新規声帯バイオリアクターの構築とキャラクタリゼーション

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zerdoum, A. B., Tong, Z., Bachman, B., Jia, X. Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor. J. Vis. Exp. (90), e51594, doi:10.3791/51594 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

上皮層、固有層(LP)と声帯の筋肉から構成される人間の声帯は、健全な生産のための音波への肺からの空気の流れを変換する専門的なソフトな組織である。1声帯が通常の発声時に定期的に振動し、 100〜300 Hzの範囲の基本周波数で最大30%の株を示す。2アダルト声帯のLPは、表面的な(SLP)で構成される傾斜構造、中間(ILP)と深い(DLP)の層である。さらに分類群上皮と粘膜層として、SLP、およびボーカル靭帯へのILPとDLPを兼ね備えています。3靭帯が成熟したコラーゲンとエラスチン繊維で強化されている間、SLP層は、まばらに分散された膠原繊維と主にアモルファスマトリックスが含まれています十分な強度を提供する。4新生児声帯の構造や力学は、その成熟した対応とは大きく異なります。もののメカニズム声帯の開発と成熟を調節するのは、まだ完全には理解されていない、実験的証拠は、発声由来の機械的ストレスの決定的な役割を指摘しています。

音声乱用、感染症、化学的刺激物および外科的手技を含むいくつかの医学的条件は、声帯を損傷する可能性があります。声帯障害は米国の人口の推定3から9パーセントに影響を与える。声帯障害のための現在の治療法は、5を限定され、幹細胞を用いた組織工学アプローチは、声帯機能を回復するための有望な戦略として浮上している。間葉系幹細胞(MSC)は、声帯組織工学のための主要な声帯の線維芽細胞に適切な代替物である。6-9幹細胞の運命の仕様およびその後の組織の発達、機械的条件があるから彼らが存在する特定のニッチによって媒介される重要な要因。10機械的な力は、組織形態形成Aの本質的な調節因子であるndは、特に日常的に負荷にさらされる組織に対するホメオスタシス、 図11の組織工学の観点から、それが生理学的に関連する機械的刺激への曝露は、細胞分化および組織特異的基質リモデリングを促進する幹ことが実証された。12-15

組織培養バイオリアクターは、インビトロ細胞又は組織成長のための所望の生理学的環境をシミュレートするように設計されている。声帯組織工学のためには、phonating声帯の機械的な環境を再現するために特に重要です。理想的な声帯バイオリアクターは、効果的に周波数、振幅、振動の持続時間にわたって容易な制御を可能にする、培養細胞への振動の手がかりを提供する必要があります。ティッツェらはマトリックスタンパク質の細胞産生を刺激するために、高周波(20〜200 Hz)の振動で静的ストレッチを組み合わせた声帯バイオリアクター(T1バイオリアクター )16を考案した。資料を使gこのバイオリアクター、ウェッブや同僚17は、ヒアルロン酸(HA)ベースのハイドロゲル中で培養皮膚線維芽細胞上で10日、100 Hzの振動の影響を研究した。振動を受けるの構築物は、スタティックコントロールと比較して、HA合成酵素2(HAS2)、デコリン、フィブロモおよびマトリックスメタロ-1(MMP1)の発現の上昇を示した。刺激作用は時間依存であることが見出された。さらに最近では、我々のグループ18は、パワーアンプ、関数発生器、同封スピーカと付着した細胞に振動空気圧を転送円周方向に固定されたシリコーン膜を使用して声帯バイオリアクター(J1バイオリアクター組み立てた。 J1バイオリアクターで培養新生児包皮線維芽細胞は、最大0.05%の面内歪みと、60、110又は300ヘルツの振動の1時間に供した。定量PCRの結果は、いくつかのECM遺伝子の発現が適度に変化させ、振動周波数に応答して変更されたことを示唆しと振幅。

これらのバイオリアクターの設計は、興味をそそるが、いくつかの制限を有する。たとえば、T1はシステムが達成可能な最大周波数を制限すること、機械的な連結用のコネクタやバーが多数を必要とします。さらに、細胞は、データ解釈を複雑に望ましくない機械的攪拌および流体の摂動を受けてもよい。 J1バイオリアクターは、一方では、比較的低いエネルギー変換効率を示し、かつユーザーフレンドリーではない。また、振動が頻繁に基本的なシリコーン膜から細胞を含んだ構造体を取り外す。 J1のバージョンと同じ原理に基づいて設計された、ここで報告されたJ2声帯バイオリアクターは、一貫性と再現性のために最適化されています。発声模倣振動が、MSC-人口繊維状のポリ(ε-カプロラクトン)(PCL)足場がeffectivあり、個々に取り付けた振動室内に空気力学的に生成されますイーリー確保。レーザドップラ振動計(LDV)は、ユーザーが膜/足場アセンブリの振動プロファイルを確認することができます。私たちのデモでは、MSCは7日間、12時間の毎日の合計1-HR対1-HRオフ(OF)のパターンで200 Hzの正弦波振動にさらされている。課された振動の合図に対する細胞応答を系統的に調べている。全体的に、J2声帯は、動的な細胞培養研究は、高いスループットと再現可能な方法で実施することができるように、ほとんどのユーザーフレンドリーな機能を提供します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1。バイオリアクターアセンブリ(ビデオ1)

  1. 予め決定された内側および外側の寸法( 図1)アルミニウム型(環状ダイス+スペーサピン)を作る。
  2. ステップ1.1から金型を用いて、シリコーン膜(直径1.5ミリメートル、 図1:42ミリメートル、厚さ)を作製強固なスリーブ(直径: 図1のスペーサピンによって形作ら12ミリメートル、厚さ〜0.25ミリメートル)での市販のシリコーンエラストマーキットを用いてミドル。
  3. 円形の開口部(直径24ミリメートル)でアクリルブロックのペア( 図2(4、5))を作る途中で、マッチング畝と溝を持つトップ(1.8センチメートル厚)とボトム(0.9センチメートル厚)ブロックを刻む。10
  4. ペアアクリルブロック間のシリコーン膜を挟む。一定の力(35 cNで·メートル)に設定されたマイクロトルクドライバーを使用して4隅のネジでアセンブリを固定します。結果として、水密、24メートルM、幅18ミリメートル、深振動室は、( 図2C)が作成されます。
  5. 底のアクリルブロックの角ネジの別のセットを介して振動室の下に3「拡張された範囲のミニウーファー( 図2D、8Ω/20W)をマウントします。この時点で、個々の振動モジュールが組み立てられる。
  6. 7追加の振動モジュールを複製。等間隔の円形の穴にスピーカーの拠点を置くことによって、2つの固定アルミニウムバー(40センチメートル×10センチメートル×2.5cm)のの1にそれらの4を固定(直径:10センチ、厚さ​​2センチ)のバーにカット。各円形の穴にアルミ棒の側面からネジを挿入することにより、各スピーカーを安定させる。
  7. 個別にスピーカーセレクターでスピーカーを制御します。セレクタの対応する出力にスピーカ本体に正と負の入力にワイヤを取り付けることにより、セレクタに、個々のスピーカーを接続します。スピーカセレクタtはからの信号を可能にする( 図2E)を一度に8つのすべてのスピーカーに到達するために、電力増幅器を通過した後、彼関数発生器。
  8. 防湿筐体に2室列、スピーカーセレクターや関連する電子部品を配置します。市販の細胞培養インキュベーター内で、アセンブリ全体を収容する。
  9. インキュベーターの背面にあるフィルタアセンブリを介してパワーアンプやスピーカーセレクターを接続する(医療グレードのPVCチューブを通して)メインケーブルを通します。

2。足場の作製と特性評価

  1. 15重量%の濃度でクロロホルム中のPCLペレットを溶解する。 21のG平滑末端針でキャップ10ミリリットル注射器に溶液をロードします。
  2. プログラム可能なシリンジポンプにシリンジをロックし、1ミリリットル/時の流量を設定してください。
  3. 〜18センチメートルの針先·コレクタの距離で、水平に針から渡ってアルミ箔で覆われたコレクタを配置します。
  4. 正Alliはをクランプ針の真ん中、アルミコレクタにグラウンド·ワニ口クリップにワニクリップは、それから15 kVの高電圧電源の電圧を設定してください。注意:高電圧、針からの距離を保つ。
  5. 順次シリンジポンプと、電源をオン;すぐにきれい/安定した繊維ジェット乾いたペーパータオルを使用して針の先端を取り囲む残留ポリマー溶液を除去し、テイラーコーン19が形成されている。
  6. 繊維は〜250〜300ミクロン(現在の紡糸条件の下で〜7時間)の厚さにアルミニウム集電体上に蓄積することができます。残留溶媒を除去するために1〜2日間真空乾燥器内の結果として足場を保管してください。
  7. 画像足場は、一貫性の繊維形態を示すために走査型電子顕微鏡を用いて、金でスパッタコーティング。10

3。バイオリアクターアセンブリおよび特性評価

  1. 2:4本のアーム(長さ:円筒状のディスク(直径8mm)をパンチ最初のディスクの外径をカットする12ミリメートル、直径生検パンチを使用して、紡糸したままのPCLマット( 図2A)のうちミリメートル)。そして、均等に腕を切断する場所を獲得するために、円形の刃の周りに等間隔4 2ミリメートル、長ノッチを作るために第二に、8ミリメートル生検パンチを使用しています。 8ミリメートルパンチで得点した後、外側の腕の端をカットするメスの刃を使用しています。延長アームを介してシリコーン膜の溝に足場を挿入します(ビデオ1)。優しくマイナスピンセットを用いて表面を押して、挿入された足場を平らに。
  2. レーザー反射を支援するために、PCL足場に薄いAl箔(8ミリメートルX 2ミリメートル、直交形状、 図2B)の小片を取り付けます。
  3. 振動チャンバー内に(ステップ1.4で詳述したように)組み立てシリコーン膜/ PCL足場を固定します。振動の前に、PCL足場を水和するために、チャンバー内に1.5ミリリットル水を加える。
  4. 関数発生器を用いて、振動記号を紹介挟まれたアクリルチャンバーにALS(0.1 Vのピーク·ツー·ピーク電圧、VPPが例えば、200 Hzの正弦波、)。正確に各スピーカー入力の電圧を測定するために電圧計を使用しています。注:ファンクション·ジェネレータからのVppの読み出しは、スピーカーに送ら最終的な電圧とは異なります。
  5. シングルポイントLDVを組み立て、パン·チルトヘッド、三脚への光ファイバレーザセンサヘッドを固定します。角度センサヘッドは、テーブルトップに対して垂直に向くように。同軸ケーブルを介してデータ取得モジュールにLDVセンサヘッドを接続してUSB経由でノートPCへのモジュール。
  6. シリコーン膜上の種々の所定の点( 図2B及び図3)に垂直にレーザ光 ​​を当てる。
  7. データ収集ソフトウェアを使用して、中膜の変位を記録する。 「オプション」メニューから「取り込み設定」をクリックします。次いで、FFT」に測定モードを変更する221;。次に、メインツールバーの「連続測定」をクリックして変位を記録するために選択された周波数( 図6D)にフォームのピークをクリックします。
  8. 基板を横切る相対位置の関数として通常の中間膜変位(0 w)をプロットする。制作8.5データ解析ソフトウェアを用いた表面の振動プロファイルの3Dマップを構築する。

4。振動細胞培養

  1. MSC維持培地中/ cm 2で4,000〜5,000細胞の初期播種密度でのT150組織培養フラスコ中で継代培養ヒト骨髄由来MSC。
  2. 細胞培養の7-8日後(〜85%コンフルエントになるまで)、例えばをAccutaseなどの細胞解離試薬で細胞をトリプシン処理し、血球計、遠心分離(5分間、440×gで)を用いてカウントし、再懸濁細胞ペレット中4.5×10 6細胞/ mlの濃度で新鮮MSCの維持培地。
  3. PCL scaffoを浸す70%エタノールのO / Nでのld溶媒を蒸発させた後、5〜8分間殺菌UV光(254nm)への足場の両面を露出させる。
  4. 1時間、37℃で20μg/ mlのフィブロネクチン溶液中でのPCL足場を浸します。シリコーン膜にフィブロネクチン被覆の足場を挿入します。ステップ1で詳述したようバイオリアクターを組み立てる。
  5. 均等に保護されたPCL足場上の細胞懸濁液40μLを配布します。細胞は振動室に追加の1.5ミリリットル新鮮な培地を添加する前に、1〜1.5時間、添付することができます。
  6. 文化3日間、静的に、MSCを含んだPCL足場と静置培養の完了時にメディアを更新します。
  7. 携帯構築物、選択した振動体制を課す。注:例として、細胞は最大7日間、1日12時間〜40μmのAW 0と200 Hzの振動(OF)1-HR対1-HRオフに供される。振動刺激を受けるの構築物は、バイブサンプルと、それらのcultuとして指定されている同一の振動チャンバー内の静的に赤がスタティックコントロール(STAT)として機能します。

5。生物評価

  1. 一日おきに各チャンバから200μlの細胞培養培地を収集し(1日目、3、5、7)(800μlの各々)は一緒になって同じサンプルからのアリコートをプールする。
  2. メーカーの手順に従って、それぞれ、MMP1 ELISA開発キットおよびヒアルロン酸競合ELISAキットを使用してマトリックスメタロ-1(MMP1)とHAの細胞産生を定量化する。一方、以前に報告されたELISAの手順に従って、可溶性エラスチン前駆体の産生をアッセイする。8
  3. 7日目の最後​​の振動周期が完了すると、すぐに鋭利なピンセットを用いて振動チャンバからの細胞構築物を除去し、短時間冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS、4℃)でそれらをすすぐ。
  4. 生/死染色のために、ヨウ化プロピジウム(PBS中1:2,000)を有する構築物をインキュベートし、SYTO-13 RTで5分間、同時に(PBS中1:1000)。画像多光子共焦点顕微鏡を用いて染色し構築します。
  5. これとは別に、ドライアイス上で、PBS-すすい携帯構文スナップ凍結し、遺伝子解析のための以前に報告されたプロトコールに従って、全細胞RNAを抽出します。9
  6. 紫外可視分光光度計を用いて抽出したRNAの量と質を確認してください。 1.8〜2.2のA260/A280およびA260/A230比を有するRNA試料をその後のqPCR分析のために使用される。
  7. リバース市販の逆転写キットを用いてcDNAにRNA(500 ngの/試料)を転写する。
  8. 先に詳述した手順に従って、市販のPCRマスターミックスを用いたリアルタイム配列検出システム上でPCR反応を行う。8
  9. 商用のqPCRデータ解析ソフトウェアを用いて定量PCR結果を分析する。データ分析の信頼性を確保するために、複数の参照遺伝子(YWHAZ、TBP、PPIA)はintとして使用されるernalコントロール、および特異的プライマー効率の分散が考慮される。8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

エレクトロスピニングにより作製したPCL足場は4.7ミクロン( 図4A)の平均直径がミクロンサイズの間質性毛穴やランダムに絡み合った繊維を含む。高倍率では、ナノスケールの溝や孔は、個々の繊維( 図4B)上に表示されます。フィブロネクチンと足場のコーティングが親水性を向上させ、PCL足場(未発表の観察)に広がる/初期細胞接着を容易にします。

所望の周波数(f、100〜300ヘルツ)と電圧を有する正弦波形(電圧Vpp:0から0.125 V)を各振動室の下スピーカ、シリコーン膜の底部とのコーン紙の間に閉じ込められた空気に導入されるミニウーファーは振動に追い込まれている。空気振動は、または細胞なしPCL足場に送達される。 LDVは、所与のfおよびVppに足場の振動特性を分析するために使用される口座への水の屈折率(1.33)を服用。20 図5は、Vppの関数としてのPCL足場の中央で(0ワット)通常の変位を示しています f。振動周波数は、基本的話す周波数を反映するように選択される。21試験した全ての周波数で0から0.125 Vの範囲でありw 0との間の線形関係があり、Vppは。与えられたVppに、100〜300 HzのF増加すると0が減少ワット。

特定の振動条件状態(f = 200Hzで、VppがV = 0.1)をさらなる分析のために選択される。時間( 図6A)の関数としての速度プロファイルは、スピーカに導入正弦波信号を高忠実度でPCL足場によって捕捉されることを示している。 PCL足場の中心は、52ミリメートル/秒のピーク速度で縦方向に振動すると、ピーク66メートル/秒2(〜6.7グラム)を加速し、〜40μmの垂直変位。 100、300、400および500 Hzの高調波信号は、基本周波数(200 Hz)の時よりも低い大きさの少なくとも順序である。 Vppの値(0.15 V)が高すぎる場合は、基本周波数に匹敵する強度の複数の高調波ピークが( 図7)が検出される。足場を横切る振動プロファイルは、PCL面の半径方向上の73の代表点( 図3)の合計から通常の変位を監視することによって作成される。 3Dカラーマップ( 図8)は、膜の表面上で検出された振動は中心に対して線対称とその静止位置にあることを示している。通常の変位は、膜が固定される中心から縁部に向かって単調に減少することが見出されている。

PCL足場上で培養したMSCは、選択された振動条件下で培養される。 7-DAを受けた細胞刺激のYは、繊維質足場は細胞適合性であり加わる振動は、生存能力を損なうことなくもたらしたことを確認し、静的コントロール( 図9)と同様の生存率および増殖特性を維持する。振動刺激に対する細胞応答は、エラスチン(ELN)などの必須声帯ECMタンパク質の発現、ヒアルロン酸合成酵素-1(HAS1)、COL3A1およびMMP1( 図10)の点でmRNAレベルで調べている。振動の静的コントロールと比較して7日目のELN 2.3倍の増加をもたらす。振動刺激も適度にCOL3A1発現を増加させた。それは、主要なECMリモデリング酵素、HAS1及びMMP1の発現は有意に振動信号によって増強されることは注目に値する。具体的には、動的な治療がHAS1MMP1のための〜1.7と〜16.3の倍に増加した 7日目に、そのスタティックコントロールの上の式(ともにP <0.05)、それぞれ。全体的に、HAS1MMP1に振動の誘導効果は、7日目まで3日から強化されました。

さらに、定量PCRの結果を立証するために、HA、可溶性エラスチンおよびMMP1の細胞産生は、翻訳レベル( 図11)でのELISAにより定量する。静的コントロールは、わずか2.7±0.2μgの/ mgの蓄積のに対し、動的に培養された細胞は、振動の7日後に4.2±0.1μgの/ MG(乾燥足場重量あたり)水溶性エラスチンを生成する)エラスチン。平均すると、振動の7日間には2.2-およびHAにおける4.7倍の増加とそれに対応する静的な対照と比較してMMP1分泌をもたらす。

ビデオ1:J2バイオリアクターの組み立てを示す3次元シミュレーション。ビデオは、Autodesk 3ds Maxのデザイン(Congfei謝提供 )によって作成されました。

「FO:キープtogether.withinページ= "常に"> 図1
図1写真は定着したスリーブとシリコーン膜を製造するために使用されるアルミニウム金型の大きさを示す。(O)。直径d:厚さ/奥行き、H:高さこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2
バイオリアクターアセンブリを示す、図2のフローチャート(A)四分岐状PCL足場の写真で、(B)振動チャンバとチャンバの底部に焦点を当てたレーザー振動計に固定PCL足場を示す写真、( C)の断面振動室のAl眺め。 1:PCL足場(赤); 2:シリコーン膜(シアン); 3:アル·静止バー; 4:トップアクリル系ブロック; 5:下のアクリルブロック; 6:ミニウーファー;振動モジュールの(D)は側面図、(E)アセンブリ全体を示す写真。この図は、トングから変更されている。10著作権2013、メアリーアンはLiebert、Inc。は、 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図3
図3。一点LDV測定のための放射状にマークされたシリコーン膜のイラスト。この図は、トング 10著作権2013、メアリーアンはLiebert、Inc。から変更されている


図4の異なる倍率でのPCL足場のSEM像(A)600X、(B)7,000 X.この図は、トングから変更されている。10著作権2013、メアリーアンはLiebert、Inc。は、 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図5
図5印加周波数(100,200および300 Hz)の駆動電圧(VppがV = 0から0.125まで)の関数として(0 w)のシリコーン膜の中心における垂直変位。この図は、改変されているトング 10著作権2013、MAから RYアンはLiebert、株式会社

図6
周波数の関数として図6時間の関数としてのfは = 200 HzおよびVppが= 0.1 V.(A)速度プロファイルを有するシリコーン膜の中央で検出された振動特性(B)速度プロファイル(C)周波数の関数としての加速度周波数の関数としての(D)(0 w)のノーマル変位。この図は、トング 10から変更されている。著作権2013年、メアリー·アンはLiebert、Inc。は、 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

/ 51594fig7highres.jpg "/>
図7 200Hzの正弦波電圧Vpp = 0.15 Vでミニウーハーに導入される周波数の関数として(0 w)をメンブレンの中央で検出されたノーマル変位

図8
すべての場所から収集された、通常の変位データを用いた表面グ ​​リッド化により構築図8。3次元カラーマップは、PCL足場上にマーク。この図は、トングから変更されている。10著作権2013、メアリーアンはLiebert、株式会社

図9
図9細胞生存率は、振動の7日後に、生/死染色によって可視化した。この図はトング電子から変更されているTら。10著作権2013、メアリーアンはLiebert、Inc。は、 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図10
図10。声帯関連する、ECM遺伝子の発現の観点から振動刺激に対する細胞応答。相対的な遺伝子発現は、(変化倍率)3日目と7日目(破線ベースライン)で、それぞれの静的コントロールに正規化されている。 **:有意に変化した(p <0.05)、ベースラインに対して:3日目および7、#との間の有意差(p <0.05)。データは(SEM、n = 4)の平均の平均±標​​準誤差を表す。両側スチューデントのt検定はp <0.05を有意として考慮されているジと共に、統計分析のために使用されるfference(下記と同じ)。この図は、トングから変更されている。10著作権2013、メアリーアンはLiebert、株式会社

図11
乾燥足場重量あたりのECM分子の7日間、statおよびバイブの条件で、PCL足場上で培養したMSCによって生成HA(A)の図11。生化学的定量化、可溶性ELN(B)、およびMMP1(C)の合計量(mg)代表トライアルから平均±SEMとして表され、N = 4ている#:。大幅スタット対照と比較した(P <0.05)強化された。この図は、トングから変更されている。10著作権2013、メアリーアンはLiebert、株式会社

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

in vitroでの機能的な声帯組織の成功エンジニアリングは、多能性細胞の挙動を媒介するために声帯のような微小環境の再作成を必要とします。これは、一般的に組織または器官の構造は、それらが実行するために必要な機能を反映していると認められている。声帯組織の場合22は 、発声中に発生する高周波振動は、組織の成熟に重要であることが提案されている。声帯バイオリアクター培養したMSCに生理学的に関連する機械的な信号を導入するように設計されている我々の研究では、PCL足場は、靭帯様構造的支持を提供するために使用される。ここで説明するバイオリアクター(J2)は、個々のスピーカーから電磁振動を作成し、培養細胞にエネルギー空気力学的に転送します。我々の以前の設計に比べて、18の現在のシステムは、foができるように、直接、各サンプルウェルの下に振動刺激の源を移動RAより効率的なエネルギー変換。その結果、有意に大きい垂直変位と高い加速は、現在のシステムを使用して達成される。モジュラー設計は、異なる振動室全体のシステムの変動や機械的摂動を最小限に抑えることができます。

我々の設計は、振動信号を送達するシリコーン膜に依存している。これは、膜の完全性および均一性を維持することが重要である。前駆体溶液をアルミニウム型に注入された後、金型表面を横切ってスライドガラスをドラッグして過剰の液体を除去することが望ましい。任意の閉じ込められた気泡のない一貫した膜は、硬化時間を増加させながら硬化温度を低下させることによって製造することができる。さらに、70%エタノール溶液を一時的に硬化したシリコーンの容易な除去を可能にするためにアルミニウム界面で膜を膨潤させるために使用することができる。 3Dダイナミック文化、中央に配置された細い溝のための細胞の構造に対応するため、IPCL足場は末梢振動チャンバ内に固定することができるように、シリコーン膜に成形sの。溝の形状は調整可能です。従って、細胞性構築物の形状は、より良好な天然声帯の形状を模倣するためにそれに応じて調整することができる。23 PCL足場がしっかりシリコーン膜に固定されていない場合、PCLで、シリコーン上の外側の領域で検出されたLDV信号を膜が完全にオーバーラップしない。バイオリアクターを組み立てる際には、望ましくない動作を回避するために、チャンバー変動にチャンバを最小にするようにすべてのコンポーネントが同じ程度に固定され、締め付けられることが重要である。

バイオリアクターの有用性を検証するために、MSCは、PCL足場上で培養され、7日間振動(OF)間欠的に供される。一日数時間かけて振動OF 例えば 、プロ歌い、重音声ユーザの話す状態を再現するために使用される ERSと教師が。23以前に報告された声帯のバイオリアクターとは異なり、我々は、細胞に有害な影響や生理的外傷を引き起こさない。

200 Hzの振動が示差的に重要なECM成分の細胞産生を調節することが見出されている。エラスチンは、声帯のLPで発見された重要な構造タンパク質であり、弾力性と弾力性を付与する。HAなど24間質アモルファスコンポーネントは、適切な組織粘弾性の維持および瘢痕形成の防止に貢献しています。25,26 MSCは受ける治療の7日間に静置培養の対応よりもエラスチンの有意に高い量を生成します。 HA上のHAS1及びELISAの結果に定量PCRの結果によって確認されるように、HA生合成は、また、振動に敏感です。これらの知見は、バイオリアクターで有効に振動刺激は抗瘢痕分子の産生を助長していることを示唆している。

jove_content ">バランスのECMターンオーバーが同時マトリックス沈着や劣化に依存しています。27 III型コラーゲンは、耐荷重性を有する組織を提供し、声帯に見られる主要な網状コラーゲン繊維である。ここに適用される28 7日間の振動が遺伝子発現を増強COL3A1のが、エラスチンよりもはるかに低い大きさであるので、差動的に印加される振動がIII型コラーゲンおよびエラスチンの合成に関与する細胞機構を調節する。興味深いことに、MMP1、マトリックス分解および組織に関与する主要なMMPの一つは改造27 、振動刺激に非常に敏感である。これらの結果は、HAマトリックスに捕捉された細胞による振動によって誘発されるMMP1のアップレギュレーションにこれまでの報告とよく一致。29全体的に、声帯バイオリアクターによって生成された振動刺激を深く恒常性を促進することによって、MSC機能を媒介声帯のような行列の。

以上すべて、ここで紹介する新たな声帯バイオリアクターは、動的な細胞培養は、再現可能な方法で実行することができるように、モジュール式で使いやすいです。しかし、いくつかの制限は、現在のデザインに存在。まず、振動振幅は、J1バージョンから改善したものの、声帯組織と比較してまだ小さい。第二に、私たちのバイオリアクターは、通常の発声時の声帯の二国間の衝突をシミュレートしていません。第三に、私たちの繊維状のPCL足場は、組織の異方性を反映していない。今後の課題は、より良いネイティブの発声条件を模倣するように設計を改善に取り組んでいます。一方、3次元動的培養のための最適な体制は、in vitroでの成功の機能声帯組み立てに検討されます。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

競合する経済的利益は存在しません。

Acknowledgements

我々は、共焦点イメージングの彼のトレーニングやアドバイス博士ジェフリーカプランに感謝します。また、SEMケアにケック電子顕微鏡研究室博士Chaoyingニッケルに感謝します。この作品は、健康(NIDCD、R01DC008965とR01DC011377)の国立研究所によって資金を供給される。 ABZは資金調達のためのNSFの統合大学院教育研究見習(IGERT)プログラムを認めるものです。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Sylgard 184 Cure the membrane at 100 °C for 2 hr
PCL Sigma Aldrich 440744-500G Mn ~80 kDa, dissolve O/N
Chloroform Sigma Aldrich C7559-5VL
Human bone marrow-derived MSCs Lonza PT-2501 Received with passage 2
MSC maintenance media Lonza PT-3001 10% FBS in basal media supplemented
with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent Life Technologies A11105-01
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500ML
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit R&D systems DY901
HA ELISA kit Echelon Biosciences  K-1200  
PBS Life Technologies 14190-136
Propidium iodide  Life Technologies P1304MP
Syto-13  Life Technologies S7575
QuantiTect reverse transcription kit  Qiagen 205311
SYBR Green PCR master mix Life Technologies 4309155
Replacement speaker DAYTON audio
(via Parts Express)
DS90-8 Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB
Ergo Micro torque screwdriver Mountz # 020377 Torque range: 20-120 cN·m
Stereo speaker selector RadioShack 40-244 Maximum power handling 50 W
Function generator  Agilent  33220A Frequency range 1 µHz-20 MHz
Power amplifier  PYLE audio PylePro PT2400 Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker
channels
Cell culture incubator  Thermo Fisher  Steri-Cult 3307
Syringe pump  New Era Pump Systems NE-300
High voltage power supply Spellman CZE 1000R Output voltage: 0-30 kV
Scanning electron microscope  JEOL-USA JSM-7400F
Desk gold sputter coater Denton Vacuum DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer  Polytec PDV-100 Non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system  Applied Biosystems ABI7300
Multiphoton confocal microscope Zeiss Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer  NanoDrop Products
via Thermo Scientific
ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software Polytec Acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software  OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software  Biogazelle V2.3
Aluminium alloy  McMaster-Carr Alloy 6061
Acrylic blocks McMaster-Carr
Polycarbonate anti-humidity chamber McMaster-Carr Impact-Resistant Polycarbonate
screws  McMaster-Carr
Electronic cable/wire
Medical grade PVC tubing US Plastic Corp. Tygon S-50-HL Clear, biocompatible
10 ml Syringe  Becton Dickinson 309604
21 G Blunt ended needle Small Parts NE-213PL-25 1-1/2" length
Alligator clip adapters  RadioShack 270-354 Fully insulated
8 mm Biopsy punch Sklar Surgical Instruments 96-1152 Sterile, disposable
12 mm Biopsy punch Acuderm (via Fisher Scientific) NC9998681
Tissue culture flasks Corning Cell culture treated

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Titze, I. R. Mechanical-Stress in Phonation. J. Voice. 8, 99-105 (1994).
  2. Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
  3. Gray, S. D. Cellular physiology of the vocal folds. Otolaryngol. Clin. N. Am. 33, 679-698 (2000).
  4. Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring. J. Voice. 16, 96-104 (2002).
  5. Hansen, J. K., Thibeault, S. L. Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring. J. Voice. 20, 110-120 (2006).
  6. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  7. Hanson, S. E., et al. Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts. Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).
  8. Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds. Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).
  9. Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor. Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).
  10. Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).
  11. Wang, J. H., Thampatty, B. P. Mechanobiology of Adult and Stem Cells. Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).
  12. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).
  13. Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
  14. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).
  15. Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli. Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).
  16. Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
  17. Kutty, J. K., Webb, K. Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).
  18. Farran, A. J. E., et al. Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System. J. Tissue Eng. Regen. Med. (2011).
  19. Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
  20. Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).
  21. Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional. J. Voice. 5, 310-315 (1991).
  22. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. Faseb J. 20, 811-827 (2006).
  23. Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
  24. Moore, J., Thibeault, S. Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease. J. Voice. 26, 269-275 (2012).
  25. Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar. J. Voice. 17, 377-383 (2003).
  26. Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. Vocal fold wound healing: A review for clinicians. J. Voice. 20, 432-442 (2006).
  27. Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).
  28. Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers. Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).
  29. Kutty, J. K., Webb, K. Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria. Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics