Construção e Caracterização de um biorreator Fold Novel Vocal

1Biomedical Engineering Program, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware
Published 8/01/2014
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Bioengineering

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Zerdoum, A. B., Tong, Z., Bachman, B., Jia, X. Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor. J. Vis. Exp. (90), e51594, doi:10.3791/51594 (2014).

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Abstract

Introduction

A prega vocal humana, composta por uma camada epitelial, a lâmina própria (LP) eo músculo vocal, é um tecido macio especializado que converte o fluxo de ar dos pulmões para ondas acústicas para a produção de som. 1 As pregas vocais oscilam regularmente durante a fonação normal, exibindo as estirpes de até 30% em frequências fundamentais que variam 100-300 Hz. 2 Adulto vocal dobra LP é uma estrutura composta por um gradiente superficial (SLP), de um intermediário (PLI) e um (DLP) camada profunda. Outros grupos de classificação do epitélio eo SLP como a camada mucosa, e combina o ILP e DLP no ligamento vocal. 3 A camada SLP contém principalmente uma matriz amorfa com fibras colágenas pouco dispersos, enquanto que o ligamento é enriquecido com colágeno maduro e fibras de elastina para fornecer a força suficiente. 4 A estrutura e mecânica de pregas vocais nascidos variar significativamente de suas contrapartes adultas. Embora mecanismos que regulam o desenvolvimento das pregas vocais e maturação ainda não são totalmente compreendidos, a evidência experimental apontou para os papéis que definem a tensão mecânica derivada de vocalização.

Várias condições médicas, incluindo abuso vocal, infecções, irritantes químicos e procedimentos cirúrgicos, pode danificar a prega vocal. Patologias vocais afeta cerca de 3-9% da população dos EUA. Os métodos atuais de tratamento para patologias vocais são limitados 5 e uma abordagem de engenharia de tecidos à base de células-tronco surgiu como uma estratégia promissora para restaurar a função da prega vocal. Células-tronco mesenquimais (MSCs) são uma alternativa adequada para as primárias de fibroblastos de pregas vocais para engenharia de tecidos das pregas vocais. 6-9 especificação destino de células-tronco e desenvolvimento do tecido subseqüente são mediados pelo nicho específico em que residem, de que o estado mecânico é um fator vital. 10 forças mecânicas são reguladores essenciais do tecido morfogênese umnd homeostase, especialmente para tecidos que são rotineiramente submetidos a uma carga. 11 Do ponto de vista da engenharia de tecidos, tem sido demonstrado que a exposição a estímulos mecânicos fisiologicamente relevantes promove a diferenciação das células-tronco e específico do tecido remodelação da matriz 12-15.

Bioreactores de cultura de tecidos são concebidos para simular o ambiente fisiológico pretendido para a célula ou tecido de crescimento in vitro. Para a engenharia de tecidos das pregas vocais, é especialmente crítico para recriar o ambiente mecânico das pregas vocais phonating. Um biorreator ideal prega vocal deve entregar efetivamente sinais vibratórios para células de cultura, permitindo o controle fácil sobre frequência, amplitude e duração das vibrações. Titze e colegas de trabalho elaborou um biorreator prega vocal (T1 biorreator) 16 que combina alongamento estático com alta freqüência (20-200 Hz) oscilações de estimular a produção de proteínas da matriz celular. Using deste biorreactor, Webb e colaboradores 17 estudaram os efeitos de 10-dias, as vibrações de 100 Hz em fibroblastos dérmicos cultivadas num ácido hialurónico (HA), à base de hidrogel. As construções submetidas a vibração exibiu uma expressão elevada de HA-sintase-2 (HAS2), decorina, fibromodulim e metaloproteinase de matriz-1 (MMP1), relativa aos controlos estáticos. Os efeitos estimulantes foram encontrados para ser dependente do tempo. Mais recentemente, o nosso grupo de 18 reuniu um biorreator prega vocal (J1 biorreator) usando um amplificador de potência, um gerador de funções, um alto-falante fechado e uma membrana de silicone em circunferência ancoradas que transfere o ar oscilante para as células unidas. Fibroblastos de prepúcio neonatal cultivadas no biorreactor J1 foram sujeitos a 1 h de vibração a 60, 110 ou 300 Hz, com uma tensão no plano de até 0,05%. Os resultados qPCR sugeriu que a expressão de alguns genes de ECM foi moderadamente alterada em resposta às frequências vibratórias variadase amplitudes.

Estes projetos de biorreatores, enquanto intrigante, tem várias limitações. Por exemplo, o sistema de T1 requer um grande número de ligações e barras de acoplamento mecânico, que limita as frequências máximas atingível. Além disso, as células podem ser submetidas a indesejável agitação e fluido perturbação mecânica que complicam a interpretação dos dados. O bioreactor de J1, por outro lado, apresenta relativamente baixa eficiência de conversão de energia e não é fácil de usar. Além disso, a vibração freqüentemente destaca as estruturas celulares em carga da membrana de silicone subjacente. O J2 biorreator prega vocal aqui relatado, projetado com base no mesmo princípio como a versão J1, é otimizado para a consistência e reprodutibilidade. As vibrações que imitam fonação são gerados aerodinamicamente em câmaras de vibração instalados individualmente em poli fibroso MSC-povoada (ε-caprolactona) (PCL) andaimes são effectively garantiu. Laser Doppler Vibrometria (LDV) permite ao usuário verificar o perfil de vibração do conjunto membrana / andaime. Na nossa demonstração, as MSCs são expostos a 200 Hz de vibrações sinusoidais com uma (DE) padrão 1-h-on-1-h-off para um total de 12 hr por dia durante 7 dias. As respostas celulares aos estímulos vibratórios impostas são investigados de forma sistemática. No geral, a prega vocal J2 fornece o maior número de características user-friendly, permitindo estudos de cultura celular dinâmica a ser realizado em uma alta taxa de transferência e moda reprodutível.

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Protocol

1. Assembléia biorreator (Video 1)

  1. Fazer um molde de alumínio (matriz circular + pino espaçador) com as dimensões interiores e exteriores pré-determinados (Figura 1).
  2. Usando o molde a partir do passo 1.1, o fabrico de uma membrana de silicone (diâmetro: 42 mm, espessura: 1,5 mm, Figura 1) com uma manga entranhado (diâmetro: 12 mm, espessura de ~ 0,25 mm, em forma de pino do espaçador da Figura 1) em o meio usando um kit de elastómero de silicone disponíveis comercialmente.
  3. Faça um par de blocos de acrílico (Figura 2 (4, 5)), com uma abertura circular (diâmetro: 24 mm) no meio, gravar o topo (1,8 cm de espessura) e inferior (0,9 cm de espessura) blocos com sulcos e ranhuras correspondentes 10.
  4. Sanduíche a membrana de silicone entre os blocos de acrílico emparelhados. Fixe o conjunto com quatro parafusos de canto usando uma chave de fenda de torque micro definido como uma força constante (35 cN · m). Como resultado, uma prova de água, 24 mm de largura e 18 mm de profundidade da câmara de vibração é criada (Figura 2C).
  5. Monte um "alcance estendido mini-woofer 3 (Figura 2D, 8 Ω/20 W) por baixo da câmara de vibração através de um outro conjunto de parafusos de canto no bloco de acrílico inferior. Neste ponto, um módulo de vibração individual é montado.
  6. Replicar sete módulos de vibração adicionais. Apor quatro deles a uma das duas barras de alumínio estacionários (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), colocando as bases dos altifalantes em furos circulares espaçados uniformemente (diâmetro: 7 cm, espessura: 2 cm) cortado em barras. Estabilizar cada altifalante inserindo um parafuso através do lado da barra de alumínio em cada furo circular.
  7. Individualmente controlar os alto-falantes por um seletor de alto-falante. Ligue colunas individuais para o selector ligando fios para as entradas positivas e negativas para o corpo do alto-falante, em seguida, para as respectivas saídas do selector. O seletor de alto-falante permite que o sinal de tele gerador de funções, depois de passar por um amplificador de potência, para alcançar todos os oito alto-falantes de uma só vez (Figura 2E).
  8. Coloque as duas matrizes de câmara, o seletor de alto-falante e componentes eletrônicos associados em um gabinete anti-umidade. Casa todo o conjunto em uma cultura de células incubadora comercial.
  9. Alimentar os cabos principais (por meio de um tubo de PVC de qualidade médica) que liga o amplificador de potência e selector de coluna através do conjunto de filtro na parte traseira da incubadora.

2. Fabrication andaime e Caracterização

  1. Dissolve-se peletes de PCL em clorofórmio a uma concentração de 15% em peso. Carregar a solução numa seringa de 10 ml tapado com uma extremidades cegas agulha 21 G.
  2. Tranque a seringa em uma bomba de seringa programáveis ​​e definir a taxa de fluxo de 1 ml / h.
  3. Coloque o coletor de coberta de folha de alumínio através da agulha na horizontal, com uma agulha de distância ponta-de-colecionador de ~ 18 cm.
  4. Prenda o alli positivoclipe jacaré para o meio da agulha eo jacaré terreno para o coletor de alumínio, em seguida, definir a voltagem da fonte de alimentação de alta tensão de 15 kV. CUIDADO: alta tensão, manter distância da agulha.
  5. Sequencialmente ligar a bomba de seringa e de alimentação; rapidamente limpo / remover a solução de polímero residual em torno da ponta da agulha com uma toalha de papel seco, antes jactos fibra estável e Taylor cone 19 são formadas.
  6. Permitir que as fibras se acumulem no colector de Al com uma espessura de ~ 250-300 mM (~ 7 horas sob as condições de fiação corrente). Armazenar os andaimes resultante num exsicador de vácuo durante 1-2 dias para remover qualquer solvente residual.
  7. Imagem os andaimes, sputter revestido com ouro, utilizando um microscópio eletrônico de varredura para mostrar a morfologia da fibra consistente. 10

3. Assembléia biorreator e Caracterização

  1. Faça um disco cilíndrico (diâmetro: 8 mm) com quatro braços (comprimento: 2mm) para fora do tapete PCL tal como fiados (Figura 2A), em primeiro lugar usando um diâmetro de 12 milímetros biopsia de perfuração para cortar o diâmetro exterior do disco. Em seguida, utilizar um segundo, 8 milímetros biópsia para fazer quatro 2 mm de comprimento entalhes espaçados uniformemente em torno da lâmina circular para marcar onde os braços estão a ser cortados. Depois de marcar com o punção 8 mm, de utilizar uma lâmina de bisturi para cortar as extremidades dos braços para fora. Insira o andaime na ranhura da membrana de silicone via os braços estendidos (Video 1). Achate o andaime inserido pressionando suavemente a superfície, usando uma pinça de cabeça chata.
  2. Anexar um pequeno pedaço de folha fina Al (8 milímetros x 2 mm, forma ortogonal, Figura 2B) para o cadafalso PCL para auxiliar a reflexão do laser.
  3. Fixar a membrana de silicone / PCL andaime montado (conforme descrito no passo 1.4) na câmara de vibração. Adicionar 1,5 ml de água na câmara de modo a hidratar o andaime PCL antes vibração.
  4. Usando o gerador de funções, apresentar sinal de vibraçãoals (por exemplo, 200 Hz ondas sinusoidais com uma tensão de pico-a-pico, Vpp, de 0,1 V) para a câmara de acrílico ensanduichada. Use um voltímetro para medir com precisão a tensão em cada entrada de alto-falante. Nota: a leitura Vpp do gerador de função será diferente da eventual tensão fornecida para o alto-falante.
  5. Monte o LDV de ponto único e assegurar o sensor laser cabeça de fibra óptica a um tripé cabeça pan-tilt. Ângulo da cabeça do sensor de modo que ele está apontando perpendicular à mesa. Ligue a cabeça do sensor LDV para o módulo de aquisição de dados através de um cabo coaxial, em seguida, o módulo para o laptop via USB.
  6. Focar o feixe de laser perpendicular em vários pontos predeterminados na membrana de silicone (Figura 2B e Figura 3).
  7. Utilizando o software de aquisição de dados, registar o deslocamento meados de membrana. Clique em "Configurações de Aquisição" no menu "Opções"; em seguida, alterar o modo de medição para "FFT221;. Em seguida, clique no botão "medição contínua" na barra de ferramentas principal, em seguida, clique no pico que se forma na freqüência escolhida (Figura 6D) para gravar o deslocamento.
  8. Traça-se a deslocação no meio da membrana normal (w 0) como uma função da posição relativa ao longo do substrato. Construir um mapa de cores em 3D do perfil vibratório superfície usando Origin software de análise de dados de 8,5.

4. Cultura de Células Vibratória

  1. MSC derivadas da medula óssea humana de sub-cultura em frascos de cultura de tecido T150 a uma densidade de sementeira inicial de 4.000-5.000 células / cm2 em meio de manutenção MSC.
  2. Após 7-8 dias de cultura de células (de ~ 85% de confluência), trypsinize as células com um reagente de dissociação de células, tais como Accutase, contagem utilizando um hemocitómetro, centrifugação (440 xg durante 5 min), e re-suspender o sedimento de células em MSC meio de manutenção fresco a uma concentração de 4,5 x 10 6 células / ml.
  3. Mergulhe o Scaffo PCLld em 70% de etanol S / N. Depois o solvente é evaporado, expor ambos os lados do andaime a luz germicida UV (254 nm) durante 5-8 min.
  4. Embeber o andaime PCL em uma solução de fibronectina de 20 ug / ml a 37 ° C durante 1 hora. Insira o andaime revestido de fibronectina na membrana de silicone. Montar o bioreactor como detalhado no passo 1.
  5. Distribuir 40 ul da suspensão celular de forma uniforme sobre o andaime PCL garantido. Permitir que as células se fixem durante 1-1,5 horas antes de se adicionar mais 1,5 ml de meio fresco para a câmara de vibração.
  6. Cultura cadafalso PCL MSC-carregado estaticamente por 3 dias e atualizar a mídia após a conclusão da cultura estática.
  7. Impor regimes de vibração selecionados para as construções celulares. Observação: Como um exemplo, as células são sujeitas a um 1-h-on-1-h-off (DO) a 200 Hz vibração com aw de 0 a 40 mM durante 12 horas por dia, durante até 7 dias. As construções submetidas a estímulos vibratórios são designadas como amostras Vib e os blovermelho estaticamente em câmaras de vibração idênticos servir como controles estáticos (Stat).

5. Avaliações biológicas

  1. Recolhe 200 ul meios de cultura de células a partir de cada câmara em dias alternados (dias 1, 3, 5, e 7) e juntar as aliquotas da mesma amostra em conjunto (800 mL cada).
  2. Quantificar a produção celular de metaloproteinase-1 (MMP1) e HA utilizando um kit ELISA MMP1 Desenvolvimento e um kit de ELISA competitivo ácido hialurônico, respectivamente, seguindo procedimento do fabricante. Enquanto isso, ensaiar a produção de precursor de elastina solúvel seguindo o procedimento de ELISA previamente relatado. Oito
  3. Após a conclusão do último ciclo de vibração no dia 7, remover rapidamente as construções celulares a partir das câmaras de vibração usando pinças cortantes e brevemente lavá-los com fosfato fria salina tamponada (PBS, 4 ° C).
  4. Para a coloração vivo / morto, incuba-se as construções com iodeto de propídio (1:2000 em PBS) eSyto-13 (1:1000 em PBS), simultaneamente, durante 5 min à TA. Imagem as construções marcadas com um microscópio confocal multiphoton.
  5. Separadamente, snap-congelar as construções celulares PBS-enxaguados em gelo seco e extrair o ARN celular total, seguindo um protocolo previamente relatado para a análise genética. 9
  6. Verificar a quantidade e qualidade do ARN extraído utilizando um espectrofotómetro de UV-Vis. As amostras de ARN com A260/A280 e razões A260/A230 de 1,8-2,2 são utilizados para subsequente análise qPCR.
  7. Reverso transcrever RNA (500 ng / amostra) em cDNA usando um kit de transcrição reversa disponível comercialmente.
  8. Realizar a reacção de PCR em um sistema de detecção de sequência em tempo real usando um PCR master mix disponível comercialmente seguindo o procedimento previamente detalhado. Oito
  9. Analisar os resultados qPCR utilizando software de análise de dados de qPCR comercial. Para garantir a confiabilidade da análise de dados, vários genes de referência (YWHAZ, TBP, PPIA) são empregados como intcontrolos Ernal, e a variância da eficiência de iniciadores específicos é levada em conta. oito

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Representative Results

Os andaimes PCL fabricados por electrospinning conter poros intersticiais porte micro e fibras entrelaçadas de forma aleatória, com um diâmetro médio de 4,7 mM (Figura 4A). Numa ampliação maior, ranhuras em nanoescala e poros são visíveis nas fibras individuais (Figura 4B). Revestimento dos andaimes com fibronectina melhora hidrofilicidade e facilita a adesão celular inicial / espalhando no cadafalso PCL (observação não publicada).

Formas de onda sinusoidal com uma frequência desejada (f, 100-300 Hz) e tensão (Vpp: 0-0,125 V) são introduzidos para o altifalante debaixo de cada câmara de vibração, e o ar confinado entre a parte inferior da membrana de silicone e o cone de papel de um mini-woofer é conduzido em oscilação. A oscilação de saída de ar para o andaime de PCL com ou sem células. LDV é usado para analisar as características de vibração do andaime em um dado f e Vpp,tendo em conta o índice de refracção de água (1,33). 20 Figura 5 mostra o deslocamento normal (w 0) no centro do andaime PCL como uma função da Vpp e f. As freqüências de vibração são escolhidos para refletir freqüências de língua humanos fundamentais. 21 Existe uma relação linear entre w 0 e Vpp na faixa de 0-,125 V para todas as freqüências testadas. Em um determinado Vpp, w 0 diminui à medida que aumenta f 100-300 Hz.

A condição específica de vibração (f = 200 Hz, Vpp = 0,1 V) é selecionado para análise posterior. O perfil de velocidade em função do tempo (Figura 6A) revela que o sinal sinusoidal introduzido para o altifalante é capturado pelo andaime PCL com alta fidelidade. O centro do andaime PCL oscila longitudinalmente com um pico de velocidade de 52 mm / seg, um pico de aceleração de 66 m / s 2 (~ 6,7 g) e umadeslocamento normal das ~ 40 mM. Os sinais harmónicos a 100, 300, 400 e 500 Hz são pelo menos uma ordem de magnitude mais baixa do que aqueles com a frequência fundamental (200 Hz). No entanto, se o valor for demasiado elevada Vpp (0,15 V), picos múltiplos de harmónicas de intensidade comparável à frequência fundamental são detectados (Figura 7). O perfil de vibração através do andaime é criado através da monitorização do deslocamento normal a partir de um total de 73 pontos representativos das direcções radiais da superfície do PCL (Figura 3). O mapa de cores 3D (Figura 8) demonstra que o detectada vibração sobre a superfície da membrana é axisymmetrical em relação ao centro e as suas posições de repouso. O deslocamento normal é encontrada para diminuir monotonamente do centro para a borda, onde a membrana está fixada.

MSCs cultivadas em andaimes PCL são cultivadas sob condições de vibração selecionados. As células submetidas a uma 7-daY de estimulação manter a viabilidade e proliferação propriedades semelhantes às dos controles estáticos (Figura 9), o que confirma que os suportes fibrosos foram cytocompatible e a vibração aplicada não resultou em qualquer perda de viabilidade. As respostas celulares a estímulos vibratórios são examinados os níveis de mRNA em termos de expressão de proteínas de ECM dobra vocais essenciais, tais como a elastina (ELN), hialuronano-sintase-1 (has1), COL3A1 e MMP1 (Figura 10). A DE vibração leva a um aumento de 2,3 vezes na expressão de ELN no dia 7, em relação aos controlos estáticos. Os estímulos vibratórios também um aumento da expressão COL3A1 moderadamente. Vale ressaltar que a expressão de enzimas importantes remodelação ECM, has1 e MMP1, é significativamente aumentada pelos sinais de vibração. Especificamente, o tratamento dinâmico resultou num aumento de 1,7 vezes da ~ ~ e de 16,3 para has1 e MMP1 expressão (ambos p <0,05), respectivamente, sobre os controlos estáticos no dia 7. No geral, o efeito indutivo das vibrações em has1 MMP1 e foi aumentada a partir do dia 3 ao dia 7.

Para substanciar os resultados qPCR, a produção celular de HA, elastina solúvel e MMP1 é quantificada por ELISA, ao nível da tradução (Figura 11). As células cultivadas dinamicamente produzir 4,2 ± 0,1 ug / mg (por peso seco de andaime) elastina solúvel após 7 dias de vibrações, ao passo que os controlos estáticos apenas se acumulam 2,7 ± 0,2 ug / mg) de elastina. Em média, 7 dias de vibrações resultar em 2,2 e aumento de 4,7 vezes na HA e secreção MMP1, em relação aos controles estáticos correspondentes.

Vídeo 1: Uma simulação 3D que mostra a montagem de um biorreator J2. O vídeo foi criado pela Autodesk 3ds Max Design (Cortesia de Congfei Xie).

"Fo: manter-together.within-page =" always "> Figura 1
. Figura 1 fotografia que ilustra a dimensão do molde Al usado para fabricar a membrana de silicone com manga entrincheirado Ø:. Diâmetro, d: espessura / profundidade, h:. Altura Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
.. Figura 2 fluxograma ilustrando o conjunto bioreactor (A) Uma fotografia de um de quatro braços em forma de andaime PCL, (B) uma fotografia que mostra o andaime PCL fixado na câmara de vibração e o laser vibrômetro focada na parte inferior da câmara, ( C) A seção transversalvista al da câmara de vibração. 1: andaime PCL (vermelho); 2: membrana de silicone (ciano); 3: Al bar estacionária; 4: top bloco de acrílico; 5: bloco de acrílico inferior; 6: mini-woofer; (D) vista lateral do módulo de vibração; (E) Uma fotografia que mostra todo o conjunto. Este valor foi modificado a partir Tong et al. 10 Direitos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Ilustração de membrana de silicone radialmente marcado para medições LDV um único ponto. Este valor foi modificado a partir Tong et al. 10 Direitos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc.


Figura 4. MEV de scaffolds PCL em diferentes ampliações. (A) 600x, (B) 7.000 X. Este valor foi modificado a partir Tong et al. 10 Direitos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. O deslocamento normal no centro da membrana de silicone (w 0) como uma função da frequência de aplicação (100, 200 e 300 Hz) e tensão de condução (Vpp = 0-0,125 V). Essa figura foi modificado de Tong et al. 10 Direitos de autor 2013, Ma ry Ann Liebert, Inc.

Figura 6
Características de vibração Figura 6. Detectados no centro da membrana de silicone com f = 200 Hz, e um perfil Vpp = 0,1 V. (A) Velocidade como uma função do tempo. (B) perfil de velocidade em função da frequência. (C) aceleração em função da frequência. (D) de deslocamento normal (w 0) como uma função da frequência. Este valor foi modificado a partir Tong et al. 10. Direitos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7. Deslocamento normal detectado no centro da membrana (w 0) como uma função da frequência, quando uma onda sinusoidal de 200 Hz é introduzido para o mini-woofer numa Vpp = 0,15 V.

Figura 8
Figura 8. Colormap 3D construído por gridding superfície usando os dados de deslocamento normais coletados de todos os locais marcados no cadafalso PCL. Este valor foi modificado a partir Tong et al. 10 Direitos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc.

Figura 9
A viabilidade celular Figura 9., Visualizadas por coloração vivo / morto, após 7 dias de vibrações. Essa figura foi modificado a partir de e Tongt al. 10 Direitos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10
Figura 10. Respostas celulares a estímulos vibratórios em termos da expressão de genes, de dobragem pertinente ECM vocais. A expressão do gene relativo (dobra mudança) é normalizada para os respectivos controlos estáticos no dia 3 e no dia 7 (linha de base a tracejado). **: Diferença significativa (p <0,05) entre os dias 3 e 7, #: mudou significativamente (p <0,05) em relação à linha de base. Os dados representam a média ± erro padrão da média (SEM, n = 4). Teste t bi-caudal do aluno é utilizado para a análise estatística, com p <0,05 sendo considerado como significativamente diferença (o mesmo que abaixo). Este valor foi modificado a partir Tong et al. 10 Direitos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc.

Figura 11
Quantidade Figura 11. Quantificação bioquímica da HA (A), solúvel ELN (B) e MMP1 (C) produzido por MSCs cultivadas no cadafalso PCL sob Stat e Vib condições para 7 dias. Total de moléculas de ECM por peso andaime seco (mg) é representada como a média ± SEM, n = 4 a partir do ensaio representativo #:. aumentada significativamente (p <0,05) em comparação com os controlos Stat. Este valor foi modificado a partir Tong et al. 10 Direitos de autor 2013, Mary Ann Liebert, Inc.

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Discussion

Engenharia de sucesso dos tecidos das pregas vocais funcionais in vitro requer a recriação de um microambiente-como prega vocal para mediar os comportamentos de células multipotentes. É geralmente aceite que o tecido ou órgão estruturas refletem as funções que são necessários para realizar. 22 para os tecidos das pregas vocais, as vibrações de alta frequência que ocorrem durante a fonação são propostas a ser importante para a maturação do tecido. Em nosso estudo, andaimes PCL são usados ​​para fornecer um suporte estrutural ligamento semelhante enquanto o biorreator prega vocal é projetado para introduzir sinais mecânicos fisiologicamente relevantes para as MSCs cultivadas. O biorreactor descrito aqui (J2) cria a vibração electromagnética através de colunas individuais e transfere a energia aerodinamicamente para as células cultivadas. Comparado ao nosso projeto anterior, 18 o sistema atual se move a fonte de estimulação vibratória diretamente abaixo de cada amostra bem, permitindo que fora de conversão de energia mais eficiente. Como resultado, um deslocamento normais significativamente maior e uma maior aceleração são alcançados usando o actual sistema. O design modular também minimiza variações de sistema e perturbação mecânica em diferentes câmaras de vibração.

Nosso projeto se baseia em uma membrana de silicone para entregar os sinais de vibração. Portanto, é importante para manter a integridade da membrana e homogeneidade. Após a solução precursora é vertida para o molde de alumínio, é desejável remover o excesso de líquido, arrastando uma lâmina de vidro em toda a superfície do molde. Membranas consistente, sem quaisquer bolhas de ar aprisionadas pode ser produzido através da redução da temperatura de cura, aumentando o tempo de cura. Além disso, uma solução de etanol a 70% pode ser usado para inchar temporariamente a membrana na interface de alumínio para permitir a fácil remoção de silicone curada. Para acomodar as construções celulares para cultura dinâmica em 3D, um sulco fino posicionado centralmente is moldados dentro da membrana de silicone, de tal modo que os suportes de PCL pode ser perifericamente fixado na câmara de vibração. A geometria da ranhura é ajustável; assim, a forma da construção celular pode ser ajustado em conformidade para imitar melhor a geometria das cordas vocais nativas. 23 Se o andaime PCL não esteja bem preso na membrana de silicone, os sinais detectados LDV no PCL e na zona exterior em que o silicone membrana não se sobrepõem perfeitamente. Quando da montagem do bioreactor, que é essencial que todos os componentes são fixados e apertadas com o mesmo grau, a fim de evitar movimentos indesejáveis ​​e para minimizar as variações de câmara da câmara.

Para validar a utilidade do bioreactor, as MSCs cultivadas em estruturas de suporte de PCL e são submetidos a intermitente (DE) vibrações durante 7 dias. A DE vibrações durante um período de várias horas por dia, são empregues para reproduzir as condições de fala dos utilizadores de voz pesados, por exemplo, profissional cantar ers e professores. 23 Ao contrário de biorreatores pregas vocais relatados anteriormente, o nosso não causam qualquer efeito prejudicial ou trauma fisiológico para as células.

As vibrações de 200 Hz são encontrados para diferencialmente regular a produção celular de componentes da MEC importantes. A elastina é uma proteína estrutural crucial que se encontra ao longo da dobra LP vocal, e transmite resiliência e elasticidade. 24 componentes amorfos intersticial, tais como HA, contribuir para a manutenção de tecido viscoelasticidade adequada e a prevenção da formação de cicatriz. 25,26 MSCs submetido a 7 dias de tratamento produzem uma quantidade significativamente maior de elastina do que as contrapartes estaticamente cultivadas. HA biossíntese também é sensível às vibrações, como confirmado pelos resultados de qPCR sobre os resultados has1 e ELISA no HA. Estes resultados sugerem que a estimulação vibratória habilitado pelo biorreator é propício para a produção de moléculas anti-cicatrizes.

jove_content "> volume de negócios ECM equilibrada depende de deposição de matriz concorrente e degradação. 27 colágeno tipo III é o maior de fibras colágenas reticular encontrado em pregas vocais, proporcionando o tecido com propriedades de suporte de carga. 28 As vibrações de 7 dias aqui aplicados aumentar a expressão do gene de COL3A1, mas a uma magnitude muito inferior ao de elastina. Portanto, as vibrações aplicadas diferencialmente regular maquinaria celular envolvido na síntese de colagénio III e elastina. Curiosamente, MMP1, um dos principais MMP envolvidas na degradação da matriz e remodelação tissular 27 , é altamente sensível aos estímulos vibratórios. Estes resultados são concordantes com os relatórios anteriores sobre induzida por vibração MMP1 regulação positiva por células aprisionadas numa matriz de HA 29. geral, os estímulos vibratórios gerados pelo bioreactor prega vocal profundamente mediar funções MSC, promovendo a homeostase de vocais matrizes dobra-like.

Sobretudo, o romance biorreator prega vocal apresentada aqui é modular e de fácil utilização, permitindo cultura celular dinâmica a ser realizada de uma forma reprodutível. No entanto, existem várias limitações no desenho actual. Em primeiro lugar, a amplitude de vibração, embora melhorado da versão J1, ainda é pequeno em comparação com o tecido da prega vocal. Em segundo lugar, o nosso biorreator não simula a colisão bilateral das pregas vocais durante a fonação normal. Em terceiro lugar, o nosso fibroso andaime PCL não reflete a anisotropia dos tecidos. O trabalho futuro é dedicado a melhorar o projeto para melhor imitar as condições de fonação nativas. Enquanto isso, os regimes ideais para a cultura dinâmica 3D será explorado para o conjunto vocal funcional sucesso vezes in vitro.

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Disclosures

Não existem interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Jeffrey Caplan para a sua formação e assessoria em imagem confocal. Agradecemos também o Keck Laboratório de Microscopia Eletrônica e Dr. Chaoying Ni de assistência SEM. Este trabalho é financiado pelo National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 e R01DC011377). ABZ reconhece NSF Integrativa Pós-Graduação e Pesquisa Estágio programa (IGERT) para financiamento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Sylgard 184 Cure the membrane at 100 °C for 2 hr
PCL Sigma Aldrich 440744-500G Mn ~80 kDa, dissolve O/N
Chloroform Sigma Aldrich C7559-5VL
Human bone marrow-derived MSCs Lonza PT-2501 Received with passage 2
MSC maintenance media Lonza PT-3001 10% FBS in basal media supplemented
with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent Life Technologies A11105-01
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500ML
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit R&D systems DY901
HA ELISA kit Echelon Biosciences  K-1200  
PBS Life Technologies 14190-136
Propidium iodide  Life Technologies P1304MP
Syto-13  Life Technologies S7575
QuantiTect reverse transcription kit  Qiagen 205311
SYBR Green PCR master mix Life Technologies 4309155
Replacement speaker DAYTON audio
(via Parts Express)
DS90-8 Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB
Ergo Micro torque screwdriver Mountz # 020377 Torque range: 20-120 cN·m
Stereo speaker selector RadioShack 40-244 Maximum power handling 50 W
Function generator  Agilent  33220A Frequency range 1 µHz-20 MHz
Power amplifier  PYLE audio PylePro PT2400 Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker
channels
Cell culture incubator  Thermo Fisher  Steri-Cult 3307
Syringe pump  New Era Pump Systems NE-300
High voltage power supply Spellman CZE 1000R Output voltage: 0-30 kV
Scanning electron microscope  JEOL-USA JSM-7400F
Desk gold sputter coater Denton Vacuum DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer  Polytec PDV-100 Non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system  Applied Biosystems ABI7300
Multiphoton confocal microscope Zeiss Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer  NanoDrop Products
via Thermo Scientific
ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software Polytec Acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software  OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software  Biogazelle V2.3
Aluminium alloy  McMaster-Carr Alloy 6061
Acrylic blocks McMaster-Carr
Polycarbonate anti-humidity chamber McMaster-Carr Impact-Resistant Polycarbonate
screws  McMaster-Carr
Electronic cable/wire
Medical grade PVC tubing US Plastic Corp. Tygon S-50-HL Clear, biocompatible
10 ml Syringe  Becton Dickinson 309604
21 G Blunt ended needle Small Parts NE-213PL-25 1-1/2" length
Alligator clip adapters  RadioShack 270-354 Fully insulated
8 mm Biopsy punch Sklar Surgical Instruments 96-1152 Sterile, disposable
12 mm Biopsy punch Acuderm (via Fisher Scientific) NC9998681
Tissue culture flasks Corning Cell culture treated

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References

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