Construction et caractérisation d'un pli bioréacteur roman Vocal

1Biomedical Engineering Program, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware
Published 8/01/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Zerdoum, A. B., Tong, Z., Bachman, B., Jia, X. Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor. J. Vis. Exp. (90), e51594, doi:10.3791/51594 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Le pli vocal humain, composé d'une couche épithéliale, la lamina propria (LP) et le muscle vocalis, est un tissu mou spécialisé qui convertit le flux d'air dans les poumons en ondes acoustiques pour produire des sons. 1 Cordes vocales oscillent régulièrement pendant la phonation normale, présentant des souches de jusqu'à 30% à des fréquences fondamentales allant de 100-300 Hz. 2 adultes cordes vocales LP est une structure composée d'un gradient superficiel (SLP), un intermédiaire (PLI) et un (DLP) couche profonde. D'autres groupes de classification la épithélium et le SLP que la couche de muqueuse, et combine l'ILP et DLP dans le ligament vocal. 3 La couche de SLP contient essentiellement une matrice amorphe avec des fibres de collagène peu dispersés, alors que le ligament est enrichie en collagène mature et les fibres d'élastine pour offrir une résistance suffisante. 4 La structure et la mécanique des cordes vocales nouveau-nés varient considérablement de leurs homologues adultes. Bien que le mécanismes régulant le développement de cordes vocales et de la maturation ne sont pas encore entièrement compris, la preuve expérimentale a souligné les rôles qui définissent des contraintes mécaniques vocalisation dérivés.

Plusieurs conditions médicales, y compris l'abus de la voix, des infections, des produits chimiques irritants et des interventions chirurgicales, peuvent endommager la corde vocale. Troubles des cordes vocales affectent environ 3-9% de la population américaine. Méthodes actuelles de traitement pour les troubles des cordes vocales sont limitées 5 et un tissu approche d'ingénierie à base de cellules souches est apparue comme une stratégie prometteuse pour la restauration de la fonction de cordes vocales. cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont une alternative appropriée aux primaires fibroblastes des cordes vocales pour voix génie pli de tissu. 6-9 spécification du destin des cellules souches et le développement du tissu ultérieure sont médiés par le créneau spécifique qu'ils résident dans, dont l'état mécanique est un facteur essentiel. 10 forces mécaniques sont des régulateurs essentiels du tissu morphogenèse unnd homéostasie, en particulier pour les tissus qui sont couramment soumis à une charge. 11 Du point de vue de l'ingénierie tissulaire, il a été démontré que l'exposition à des stimulations mécaniques physiologiquement pertinentes favorise la différenciation des cellules souches et spécifique d'un tissu remodelage de la matrice 12 à 15.

bioréacteurs de culture de tissus sont conçus pour simuler l'environnement physiologique désirée pour la croissance des cellules ou des tissus in vitro. Pour vocal génie pli de tissu, il est particulièrement important de recréer l'environnement mécanique des cordes vocales phonating. Une corde vocale bioréacteur idéal devrait fournir efficacement des signaux vibratoires de cellules en culture, ce qui permet un contrôle facile sur la fréquence, l'amplitude et la durée des vibrations. Et ses collègues ont conçu titze un pli bioréacteur vocal (T1 bioréacteur) 16 qui combine étirement statique à haute fréquence (20 à 200 Hz) des oscillations de stimuler la production cellulaire de protéines de la matrice. Using ce bioréacteur, Webb et ses collègues 17 ont étudié les effets de 10 jours, les vibrations de 100 Hz sur les fibroblastes dermiques cultivées dans un acide hyaluronique (HA) à base d'hydrogel. Les constructions soumises à des vibrations présentaient une expression élevée de HA synthase-2 (HAS2), la décorine, la fibromoduline et la métalloprotéinase matricielle-1 (MMP1), par rapport aux témoins statiques. Les effets stimulants sont révélés être dépendants du temps. Plus récemment, notre groupe de 18 a réuni une fois bioréacteur vocal (J1 bioréacteur) en utilisant un amplificateur de puissance, un générateur de fonctions, un haut-parleur clos et une membrane de silicone circonférence ancrée qui transfère l'air oscillant aux cellules attachées. Des fibroblastes de prépuce néonatal cultivées dans le bioréacteur à J1 ont été soumis à 1 h de vibration à 60, 110 ou 300 Hz, avec une déformation dans le plan d'au plus 0,05%. Les résultats de qPCR ont suggéré que l'expression de certains gènes de la MEC a été légèrement modifiée en réponse à des fréquences vibratoires variéeset amplitudes.

Ces conceptions de bioréacteurs, tandis intrigante, présentent plusieurs limites. Par exemple, le système T1 nécessite un grand nombre de connecteurs et de barres de couplage mécanique, ce qui limite les fréquences maximales réalisables. De plus, les cellules peuvent être soumises à une agitation mécanique indésirable et fluide perturbation qui complique l'interprétation des données. Le bioréacteur à J1, d'autre part, présente une efficacité relativement faible de conversion d'énergie et n'est pas facile à utiliser. En outre, les vibrations se détache souvent les constructions cellulaires chargées de la membrane de silicone sous-jacent. Le J2 cordes vocales bioréacteur rapporté ici, conçu sur la base du même principe que la version J1, est optimisée pour l'uniformité et la reproductibilité. Les vibrations de la phonation imitant sont générés aérodynamique dans des chambres de vibrations équipés individuellement où poly fibreux MSC-peuplé (ε-caprolactone) (PCL) échafaudages sont effectively fixé. Laser Doppler Vibrométrie (LDV) permet à l'utilisateur de vérifier le profil vibratoire de l'ensemble membrane / échafaud. Dans notre démonstration, les CSM sont exposés à 200 Hz vibrations sinusoïdales avec un (DE) modèle 1-hr-sur-1-h-off pour un total de 12 heures par jour pendant 7 jours. Les réponses cellulaires aux signaux vibratoires imposées sont étudiées systématiquement. Dans l'ensemble, la corde vocale J2 fournit la plupart des fonctionnalités conviviales, permettant des études de culture cellulaire dynamique à être menées dans un débit élevé et de façon reproductible.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Assemblée bioréacteur 1. (Vidéo 1)

  1. Faire un moule en aluminium (de filière circulaire + entretoise broches) avec des dimensions intérieures et extérieures prédéterminées (Figure 1).
  2. Utilisation du moule à partir de l'étape 1.1, la fabrication d'une membrane en silicone (diamètre: 42 mm, épaisseur: 1,5 mm, figure 1) avec un manchon retranché (diamètre: 12 mm, épaisseur ~ 0,25 mm, formée par la broche d'écartement sur ​​la figure 1) en le milieu à l'aide d'un kit d'élastomère de silicone disponible dans le commerce.
  3. Faites une paire de blocs acryliques (Figure 2 (4, 5)) avec une ouverture circulaire (diamètre: 24 mm) au milieu, graver le haut (1,8 cm d'épaisseur) et bas (0,9 cm d'épaisseur) des blocs avec des crêtes correspondant et rainures 10.
  4. Prendre en sandwich la membrane de silicone entre les blocs acryliques appariés. Fixez l'ensemble avec quatre vis d'angle à l'aide d'un tournevis dynamométrique micro fixé à une force constante (35 cN · m). En conséquence, un étanche à l'eau, 24 mm de large et 18 mm chambre de vibration profonde est créée (figure 2C).
  5. Monter une "gamme étendue mini-woofer 3 (figure 2D, 8 Ω/20 W) sous la chambre de vibration par un autre jeu de vis de coin sur le bloc acrylique fond. A ce point, un module de vibration individuelle est assemblé.
  6. Répliquer sept modules de vibration supplémentaires. Apposer quatre d'entre eux à l'une des deux barres d'aluminium fixes (40 cm x 10 cm x 2,5 cm) en plaçant les bases d'enceintes dans des trous circulaires régulièrement espacées (diamètre: 7 cm, épaisseur: 2 cm) découpées dans les bars. Stabiliser chaque haut-parleur en insérant une vis dans le côté de la barre d'aluminium dans chaque trou circulaire.
  7. Contrôler individuellement les haut-parleurs par un sélecteur de haut-parleur. Connectez les enceintes individuelles pour le sélecteur de fixer des fils aux entrées positives et négatives sur le corps du haut-parleur, puis aux sorties correspondantes sur le sélecteur. Le sélecteur de haut-parleur permet au signal de til générateur de fonction, après avoir traversé un amplificateur de puissance, pour atteindre les huit haut-parleurs à la fois (figure 2E).
  8. Placez les deux tableaux de la chambre, le sélecteur de haut-parleur et l'électronique associée à un boîtier anti-humidité. Loger la totalité de l'ensemble dans un incubateur de culture cellulaire du commerce.
  9. Nourrir les câbles principaux (à travers un tube de PVC de qualité médicale) reliant l'amplificateur de puissance et le sélecteur d'enceinte à travers l'ensemble de filtre à l'arrière de l'incubateur.

2. Fabrication d'échafaudage et caractérisation

  1. Dissoudre pastilles PCL dans le chloroforme à une concentration de 15% en poids. Chargez la solution dans une seringue de 10 ml surmonté d'une aiguille émoussée 21 G.
  2. Verrouiller la seringue sur une pompe à seringue programmable et régler le débit à 1 ml / h.
  3. Placez le collecteur de papier d'aluminium aluminium en face de l'aiguille horizontalement, avec une aiguille distance pointe-à-collecteur de ~ 18 cm.
  4. Fixer le alli positifalligator clip pour le milieu de l'aiguille, et la pince crocodile de terre au collecteur d'aluminium, puis réglez la tension de l'alimentation haute tension à 15 kV. ATTENTION: haute tension, maintenir la distance de l'aiguille.
  5. Activer de façon séquentielle sur la pompe à seringue et l'alimentation électrique; nettoyer rapidement / retirer de la solution de polymère résiduel entourant la pointe de l'aiguille à l'aide d'une serviette en papier avant jets de fibres stable et Taylor cône 19 sont formés.
  6. Laisser les fibres de s'accumuler sur le collecteur Al jusqu'à une épaisseur de 250 à 300 um ~ (~ 7 h dans les conditions de filage de courant). Stocker les échafaudages obtenus dans un dessiccateur sous vide pendant 1 à 2 jours pour éliminer tout solvant résiduel.
  7. Image, les échafaudages, applique par pulvérisation avec de l'or, à l'aide d'un microscope électronique à balayage pour montrer cohérent morphologie de la fibre. 10

3. Assemblée bioréacteur et caractérisation

  1. Percez un disque cylindrique (diamètre: 8 mm) avec quatre bras (longueur: 2mm) sur le tapis PCL à l'état filé (figure 2A) en utilisant d'abord un diamètre de 12 mm poinçon de biopsie pour couper le diamètre extérieur du disque. Ensuite, utilisez une deuxième, 8 mm biopsie punch pour faire quatre 2 mm de long encoches espacées uniformément autour de la lame circulaire de marquer où les armes sont à couper. Après avoir marqué avec le poinçon de 8 mm, utiliser une lame de scalpel pour couper les bords des bras vers l'extérieur. Insérer l'échafaudage dans la rainure de la membrane en silicone par l'intermédiaire des bras étendus (vidéo 1). Aplatir l'échafaud inséré en appuyant doucement sur la surface en utilisant des pinces à tête plate.
  2. Attacher un petit morceau de feuille mince d'Al (8 mm x 2 mm, forme orthogonale, figure 2B) à l'échafaud PCL pour aider à la réflexion laser.
  3. Bloquer la membrane silicone / PCL échafaudage assemblée (comme indiqué dans l'étape 1.4) dans la chambre de vibration. Ajouter 1,5 ml d'eau dans la chambre pour hydrater l'échafaud PCL avant vibrations.
  4. Utilisation du générateur de fonction, introduire le signe de vibrationsal (par exemple, 200 Hz ondes sinusoïdales avec une tension crête-à-crête, Vpp, de 0,1 V) à la chambre acrylique prise en sandwich. Utilisez un voltmètre pour mesurer avec précision la tension à chaque entrée du haut-parleur. Remarque: la lecture Vcc du générateur de fonction sera différente de la tension éventuelle livré à l'orateur.
  5. Assemblez le seul point LDV et sécuriser le laser tête de capteur à fibre optique sur un trépied à tête pan-tilt. Angle de la tête de capteur de sorte qu'il est orienté perpendiculairement à la table. Raccorder la tête de capteur de LDV au module d'acquisition de données par l'intermédiaire d'un câble coaxial ensuite le module à l'ordinateur portable via USB.
  6. Focaliser le faisceau laser perpendiculairement à différents points prédéterminés sur la membrane en silicone (figure 2B et la figure 3).
  7. Utilisation du logiciel d'acquisition de données, enregistrer le déplacement mi-membrane. Cliquez sur "Paramètres d'acquisition" dans le menu "Options"; puis changer le mode de mesure à "FFT221;. Ensuite, cliquez sur le "mesure continue" dans la barre d'outils principale puis cliquez sur le pic qui se forme à la fréquence choisie (Figure 6D) pour enregistrer le déplacement.
  8. Tracer le déplacement mi-membrane normal (w 0) en fonction de la position relative entre le substrat. Construire une palette de couleurs 3D du profil vibratoire de surface à l'aide Origine logiciel d'analyse de données 8.5.

4. Vibrante culture cellulaire

  1. MSC dérivées de moelle osseuse sous-culture T150 humain dans des flacons de culture de tissu avec une densité d'ensemencement initiale de 4000-5000 cellules / cm 2 dans les milieux d'entretien MSC.
  2. Après 7-8 jours de culture cellulaire (à ~ 85% de confluence), trypsiniser les cellules avec un réactif de dissociation cellulaire tel que Accutase, compter l'aide d'un hématimètre, centrifugeuse (440 g pendant 5 min), et remettre en suspension le culot cellulaire dans milieu d'entretien frais de MSC à une concentration de 4,5 x 10 6 cellules / ml.
  3. Plonger la Scaffo PCLld éthanol à 70% O / N. Après que le solvant est évaporé, exposer les deux côtés de l'échafaudage à la lumière UV germicide (254 nm) pour 5-8 minutes.
  4. Faire tremper l'échafaud PCL dans une solution de fibronectine 20 pg / ml à 37 ° C pendant 1 heure. Insérer l'échafaudage de fibronectine dans la membrane en silicone. Assemblez le bioréacteur tel que détaillé à l'étape 1.
  5. Distribuer 40 ul de la suspension cellulaire uniformément sur l'échafaud PCL sécurisé. Permettent aux cellules de se fixer pour 1 à 1,5 h avant d'ajouter encore 1,5 ml de milieu frais à la chambre de vibration.
  6. Culture de l'échafaud PCL MSC chargé statiquement pendant 3 jours et rafraîchir les médias à la fin de la culture statique.
  7. Imposer des régimes de vibration sélectionnés pour les constructions cellulaires. Remarque: Par exemple, les cellules sont soumises à un 1-hr-sur-1-h-off (DE) vibrations à 200 Hz avec aw 0 de ~ 40 um pendant 12 heures par jour pour un maximum de 7 jours. Constructions soumises à des stimulations vibratoires sont désignés comme échantillons Vib et les culturouge statique dans des chambres de vibrations identiques servent de témoins statiques (STAT).

5. Évaluations biologiques

  1. Recueillir 200 ul de milieux de culture cellulaire à partir de chaque chambre tous les deux jours (jours 1, 3, 5 et 7) et en commun des fractions aliquotes d'un même échantillon en même temps (800 ul chacun).
  2. Quantifier la production cellulaire de la matrice métalloprotéinase-1 (MMP1) et HA en utilisant un kit ELISA MMP1 développement et un kit ELISA de compétition de l'acide hyaluronique, respectivement, à la suite de la procédure des fabricants. Pendant ce temps, le dosage de la production de précurseur de l'élastine soluble suivant la procédure ELISA précédemment rapporté. Huit
  3. À la fin du dernier cycle de vibration au jour 7, supprimer rapidement les constructions cellulaires des chambres de vibrations à l'aide de pinces acérées et brièvement les rincer avec de phosphate froid (PBS, 4 ° C).
  4. Pour la coloration en direct / mort, incuber les constructions avec l'iodure de propidium (1:2000 dans du PBS) etSyto-13 (1:1000 dans du PBS) en même temps pendant 5 min à température ambiante. Image Les constructions colorées avec un microscope confocal multiphotonique.
  5. Séparément, enfichable geler les constructions cellulaires PBS rincés sur glace sèche et d'extraire l'ARN cellulaire total en suivant un protocole indiqué précédemment pour l'analyse génétique. 9
  6. Vérifiez la quantité et la qualité de l'ARN extrait à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis. échantillons d'ARN avec des ratios de 1,8-2,2 A260/A280 et A260/A230 sont utilisées pour l'analyse qPCR ultérieure.
  7. N º de transcrire l'ARN (500 ng / échantillon) en ADNc en utilisant un kit de transcription inverse disponible dans le commerce.
  8. Effectuer la réaction de PCR sur un système de détection de séquence en temps réel en utilisant un mélange maître PCR disponible dans le commerce en suivant la procédure détaillée précédemment. 8
  9. Analyser les résultats de qPCR en utilisant un logiciel d'analyse de données qPCR commerciale. Pour assurer la fiabilité de l'analyse de données, plusieurs gènes de référence (YWHAZ, BPT, PPIA) sont utilisés comme intcontrôles ernal, et la variance de l'efficacité des amorces spécifiques sont pris en compte. 8

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Les échafaudages PCL fabriqués par électrofilage contiennent des pores interstitiels de taille micronique et des fibres enchevêtrées de manière aléatoire ayant un diamètre moyen de 4,7 pm (Figure 4A). A plus fort grossissement, rainures et pores nanométriques sont visibles sur fibres individuelles (figure 4B). Revêtement des échafaudages avec la fibronectine améliore le caractère hydrophile et facilite l'adhérence cellulaire initiale / épandage sur l'échafaudage PCL (observation non publiée).

Des formes d'onde sinusoïdales avec une fréquence souhaitée (f, 100 à 300 Hz) et la tension (Vpp: 0 à 0,125 V) sont introduits dans l'enceinte en dessous de chaque chambre de vibration, et l'air enfermé entre le fond de la membrane en silicone et le cône de papier d'un mini-woofer est entraîné en oscillation. L'oscillation de l'air est délivré à l'échafaudage PCL avec ou sans cellules. LDV est utilisée pour analyser les caractéristiques de vibration de l'échafaudage à un f et Vpp donné,en tenant compte de l'indice de réfraction de l'eau (1,33). 20 La figure 5 montre le déplacement normale (w 0) au centre de l'échafaudage PCL en fonction de Vpp et f. Les fréquences de vibration sont choisis de manière à refléter des fréquences fondamentales de parole humaine. 21 Il existe une relation linéaire entre 0 et w Vpp dans l'intervalle de 0 à 0,125 V pour toutes les fréquences testées. Lors d'une Vpp donné, w 0 f diminue lorsque augmente de 100 à 300 Hz.

Une condition spécifique de la vibration (f = 200 Hz, Vpp = 0,1 V) est choisi pour une analyse ultérieure. Le profil de vitesse en fonction du temps (figure 6A) montre que le signal sinusoïdal introduit à l'orateur est capturé par l'échafaudage PCL avec une grande fidélité. Le centre de l'échafaudage PCL oscille longitudinalement avec une vitesse de pointe de 52 mm / sec, une accélération maximale de 66 m / sec 2 (~ 6,7 g) et d'undéplacement normal de ~ 40 um. Les signaux harmoniques à 100, 300, 400 et 500 Hz sont au moins un ordre de grandeur inférieures à celles à la fréquence fondamentale (200 Hz). Cependant, si la valeur Vpp est trop élevée (0,15 V), plusieurs pics harmoniques d'intensité comparable à la fréquence fondamentale sont détectés (figure 7). Le profil de vibrations sur l'échafaud est créé en surveillant le déplacement normal sur un total de 73 points représentatifs sur les directions radiales de la surface PCL (figure 3). La palette de couleurs en 3D (Figure 8) montre que la vibration détectée sur la surface de la membrane est de révolution par rapport au centre et à ses positions de repos. Le déplacement normal se trouve à diminuer de façon monotone depuis le centre vers le bord, où la membrane est fixée.

CSM cultivées sur des échafaudages PCL sont mises en culture dans des conditions de vibration sélectionnées. Les cellules soumises à un 7-day de la stimulation de maintenir les propriétés de la viabilité et de prolifération similaires que les contrôles statiques (figure 9), confirmant que les échafaudages fibreux étaient cytocompatible et la vibration appliquée entraîné aucune perte de viabilité. Réponses cellulaires à des stimulations vibratoires sont examinés aux niveaux d'ARNm en termes de l'expression de protéines vocales fois ECM essentielles, telles que l'élastine (ELN), l'acide hyaluronique synthase-1 (HAS1), COL3A1 et MMP1 (figure 10). Le DE vibration conduit à une augmentation de 2,3 fois de l'expression de l'ELN au jour 7, par rapport aux contrôles statiques. Les stimulations vibratoires ont également augmenté l'expression COL3A1 modérément. Il est à noter que l'expression des principales enzymes de remodelage ECM, HAS1 et MMP1, est considérablement augmentée par les signaux de vibration. Plus précisément, le traitement dynamique a entraîné une augmentation d'un facteur de 1,7 ~ 16,3 ~ et pour HAS1 et MMP1 expression (les deux p <0,05), respectivement, au cours de leurs contrôles statiques au jour 7. Globalement, l'effet inductif des vibrations sur HAS1 et MMP1 a été renforcée du jour 3 au jour 7.

Pour confirmer davantage les résultats de qPCR, la production cellulaire de HA, l'élastine soluble et MMP1 est quantifiée par ELISA au niveau traductionnel (Figure 11). Les cellules cultivées produisent dynamiquement 4,2 ± 0,1 ug / mg (par rapport au poids sec de l'échafaudage) de l'élastine soluble après 7 jours de vibrations, alors que les contrôles statiques s'accumulent seulement 2,7 ± 0,2 ug / mg) de l'élastine. En moyenne, 7 jours de vibrations résultat en 2.2 et augmentation de 4,7 fois en HA et MMP1 la sécrétion, par rapport aux contrôles statiques correspondants.

Vidéo 1: Une simulation en 3D montrant l'assemblage d'un bioréacteur à J2. La vidéo a été créé par Autodesk 3ds Max Design (Gracieuseté de Congfei Xie).

"Fo: keep-together.within page =" always "> Figure 1
. Figure 1 photographie illustrant la dimension du moule Al utilisé pour la fabrication de la membrane en silicone avec gaine retranché Ø:. Diamètre, d: épaisseur / profondeur, h:. Taille S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
.. Figure 2 Diagramme montrant l'ensemble de bioréacteur (A) Une photographie d'un à quatre bras en forme de squelette de PCL; (B) Une photographie montrant l'échafaud PCL fixé dans la chambre de vibration et le laser de vibromètre porté sur le fond de la chambre; ( C) Une coupe transversaleal vue de la chambre de vibration. 1: échafaudage PCL (rouge); 2: membrane de silicone (cyan); 3: Al barre fixe; 4: top bloc acrylique; 5: bloc acrylique fond; 6: mini-woofer; (D) vue de côté du module de vibration; (E) Une photographie montrant l'ensemble. Ce chiffre a été modifié depuis Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Illustration de la membrane de silicone radialement marqué pour les mesures de LDV un seul point. Ce chiffre a été modifié depuis Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.


Figure 4. Images MEB d'échafaudages PCL à différents grossissements. (A) 600X, (B) 7000 X. Ce chiffre a été modifié depuis Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Le déplacement normal à l'axe de la membrane de silicone (v 0) en fonction de la fréquence appliquée (100, 200 et 300 Hz) et la tension de commande (Vpp = 0 à 0,125 V). Cette figure a été modifié de Tong et al. 10 Copyright 2013 Ma ry Ann Liebert, Inc.

Figure 6
Figure 6. Caractéristiques de la vibration détectée au centre de la membrane en silicone avec f = 200 Hz et un profil Vpp = 0,1 V. (A) la vitesse en fonction du temps. (B) du profil de vitesse en fonction de la fréquence (C). l'accélération comme une fonction de la fréquence. (D) de déplacement normale (w 0) en fonction de la fréquence. Ce chiffre a été modifié depuis Tong et al. 10. Droits d'auteur 2013, Mary Ann Liebert, Inc. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

/ 51594fig7highres.jpg "/>
Figure 7. Normale de déplacement détectée au niveau du centre de la membrane (w 0) en fonction de la fréquence quand une onde sinusoïdale de 200 Hz est introduit dans le mini-haut-parleur à un Vpp = 0,15 V.

Figure 8
Figure 8. Colormap 3D construit par maillage de surface en utilisant les données de déplacement normales recueillies auprès de tous les endroits marqués sur l'échafaud PCL. Ce chiffre a été modifié depuis Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.

Figure 9
Figure 9. Viabilité cellulaire, visualisé par coloration en direct / mort, après 7 jours de vibrations. Ce chiffre a été modifié depuis Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10
Figure 10. Réponses cellulaires aux stimulations vibratoires en termes de l'expression de pliage pertinente, les gènes ECM vocales. L'expression du gène relative (fold change) est normalisée à des contrôles statiques respectives au jour 3 et le jour 7 (de base en pointillés). **: Différence significative (p <0,05) entre les jours 3 et 7, #: changé de manière significative (p <0,05) par rapport à la ligne de base. Les données représentent la moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM, n = 4). Test t de Student bilatéral est utilisé pour l'analyse statistique, avec p <0,05 étant considéré comme nettement différence (le même que ci-dessous). Ce chiffre a été modifié depuis Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.

Figure 11
Figure 11. Quantification biochimique de HA (A), soluble ELN (B) et MMP1 (C) produite par CSM cultivées sur l'échafaud PCL sous Stat et Vib conditions de 7 jours. Montant total de molécules de la MEC par le poids de l'échafaudage sec (mg) est représenté en tant que moyenne ± SEM, n = 4 à partir de l'essai représentant #:. significativement améliorée (p <0,05) par rapport aux témoins Stat. Ce chiffre a été modifié depuis Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L'ingénierie des tissus succès des cordes vocales fonctionnels in vitro nécessite la recréation d'un pli comme micro vocal à la médiation des comportements de cellules multipotentes. Il est généralement admis que les structures de tissus ou d'organes reflètent les fonctions qu'ils sont appelés à exécuter. 22 Pour les tissus des cordes vocales, les vibrations de haute fréquence qui se produisent pendant la phonation sont proposées pour être important pour la maturation des tissus. Dans notre étude, les échafaudages PCL sont utilisés pour fournir un soutien structurel ligament tandis que le pli bioréacteur vocal est conçu pour introduire des signaux mécaniques physiologiquement pertinents pour les CSM cultivées. Le bioréacteur décrit ici (J2) crée la vibration électromagnétique par haut-parleurs individuels et transfère l'aérodynamique de l'énergie pour les cellules en culture. Par rapport à notre conception précédente, 18 le système actuel se déplace la source de stimulation vibratoire directement en dessous de chaque échantillon, permettant fora conversion d'énergie plus efficace. Par conséquent, un déplacement normal de manière significative plus grande et à une accélération plus élevée sont obtenus en utilisant le système actuel. La conception modulaire minimise également les variations du système et perturbation mécanique entre les différentes chambres de vibrations.

Notre conception repose sur une membrane de silicone pour fournir les signaux de vibration. Il est donc important de maintenir l'intégrité de la membrane et de l'homogénéité. Après que la solution de précurseur est versé dans le moule en aluminium, il est souhaitable d'éliminer l'excès de liquide en faisant glisser une lame de verre à travers la surface du moule. Les membranes homogènes, sans bulles d'air piégées peuvent être produites par l'abaissement de température de durcissement, tout en augmentant le temps de durcissement. En outre, une solution d'éthanol à 70% peut être utilisé pour gonfler temporairement la membrane à l'interface en aluminium pour permettre l'enlèvement facile de la silicone durcie. Pour accueillir les constructions cellulaires pour la culture dynamique 3D, une rainure mince en position centrale is moulé dans la membrane de silicone, de telle sorte que les échafaudages PCL peuvent être ancrées de manière périphérique dans la chambre de vibration. La géométrie de la rainure est réglable; ainsi la forme du produit d'assemblage cellulaire peut être ajustée en conséquence afin de mieux imiter la géométrie des cordes vocales natifs. 23 Si l'échafaudage PCL n'est pas fixé solidement à la membrane de silicone, les signaux de LDV détectés à la PCL et à la région extérieure à la silicone membrane ne se chevauchent parfaitement. Lors du montage du bioréacteur, il est essentiel que tous les composants sont fixées et serrées dans la même mesure de façon à éviter des mouvements indésirables et à réduire au minimum les variations de chambre de la chambre.

Pour valider l'utilité du bioréacteur, les MSC sont cultivées sur des échafaudages PCL et sont soumis à intermittent (D) des vibrations pendant 7 jours. Le DE vibrations sur une période de plusieurs heures par jour sont utilisés pour reproduire les conditions d'expression des utilisateurs vocaux lourds, par exemple, chanter professionnel teurs et les enseignants. 23 Contrairement bioréacteurs des cordes vocales signalés précédemment, nous ne provoquent aucun effet préjudiciable ou un traumatisme physiologique des cellules.

Les vibrations de 200 Hz se trouvent à réglementer différemment la production cellulaire d'éléments importants de l'ECM. L'élastine est une protéine structurale essentielle que l'on retrouve tout au long de la corde vocale LP, et confère la résistance et l'élasticité. 24 composants amorphes interstitielles, comme HA, contribuent au maintien de la visco-élasticité des tissus appropriée et la prévention de la formation de cicatrices. 25,26 MSC soumis à la 7-jour de traitement produire une quantité significativement plus élevée de l'élastine que leurs homologues statique culture. HA biosynthèse est également sensible aux vibrations, tel que confirmé par les résultats de qPCR sur HAS1 et ELISA résultats sur HA. Ces résultats suggèrent que la stimulation vibratoire permis par le bioréacteur est propice à la production de molécules anti-cicatrices.

jove_content "> rotation du ECM équilibré repose sur le dépôt de matrice concurrent et à la dégradation. 27 collagène de type III est la principale fibre de collagène réticulée trouvé dans les cordes vocales, la fourniture du tissu avec des propriétés de support de charge. 28 Les vibrations de 7 jours appliquées ici d'améliorer l'expression du gène de COL3A1, mais à une amplitude beaucoup plus faible que celle de l'élastine. conséquent, les vibrations appliquées réguler de façon différentielle machinerie cellulaire impliquée dans la synthèse du collagène III et de l'élastine. intéressant, MMP1, l'un des principaux MMP impliquées dans la dégradation de la matrice et le remodelage des tissus 27 , est très sensible aux signaux vibratoires. Ces résultats sont en bon accord avec les rapports précédents sur les vibrations induites par-MMP1-régulation par les cellules piégées dans une matrice HA. 29 Dans l'ensemble, les stimulations vibratoires générés par le pli bioréacteur vocal médiation profondément fonctions de MSC par la promotion de l'homéostasie des vocales matrices fois-comme.

Surtout, le roman cordes vocales bioréacteur présenté ici est modulaire et conviviale, permettant la culture de cellules dynamique à effectuer dans un mode reproductible. Toutefois, plusieurs limitations existent dans la conception actuelle. En premier lieu, l'amplitude de vibration, bien que l'amélioration de la version J1, est encore faible par rapport au tissu de la corde vocale. Deuxièmement, notre bioréacteur ne simule pas la collision bilatérale des cordes vocales pendant la phonation normale. Troisièmement, notre fibreux échafaud PCL ne reflète pas l'anisotropie des tissus. Les travaux futurs se consacre à l'amélioration de la conception afin de mieux reproduire les conditions de la phonation indigènes. Pendant ce temps, les régimes optimaux pour la culture dynamique 3D seront explorées pour la fonctionnelle fois ensemble vocal in vitro réussie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Aucun intérêt financier concurrentes existent.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Jeffrey Caplan pour sa formation et des conseils sur l'imagerie confocale. Nous remercions également le Keck microscopie électronique Lab et le Dr Chaoying Ni d'assistance SEM. Ce travail est financé par les Instituts nationaux de la santé (NIDCD, R01DC008965 et R01DC011377). ABZ reconnaît NSF enseignement universitaire intégré et (IGERT) programme de financement la recherche de stage.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Sylgard 184 Cure the membrane at 100 °C for 2 hr
PCL Sigma Aldrich 440744-500G Mn ~80 kDa, dissolve O/N
Chloroform Sigma Aldrich C7559-5VL
Human bone marrow-derived MSCs Lonza PT-2501 Received with passage 2
MSC maintenance media Lonza PT-3001 10% FBS in basal media supplemented
with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent Life Technologies A11105-01
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500ML
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit R&D systems DY901
HA ELISA kit Echelon Biosciences  K-1200  
PBS Life Technologies 14190-136
Propidium iodide  Life Technologies P1304MP
Syto-13  Life Technologies S7575
QuantiTect reverse transcription kit  Qiagen 205311
SYBR Green PCR master mix Life Technologies 4309155
Replacement speaker DAYTON audio
(via Parts Express)
DS90-8 Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB
Ergo Micro torque screwdriver Mountz # 020377 Torque range: 20-120 cN·m
Stereo speaker selector RadioShack 40-244 Maximum power handling 50 W
Function generator  Agilent  33220A Frequency range 1 µHz-20 MHz
Power amplifier  PYLE audio PylePro PT2400 Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker
channels
Cell culture incubator  Thermo Fisher  Steri-Cult 3307
Syringe pump  New Era Pump Systems NE-300
High voltage power supply Spellman CZE 1000R Output voltage: 0-30 kV
Scanning electron microscope  JEOL-USA JSM-7400F
Desk gold sputter coater Denton Vacuum DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer  Polytec PDV-100 Non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system  Applied Biosystems ABI7300
Multiphoton confocal microscope Zeiss Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer  NanoDrop Products
via Thermo Scientific
ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software Polytec Acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software  OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software  Biogazelle V2.3
Aluminium alloy  McMaster-Carr Alloy 6061
Acrylic blocks McMaster-Carr
Polycarbonate anti-humidity chamber McMaster-Carr Impact-Resistant Polycarbonate
screws  McMaster-Carr
Electronic cable/wire
Medical grade PVC tubing US Plastic Corp. Tygon S-50-HL Clear, biocompatible
10 ml Syringe  Becton Dickinson 309604
21 G Blunt ended needle Small Parts NE-213PL-25 1-1/2" length
Alligator clip adapters  RadioShack 270-354 Fully insulated
8 mm Biopsy punch Sklar Surgical Instruments 96-1152 Sterile, disposable
12 mm Biopsy punch Acuderm (via Fisher Scientific) NC9998681
Tissue culture flasks Corning Cell culture treated

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Titze, I. R. Mechanical-Stress in Phonation. J. Voice. 8, 99-105 (1994).
  2. Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
  3. Gray, S. D. Cellular physiology of the vocal folds. Otolaryngol. Clin. N. Am. 33, 679-698 (2000).
  4. Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring. J. Voice. 16, 96-104 (2002).
  5. Hansen, J. K., Thibeault, S. L. Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring. J. Voice. 20, 110-120 (2006).
  6. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  7. Hanson, S. E., et al. Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts. Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).
  8. Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds. Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).
  9. Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor. Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).
  10. Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).
  11. Wang, J. H., Thampatty, B. P. Mechanobiology of Adult and Stem Cells. Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).
  12. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).
  13. Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
  14. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).
  15. Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli. Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).
  16. Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
  17. Kutty, J. K., Webb, K. Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).
  18. Farran, A. J. E., et al. Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System. J. Tissue Eng. Regen. Med. (2011).
  19. Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
  20. Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).
  21. Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional. J. Voice. 5, 310-315 (1991).
  22. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. Faseb J. 20, 811-827 (2006).
  23. Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
  24. Moore, J., Thibeault, S. Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease. J. Voice. 26, 269-275 (2012).
  25. Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar. J. Voice. 17, 377-383 (2003).
  26. Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. Vocal fold wound healing: A review for clinicians. J. Voice. 20, 432-442 (2006).
  27. Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).
  28. Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers. Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).
  29. Kutty, J. K., Webb, K. Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria. Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats