전 상태에서 7 시간). 잔류 용매를 제거 1-2 일 동안 진공 건조기에서 얻어진 지지체를 저장한다.
  7. 화상 지지체가 일관된 섬유 형태를 보여주기 위하여 주사 전자 현미경을 사용하여, 금으로 스퍼터 코팅. 10

3. 생물 반응기 조립 및 특성

  1. 네 팔 (길이 : 원통형 디스크 (8mm 직경) : 펀치 2우선 디스크의 외경을 잘라 12mm 직경 생검 펀치를 사용하여 같은 회전 PCL 매트 (도 2a) 중 mm). 그런 균등 팔이 절단 어디 점수를 원형 블레이드 주위에 간격 네 2mm 긴 홈을 만들기 위해 두 번째, 8mm 생검 펀치를 사용합니다. 8 개 mm 펀치로 득점 한 후, 바깥쪽으로 팔의 가장자리를 잘라 메스 블레이드를 사용합니다. 연장 아암을 통해 실리콘 막의 홈에 지지체를 삽입 (비디오 1). 온화 납작한 핀셋을 사용하여 표면을 눌러 삽입 비계 평평.
  2. 레이저 반사를 돕기 위해 PCL 지지체에 얇은 알루미늄 포일의 작은 조각 (8mm × 2 mm의 수직 모양, 그림 2B)를 연결합니다.
  3. 진동 실에서 조립 된 실리콘 막 / PCL 발판을 (단계 1.4에 설명 된대로)에 고정합니다. 진동 전에 PCL의 발판을 수화하기 위해 챔버에 1.5 ㎖의 물을 추가합니다.
  4. 함수 발생기를 이용하여 진동 신호 소개ALS 개재 아크릴 챔버 (0.1 V의 피크 - 피크 전압 Vpp로 가진 예를 들면, 200Hz의 사인파). 정확하게 각 스피커로의 입력 전압을 측정하기위한 전압계를 사용한다. 참고 : 함수 발생기에서 Vpp로 판독 스피커에 전달되는 최종 전압이 다를 것입니다.
  5. 단일 지점 LDV를 조립하고 팬 틸트 헤드 삼각대에 광섬유 레이저 센서 헤드를 고정합니다. 각도 센서 헤드는 테이블 탑에 수직을 가리 키도록. 동축 케이블을 통해 데이터 수집 모듈 LDV 센서 헤드를 연결 한 후 USB를 통해 노트북에 모듈.
  6. 실리콘 막 (도 2b 및도 3)에 다양 소정 지점에서 수직으로 레이저 빔을 집중.
  7. 데이터 수집 소프트웨어를 이용하여, 중간 막 변위를 기록한다. "옵션"메뉴에서 "획득 설정"을 클릭합니다; 다음 측정 모드를 "FFT 변경221;. 다음으로, 기본 도구 모음에서 "연속 측정"을 클릭 한 후 변위를 기록 선택된 주파수 (그림 6D)에 형성하는 피크를 클릭합니다.
  8. 기판에 걸쳐 상대적 위치의 함수로서 정상 미드 막 변위 (0 w)를 그린다. 원래 8.5 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 표면 진동 프로파일의 3D 컬러 맵을 구축.

4. 진동 세포 배양

  1. MSC 유지 보수 미디어 / 4,000 ~ 5,000 세포의 초기 시딩 밀도 T150 조직 배양 플라스크에서 하위 문화 인간 골수 유래 중간 엽 줄기 세포.
  2. 세포 배양 7-8 일 후 (~ 85 % 컨 플루로) 등 accutase 같은 세포 해리 시약과 세포를 Trypsinize, 혈구, 원심 분리 (5 분 440 XG)를 사용하여 계산하고, 다시 중단 세포 펠릿 4.5 × 106 세포 / ml의 농도로 신선한 MSC 유지 매체.
  3. PCL의 scaffo를 담가70 % 에탄올 O / N.에 LD 용매를 증발 한 후 5-8 분 동안 UV 광 (254 ㎚ 인) 살균하는 지지체의 양면을 노출.
  4. 1 시간 동안 37 ° C에서 20 ㎍ / ml의 피브로넥틴 솔루션의 PCL의 발판을 적신다. 실리콘 막에 피브로넥틴 코팅 된 지지체를 삽입합니다. 1 단계에서 설명하는대로 생물 반응기를 조립합니다.
  5. 보안 PCL 발판에 균등하게 세포 현탁액의 40 μl를 배포합니다. 세포가 진동 챔버에 추가 1.5 ML 신선한 매체를 추가하기 전에 1 ~ 1.5 시간 동안 부착 할 수 있습니다.
  6. 문화 MSC 라덴 PCL 3 일간 정적으로 비계와 정적 문화가 완료되면 미디어를 새로 고칩니다.
  7. 세포 구조에 선정 진동 정권을 부과. 참고 : 예를 들어, 세포는 최대 7 일 동안 하루에 12 시간 ~ 40 ㎛, 아 0에서 200 Hz에서 진동 (의) 1 - 시간 -에 - 1 - 시간 - 오프를 실시한다. 진동 자극을받는 구조는 VIB 샘플 및 그 cultu로 지정정적으로 동일한 진동 챔버 빨간색은 정적 컨트롤 (합계) 역할을한다.

5. 생물 대한 평가

  1. 매일 각 챔버로부터 200 ㎕의 세포 배양 배지를 수집 (일 1, 3, 5, 7) 및 (800 μL 각) 함께 동일 샘플로부터 분취 풀.
  2. 매트릭스 메탈-1 (MMP1)와 제조 업체의 절차에 따라, 각각 MMP1 ELISA 개발 키트 및 히알루 론산 경쟁 ELISA 키트를 사용하여 HA의 세포 생산을 정량화. 한편, 이전에보고 된 ELISA 절차에 따라 수용성 엘라스틴 전구체의 생산을 분석 실험. 8
  3. 일 7시에 마지막 진동주기가 완료되면, 신속하게 날카로운 핀셋을 사용하여 진동 챔버에서 세포 구조를 제거하고 간단하게 감기 인산염 완충 생리 식염수 (PBS, 4 ° C)로 헹구어.
  4. 라이브 / 죽은 염색의 경우, 요오드화 프로피 디움 (PBS에서 1:2,000)와 구문을 배양하고SYTO-13 RT에서 5 분을 동시에 (PBS에서 1:1,000). 이미지 다 광자 공 초점 현미경으로 얼룩진 구조.
  5. 이와는 별도로, 드라이 아이스의 PBS-씻어서 세포 구조를 스냅인 동결 및 유전자 분석을위한 이전에보고 된 프로토콜 다음 전체 세포 RNA를 추출 할 수 있습니다. 9
  6. UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 추출 된 RNA의 수량과 품질을 확인합니다. 1.8 ~ 2.2의 A260/A280과 A260/A230 비율이 RNA 샘플은 다음의 qPCR 분석을 위해 사용됩니다.
  7. 역 시판 역전사 키트를 사용하여 cDNA를에 RNA (500 NG / 샘플)를 표기.
  8. 이전에 설명 된 절차에 따라 시판 PCR 마스터 믹스를 이용한 실시간 연속 검출 시스템에 대한 PCR 반응을 수행한다. 8
  9. 상업적 qPCR의 데이터 분석 소프트웨어를 사용 qPCR의 결과를 분석한다. 데이터 분석의 신뢰도를 보장하기 위해, 여러 표준 발현 유전자 (YWHAZ, TBP, PPIA)는 INT로서 이용된다ernal 컨트롤 및 특정 프라이머 효율성의 분산을 고려해야한다. 8

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Representative Results

전기 방사에 의해 제조 된 PCL 발판은 마이크론 크기의 중간 세공 및 4.7 μm의 (그림 4A)의 평균 직경이 무작위로 얽혀 섬유가 포함되어 있습니다. 높은 배율에서, 나노 그루브와 모공 개별 섬유 (그림 4B)에서 볼 수 있습니다. 피브로넥틴과 비계의 코팅은 친수성을 향상시키고 초기 세포 부착 / PCL 지지체 (게시되지 않은 관찰)의 확산을 용이하게한다.

원하는 주파수 (F, 100 ~ 300 Hz에서) 및 전압의 사인 파형 (Vpp로 : 0-0.125 V)의 각 진동 챔버 아래의 스피커 및 실리콘 막의 바닥의 종이 콘 사이에 밀폐 된 공기에 소개 미니 우퍼는 진동으로 구동된다. 공기의 진동은 또는 세포없이 PCL 지지체에 전달된다. LDV는 F와 관련 Vpp로에서 지지체의 진동 특성을 분석하는 데 사용고려 물의 굴절율 (1.33)을 복용. 20도 5 Vpp의 함수로서 PCL 지지체의 중심 (0 w) 정상의 변위를 도시 f. 진동 주파수는 기본적인 인간의 말하기 주파수를 반영하기 위해 선택된다. 21 테스트 한 모든 주파수 0-0.125 V의 범위가 0 승 사이의 선형 관계이며 Vpp로. 주어진 Vpp로에서, 100에서 300 Hz에서 F가 증가함에 따라 감소 0 승.

특정 진동 상태 (F = 200 Hz에서, Vpp로 = 0.1 V)를 추가 분석을 위해 선택됩니다. 시간 (도 6a)의 함수로서 속도 프로파일은 스피커에 도입 정현파 신호는 고 충실도와 PCL 지지체에 포착되는 것을 보여준다. PCL 발판의 중심은 52mm / sec의 최대 속도로 길이 방향으로 진동, 최대 66m / 초 2 (~ 6.7g)의 가속~ 40 μm의 정상 변위. 100, 300, 400, 500 Hz에서 고조파 신호는 기본 주파수 (200 Hz에서)에서보다 낮은 크기의 최소 주문입니다. Vpp의 값이 (0.15 V) 너무 높은 경우에는, 기본 주파수에 필적하는 강도의 다중 고조파 피크 (도 7)을 검출한다. 발판에 걸쳐 진동이 프로필은 PCL 표면의 반경 방향에 73 대표 점 (그림 3)의 총 일반 변위를 모니터링하여 만들어집니다. 3D 색상 맵 (그림 8)은 막 표면에서 감지 된 진동은 축 대칭 중심을 기준과 휴식 위치임을 보여줍니다. 통상 변위 막을 확보 중앙으로부터 에지까지 단조롭게 감소 발견된다.

PCL 지지체에 배양 한 중간 엽 줄기 세포가 선택한 진동 조건에서 배양. 7 - 다의 대상 셀자극의 y는 섬유 지지체는 cytocompatible했다 적용된 진동이 생존의 손실의 결과 것을 확인하고, 정적 컨트롤 (그림 9)와 유사한 생존 및 증식 특성을 유지한다. 진동 자극에 대한 세포 반응은 엘라스틴 (ELN) 등의 필수 성대 ECM 단백질의 발현, 히알루 론산의 합성 효소-1 (HAS1), COL3A1과 MMP1 (그림 10)의 측면에서 mRNA 수준에서 검사합니다. 진동의 정적 컨트롤을 기준으로 하루 7에서 ELN 식에 2.3 배 증가로 연결됩니다. 진동 자극은 적당히 COL3A1 발현을 증가 시켰습니다. 그것은 주요 ECM 리모델링 효소, HAS1MMP1의 발현이 크게 진동 신호에 의해 증강되는 것을 주목할 필요가있다. 특히, 동적 처리는 HAS1MMP1 ~를위한 1.7 ~ 16.3 배 증가 결과 7 일째에 자신의 정적 컨트롤에 식 (모두 P <0.05), 각각. 전반적으로, HAS1MMP1의 진동의 유도 효과는 7 일째에 3 일에서 향상되었습니다.

더 qPCR에 결과를 입증하기 위해 HA, 수용성 엘라스틴과 MMP1의 세포 생산은 번역 수준 (그림 11)에서 ELISA에 의해 정량화된다. 정적 컨트롤은 2.7 ± 0.2 ㎍ / mg)의 엘라스틴을 축적하는 반면 동적으로 배양 된 세포는 진동의 7 일 후에 수용성 엘라스틴 (건조 발판 중량 당) 4.2 ± 0.1 ㎍ / MG를 생산하고 있습니다. 평균적으로, 진동의 7 일 2.2 및 HA 4.7 배 증가하고 해당 정적 컨트롤을 기준으로 MMP1의 분비를 초래한다.

비디오 1 : J2 생물 반응기의 조립을 보여주는 3D 시뮬레이션. 비디오는 오토 데스크 3ds 맥스 디자인 (Congfei시에의 제공)에 의해 만들어졌습니다.

"FO : 유지 - together.within 페이지를 ="항상 "> 그림 1
. 그림 1은 확고한 슬리브 실리콘 막 제조에 사용되는 알루미늄 금형의 치수를 나타내는 사진 Ø :. 직경, D : 두께 / 깊이, H :. 신장 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
..도 2 흐름도 생물 반응기 어셈블리를 나타내는 (A) 개의 아암 형상 PCL 지지체의 사진, (B) 진동 챔버와 상기 챔버의 바닥에 집중 진동계 레이저 확보 PCL 지지체를 나타내는 사진; ( C)의 단면진동 챔버의 알보기. 1 : PCL 지지체 (레드); 2 : 실리콘 막 (시안); 3 : 알 고정 바; 4 : 최고 아크릴 블록; 5 : 하단 아크릴 블록; 6 : 미니 우퍼, 진동 모듈 (D) 측면도, (E) 전체 어셈블리를 보여주는 사진. 이 그림은 동양 등에서 수정되었습니다. 10 저작권 2013 메리 앤 LIEBERT, 주식 회사는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 단일 지점 LDV 측정을위한 반경 방향 표시 실리콘 막 그림.이 그림은 동양 등에서 수정되었습니다. 10 저작권 2013, 메리 앤 LIEBERT, 주식 회사


다른 배율에서 PCL 지지체의 그림 4. SEM 이미지. (A) 600X, (B) 7,000 X. 이 그림은 동양 등에서 수정되었습니다. 10 저작권 2013 메리 앤 LIEBERT, 주식 회사는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
도 5. 적용된 주파수의 함수 (100, 200, 300 헤르쯔) 및 구동 전압 (Vpp로 = 0-0.125 V)로서 (0 w) 실리콘 막의 중심에서 통상 변위.이 도면은 수정되었는지 통 등. 10 저작권 2013 엄마에게에서 공예 앤 LIEBERT, 주식 회사

그림 6
주파수의 함수로서 F와 실리콘 막의 중심 = 200 Hz에서 시간의 함수로서 Vpp로 = 0.1 V. (A) 속도 프로파일에서 검출도 6. 진동 특성. (B) 속도 프로파일. (C) 주파수의 함수로서 가속도. 주파수의 함수로서 (D) (0 w) 정상 변위. 이 그림은 통 등. 10에서 수정되었습니다. 저작권 2013 메리 앤 LIEBERT, 주식 회사는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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도 7. 200Hz의 사인파를 Vpp로 = 0.15 V.에서 미니 우퍼에 도입 될 때의 주파수의 함수로서 (0 w) 멤브레인의 중앙에 검출 된 변위 통상

그림 8
모든 위치에서 수집 한 일반 변위 데이터를 사용하여 표면의 그 리딩으로 구성 그림 8. 3D 색상 맵은 PCL의 발판에 표시.이 그림은 동양 등에서 수정되었습니다. 10 저작권 2013, 메리 앤 LIEBERT, 주식 회사

그림 9
라이브 / 죽은 염색으로 가시화 그림 9. 세포 생존 능력은, 진동의 7 일 후.이 그림은 동양 전자에서 수정 된T의 알. 10 저작권 2013 메리 앤 LIEBERT, 주식 회사는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10
성대 관련, ECM 유전자의 발현의 측면에서 진동 자극 10. 세포 반응을 그림. 관련 유전자 발현 (변경 배) 3 일 및 7 일째 (점선 기준)에서 각각의 정적 컨트롤로 정규화됩니다. * : 크게 변화 (P <0.05)의 기준에 대해 : 1 일 3, 7, # 사이에 유의 한 차이 (p <0.05). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차 나타내는 (SEM을, N = 4). 두 개의 꼬리 학생의 T - 테스트는 P <0.05로 유의하게 디 간주되는, 통계 분석에 사용됩니다fference (이하 동일). 이 그림은 동양 등에서 수정되었습니다. 10 저작권 2013 메리 앤 LIEBERT, 주식 회사

그림 11
건조 발판 중량 당 ECM 분자 7 일 통계 분석 및 VIB 조건에서 PCL 지지체에 배양 한 중간 엽 줄기 세포에 의해 생성 된 HA (A)의 그림 11. 생물 정량화, 수용성 ELN (B)와 MMP1 (C). 총 금액 (MG) . ± SEM 의미로, 대표 재판에서 N = 4 #을 표현됩니다 크게 향상 (p <0.05) 합계 컨트롤에 비해. 이 그림은 동양 등에서 수정되었습니다. 10 저작권 2013 메리 앤 LIEBERT, 주식 회사

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Discussion

체외에서 기능 성대 조직의 성공적인 설계는 다 능성 세포의 행동을 중재하기 위해 성대와 같은 미세 환경의 휴양이 필요합니다. 그것은 일반적으로 조직 또는 장기 구조 그들이 수행하는 데 필요한 기능을 반영하는 것으로 받아 들여진다. 성대 조직 22는, 발성 중에 발생 고주파 진동은 조직의 성숙을위한 중요한 것으로 제시된다. 성대 생물 반응기 배양 된 중간 엽 줄기 세포에 생리 학적으로 관련된 기계적인 신호를 소개하기 위해 설계되었습니다 동안 우리의 연구에서, PCL 지지체는 인대와 같은 구조 지원을 제공하는 데 사용됩니다. (J2) 여기에 설명 된 생물 반응기는 전자 기적으로 각각의 스피커를 통해 진동을 생성하고 배양 된 세포에 에너지의 공기 역학적으로 전송합니다. 우리의 이전의 설계에 비해, 18 현재 시스템은 fo를 허용 직접적 아니라 각 샘플 아래에 진동 자극의 소스 이동라보다 효율적인 에너지 변환. 결과적으로, 상당히 큰 통상의 변위 및 높은 가속도가 현재 시스템을 사용하여 달성된다. 모듈 형 설계는 다른 진동 챔버를 통해 시스템의 변화 및 ​​기계적 교란을 최소화 할 수 있습니다.

우리의 디자인은 진동 신호를 제공하기 위해 실리콘 막에 의존한다. 이는 멤브레인 무결성 및 균질성을 유지하는 것이 중요하다. 전구체 용액은 알루미늄 주형에 붓고 후, 틀면에 걸쳐 유리 슬라이드를 드래그하여 과량의 액체를 제거하는 것이 바람직하다. 혼입 된 기포없이 일관된 막은 경화 시간을 증가시키면서 온도를 낮추는 경화시켜 제조 할 수있다. 또한, 70 % 에탄올 용액을 일시적으로 경화 된 실리콘의 용이 한 제거를 허용하도록 알루미늄 막의 계면에 팽창 할 수있다. 3D 역동적 인 문화, 중앙에 위치하는 얇은 홈의 세포 구조를 수용하기 위해 전PCL 지지체가 둘레 진동 챔버에 고정 될 수 있도록 실리콘 막으로 성형들. 홈의 형상은 조정 가능하다; 따라서 셀룰러 구조체의 형상은 더 네이티브 성대의 형상을 모방하도록 적절히 조정될 수있다. 23 PCL 지지체 단단히 실리콘 막에 고정되지 않으면, 실리콘에 PCL에서 및 외부 영역에서 검출 LDV 신호 막 완벽하게 중복되지 않습니다. 생물 반응기를 조립하는 경우도 바람직하지 않은 동작을 방지하기 위해 및 챔버 변이 챔버를 최소화하기 위해 모든 구성 요소가 같은 정도로 확보 조여 것이 중요하다.

생물 반응기의 유용성을 확인하기 위해, 중간 엽 줄기 세포는 PCL 지지체에 재배되고 7 일 동안 진동 (OF) 단속을 실시한다. 하루에 몇 시간에 걸쳐 진동이 예를 들면, 전문 노래, 무거운 음성 사용자 말하는 조건을 재현하기 위해 이용된다 ERS 및 교사. 23 이전에보고 된 성대 생물 반응과는 달리, 우리는 세포에 해로운 효과 나 생리 외상의 원인이되지 않습니다.

200 Hz의 진동은 차동 중요한 ECM 구성 요소의 세포 생산을 조절하는 찾을 수 있습니다. 엘라스틴은 성대 LP에 걸쳐 발견된다 중요한 구조 단백질이며, 탄력성과 신축성을 부여. 같은 HA 등 24 간질 비정질 구성 요소, 적절한 조직의 점탄성과 흉터 형성의 예방의 유지에 기여한다. (25), (26) 엽 줄기 세포가 대상 치료의 7 일에 정적으로 배양 대응보다 엘라스틴의 상당히 높은 금액을 생산하고 있습니다. HA에 HAS1 및 ELISA 결과에 qPCR의 결과에 의해 확인 된 HA 생합성도 진동에 민감합니다. 이러한 연구 결과는 생물 반응기에 의해 활성화 된 진동 자극 안티 흉터 분자의 생산에 공헌하는 것이 좋습니다.

jove_content "> 균형 ECM 매출 동시 매트릭스 증착 및 분해에 의존합니다. 27 유형 III 콜라겐로드 베어링 특성을 가진 조직을 제공, 성대에있는 주요 망상 콜라겐 섬유입니다. 유전자 발현을 향상 여기에 적용 28 7 일간의 진동 COL3A1의,하지만 엘라스틴보다 훨씬 낮은 크기에. 따라서, 적용 진동이 차등 콜라겐 III과 엘라스틴의 합성에 관여 세포의 기계를 조절한다. 흥미롭게도, MMP1, 행렬 분해와 조직에 관련된 주요 MMPs의 중 하나가 리모델링 27 , 진동 신호에 매우 민감하다. 이러한 결과는 HA 매트릭스에 갇힌 세포에 의한 진동을 유발 MMP1의 상향 조절에 대한 이전의보고와 잘 일치. 29 전반적으로, 성대 생물 반응기에서 생성 된 진동 자극 뿌리깊은 항상성을 촉진하여 MSC의 기능을 중재 의 성대 같은 행렬.

위에모두, 여기에 제시된 새로운 성대 생물 반응기 동적 세포 배양이 재현 방식으로 수행 할 수 있도록, 모듈 및 사용자 친화입니다. 그러나, 몇 가지 제한 사항이 현재 디자인에 존재합니다. 먼저, 진동의 진폭은, J1 버전에서 개선되지만, 성대 조직에 비해 여전히 작다. 둘째, 우리의 생물 반응기는 정상적인 발성시 성대의 양자 간 충돌을 시뮬레이션하지 않습니다. 셋째, 우리의 섬유 PCL 지지체는 조직의 이방성을 반영하지 않습니다. 미래 연구는 더 나은 기본 발성 조건을 모방하기 위해 디자인을 개선하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 한편, 3D 동적 인 문화에 대한 최적의 정권은 체외에서 성공적으로 기능 성대 어셈블리에 대해 탐구한다.

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Disclosures

더 경쟁하는 금융 이익은 존재하지 않습니다.

Acknowledgements

우리는 공 촛점 이미징에 대한 자신의 훈련과 조언을 닥터 제프리 캐플란 감사합니다. 우리는 또한 SEM의 지원 중사 전자 현미경 연구소 박사 Chaoying 니켈 감사합니다. 이 작품은 건강 (NIDCD, R01DC008965 및 R01DC011377)의 국립 연구소에 의해 자금 지원됩니다. ABZ은 NSF 통합 대학원 교육 및 연구 훈련생 자금 (IGERT) 프로그램을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Sylgard 184 Cure the membrane at 100 °C for 2 hr
PCL Sigma Aldrich 440744-500G Mn ~80 kDa, dissolve O/N
Chloroform Sigma Aldrich C7559-5VL
Human bone marrow-derived MSCs Lonza PT-2501 Received with passage 2
MSC maintenance media Lonza PT-3001 10% FBS in basal media supplemented
with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent Life Technologies A11105-01
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500ML
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit R&D systems DY901
HA ELISA kit Echelon Biosciences  K-1200  
PBS Life Technologies 14190-136
Propidium iodide  Life Technologies P1304MP
Syto-13  Life Technologies S7575
QuantiTect reverse transcription kit  Qiagen 205311
SYBR Green PCR master mix Life Technologies 4309155
Replacement speaker DAYTON audio
(via Parts Express)
DS90-8 Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB
Ergo Micro torque screwdriver Mountz # 020377 Torque range: 20-120 cN·m
Stereo speaker selector RadioShack 40-244 Maximum power handling 50 W
Function generator  Agilent  33220A Frequency range 1 µHz-20 MHz
Power amplifier  PYLE audio PylePro PT2400 Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker
channels
Cell culture incubator  Thermo Fisher  Steri-Cult 3307
Syringe pump  New Era Pump Systems NE-300
High voltage power supply Spellman CZE 1000R Output voltage: 0-30 kV
Scanning electron microscope  JEOL-USA JSM-7400F
Desk gold sputter coater Denton Vacuum DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer  Polytec PDV-100 Non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system  Applied Biosystems ABI7300
Multiphoton confocal microscope Zeiss Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer  NanoDrop Products
via Thermo Scientific
ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software Polytec Acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software  OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software  Biogazelle V2.3
Aluminium alloy  McMaster-Carr Alloy 6061
Acrylic blocks McMaster-Carr
Polycarbonate anti-humidity chamber McMaster-Carr Impact-Resistant Polycarbonate
screws  McMaster-Carr
Electronic cable/wire
Medical grade PVC tubing US Plastic Corp. Tygon S-50-HL Clear, biocompatible
10 ml Syringe  Becton Dickinson 309604
21 G Blunt ended needle Small Parts NE-213PL-25 1-1/2" length
Alligator clip adapters  RadioShack 270-354 Fully insulated
8 mm Biopsy punch Sklar Surgical Instruments 96-1152 Sterile, disposable
12 mm Biopsy punch Acuderm (via Fisher Scientific) NC9998681
Tissue culture flasks Corning Cell culture treated

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References

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