נתיחה וניתוח במורד הזרם של הזברה פינק עוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Murray, J. R., Stanciauskas, M. E., Aralere, T. S., Saha, M. S. Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development. J. Vis. Exp. (88), e51596, doi:10.3791/51596 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פינק הזברה (guttata Taeniopygia) הפך אורגניזם מודל חשוב יותר ויותר בתחומים רבים של מחקר, כולל רעלים 1, 2, 3 התנהגות, וזיכרון ולמידת 4,5,6. כציפור השיר רק עם הגנום רצף, יש פינק הזברה פוטנציאל גדול לשימוש במחקרים התפתחותיים; עם זאת, מוקדם של פיתוח פינק זברה השלבים לא נחקרו היטב. היעדר המחקר בפיתוח פינק זברה ניתן לייחס את הקושי שלו לנתח את הביצה הקטנה ועובר. השיטה לנתיחה הבאה ממזערת את ניזק לרקמות עוברית, המאפשר חקירה של מורפולוגיה וביטוי גנים בכל שלבי התפתחות עוברית. זה מאפשר גם שדה בהיר והדמיה באיכות הקרינה של עוברים, השתמש בהליכים מולקולריים כגון הכלאה באתרו (ISH), מבחני התפשטות תאים, ומיצוי RNA למבחנים כמותיים כגון ריאה כמותייםl-Time PCR (qtRT-PCR). טכניקה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד שלבים מוקדמים של פיתוח, שהיו קשה בעבר לגישה.

Introduction

המטרה הכללית של טכניקה זו היא להשיג פינק זברה עוברים (guttata Taeniopygia) החל מהשלבים המוקדמים של עובר לשימוש במגוון רחב של מחקרים התפתחותיים. זברה פינק הפכו אורגניזם מודל ציפור שיר הדומיננטי והיה בשימוש נרחב במגוון תחומים, ובם רעלים 1,2, התנהגות 3, זיכרון ולמידת 4,5,6, neuroanatomy ההשוואתי 7,8, והתפתחות שפת 9,10 . כציפור השיר רק עם הגנום רצף, פינק הזברה מאפשר מחקר מולקולרי והגנטי של סדר הציפורי השיר, אשר מייצג מעל 50% ממיני ציפורים ידועים 11, 12,13.

למרות השימוש במבוגרים ופנקו זברה לנוער במגוון רחב של תחומים, כמה מחקרים שבוצעו בעוברים פינק זברה, במיוחד בשלבים מוקדמים של פיתוח. זו ניתן לייחס לגודל הקטן של הביצים שלהםnd עוברים, והמעמד החדש שלהם כ14,15,16 אורגניזם מודל למחקרים בהם את העוף (Gallus Gallus domesticus) שימש בעבר כ17,18,19,20,21 מערכת מודל דומיננטית. עם זאת, כלומדים שאינם קולניים, תרנגולות אינן מערכת מודל מתאימה ללימוד הבסיס הגנטי של למידה ווקאלית, פיתוח של למידה ווקאלית, תורשתיות, התנהגות, ומעגלי הגרעינים הבזליים-קליפת המוח המעורב בלמידה מוטורית 10.

חשוב לציין כי עוברים פינק זברה הם הרבה יותר עדין ויותר בקלות נפגע מעובר חומוס במהלך נתיחה ונהלים מולקולריים. בפרט, נדרשת זהירות רבה יותר בעת ביצוע פעולות permeabilization על עוברים פינק זברה. דטרגנטים חזקים ואנזימים שלא יפגעו עובר אפרוח יכולים לפגוע בעוברים פינק זברה. במונחים של טיפול באופן כללי, יש צורך לשים את הביצים פינק זברה בכוסות קטנות לפני ההשמה בחממהכדי למנוע מהם לפרוץ כאשר מתגלגלים במהלך דגירה.

זברה פינק נוחות למחקרים התנהגותיים, בקלות ובשטף גדול מתרבים בכל ימות שנה בשבי, והם לומדים ווקאלי. מאפיינים אלו מאפשרים את השימוש של פינק זברה כדי לענות על הצורך לאורגניזם מודל המשלב פיתוח, גנטיקה, והיבטים התנהגותיים של שפה. ניתוחי שיטות, כמפורט להלן, בשילוב עם מדריך הזמני שפותח לאחרונה ספציפי לפנק זברה 22, להפיק את פינק הזברה אורגניזם מודל ההתפתחותי סטנדרטי שימושי יותר ויותר. עם זאת, קבלת עוברים בשלבים מוקדמים יכולה להיות מרתיעה. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לקבל עוברים בראשית התפתחות בקלות. מחקרים חוקרים את ההתפתחות המוקדמת ואת הבסיס ההתפתחותי המולקולרי של התנהגויות מורכבות בפנקו זברה, או את השפעות טוקסיקולוגי בפיתוח בקטן אחרים, ציפורים passerine ימצאו המתודולוגיה לנתיחה זה שימושי.

Protocol

הצהרת אתיקה: השיטות נערכו עם פרושים זברה מבויתים ממושבת הרבייה במכללת ויליאם ומרי. כל הנהלים בעקבות הנחיות RSPCA 23 ואושרו על ידי מכללת ויליאם וOLAW של מרי (משרד המעבדה צער בעלי חיים) צער בעלי החיים Assurance (# A3713-01) והיו לו אישור הוועדה מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) (# 2013-06 -02-8721-Dacris).

1. אוסף ביצה ודגירה

  1. להקים זוגות פינק זברה באור 14:10: מחזור כהה. אספקת מזון, מים, חציר, וכרצונך מודעת תיבת קן. הערה: טיפול שוטף ופורים לפרושי זברה תואר 23 כן.
  2. הכן את חממת חומוס רגילה עם מדפים מטה. הערה: שמור על החממה המלאכותית ב37.5 (+ / - 1) מעלות צלזיוס עם 80 - לחות 95% על ידי הוספת מים לחלק התחתון של החממה על בסיס יומי. לאפשר החממה ללאזן במשך יומייםלפני השימוש.
    1. בחר כוסות קטנות להאכיל (5 x 7.6 סנטימטר) לפחות 2.5 סנטימטר עמוקים להחזיק ביצים באינקובטור. קו התחתון וקצוות התחתונים של הכוס עם שתי שכבות של מגבת נייר, כך שהכוס מרופדת, תוך שהוא מאפשרים את הביצים לגלגל בקלות. הנח כוסות אלה על מדפי ההטיה של החממה. הערה: יותר מדי ריפוד יכול לעכב מתגלגל, אשר ימנע דגירה מוצלחת עקב הידבקות עוברית הפנים הפגז.
  3. לאסוף את הביצים בשתי שעות לאחר תחילת מחזור האור. הערה: זו מקטינה פערים בפיתוח קרקע לזמן דגירה ניתנה בשל דגירה של הורים.
    1. לאסוף את ביצים בעדינות עם אגודל ואצבע בקצה והבסיס לאורכו של הביצה. השתמש בעיפרון משעמם, רך 4B גרפיט לתייג את המועד שנקבע וזמן שנאסף מהקן. שים לב: עיפרון 4B הרך יותר מפחית את הסיכון לעיפרון לשבור את קליפת הביצה השבירה.
    2. 1.3.2) מניחים 1 - 5 ביצים שכותרת בכל אחד גבחממה, כך שביצים יכולות להתגלגל באופן חופשי כדי למנוע הידבקות עוברית הפנימי של הקליפה. הערה: הצבת יותר מ 5 ביצים בכוס עשויה למנוע גלגול של הביצים בודדות ולהפחית את הכדאיות של עוברים.

2. ההסרה של עובר מביצה

  1. כדי להתכונן לנתיחה, להרכיב את החומרים הבאים: אזמל נקי, מלקחיים קנס הטו, ושני מלקחיים בסדר הטה נוספים. הנח 10 x 10 סנטימטר שוקל נייר על בסיס ההיקף לנתח כדי לספק משטח נקי, שאינו סופג לנתיחה. הערה: הנייר לשקול הוא חיוני משום שהיא מאפשרת מניפולציה קלה של החלמון והוא המשטח הטוב ביותר לחיתוך הקרום העדין עם אזמל.
  2. הכן aliquot של חיץ מלוח פוספט (1X PBS) בצינור פוליפרופילן 50 מיליליטר, ולרכוש לפחות שלוש טפטפות העברה ודלי פסולת קטנה. אם לתקן את העוברים, להכין aliquot של paraformaldehyde 4% (PFA) זהירות:. אדי PFA הם רעילים,ד צריכים לעשות את כל הצעדים הכרוכים בPFA בתוך מנדף כדי לצמצם את החשיפה. אם הבזק הקפאת העוברים, להשיג חנקן נוזלי ולשמור אותו בסמוך להיקף לנתח. עקרות היא לא בעיה עבור פרוטוקול זה לנתיחה, אך להבטיח שכל החומרים הם נקיים.
  3. הסר את הביצה מן החממה בנקודת הזמן הדרושה לשלב הרצוי כמתואר במדריך להיערכות פינק זברה 22. הערה: הסר את הביצים לאחר 36 שעות של דגירה לנתח שלב 6 עוברים (איור 4 א) 22 ולהסיר את הביצים לאחר 56 שעות של דגירה לנתח שלב 12 עוברים (איור 3 א) 22.
  4. באמצעות מנורת הפנס סיבים אופטי, נר הביצה על ידי מחזיק אותו לאורך ציר האור ובוהק האנכי באמצעות הביצה כדי להאיר את הפנים. הנח את הקצה של האור מאחורי הביצה ולאתר את החלמון ואת העובר המתפתח.
    1. מקם את האזמל בצד השני את החלמון ולחתוך לאורך הביצה מקצה לבסיס עם לחץ קלוש.
  5. הסר את התוכן של הביצה על ידי הפעלת לחץ בזהירות על הקצה והבסיס של הביצה עם האגודל ואצבע המורה, או על ידי בעדינות החטטניות בנפרד את קליפת הביצה לאורך החתך עם מלקחיים. פתח את הביצה ישירות מעל הנייר לשקול כך שהחלמון מתגלגל החוצה בעדינות.
  6. לבחון את החלמון לאזור הלבן של צומת, המופיע כטבעת לבנה קלושה המקיפה את ההתפתחות עוברית ולכוון את החלמון באמצעות קנס נוסף הטה מלקחיים כך שהעובר נמצא במרכז.
    הערה: אם עיגול לבן קלוש על פני השטח של החלמון לא הוא ציין, לקחת את המלקחיים בסדר ובעדינות לגלגל את החלמון שוב עד שהעובר הוא בחלק העליון של החלמון. הערה: שלבים 1 - 9 22, הדיסק העוברי הוא פחות מ -6 מ"מ קוטר וגלוי כדיסק קלוש, מעט אטום על פני השטח של החלמון - ראה איור 1 עבור הפניה. לשלבים 10 ומעלה 22 בריכות דם, תאפשר שיפור visibility של העובר, אבל לטפל כדי למנוע ניקוב שק החלמון, שכן הדבר הופך את איתור העובר קשה.

3. ההפרדה העובר מרקמות חוץ עוברי

  1. לנקב את הקצוות של החלמון כדי להקל על לחץ (איור 1), ולבצע חתכים בודדים על פני האורך של קוטר החלמון לצד הדיסק העוברי. חזור על מה שהופך את הקווים האלכסוניים האלה עד הקטע של החלמון מכיל את העובר הופרד בהצלחה (איור 1). הערה: שלב זה מאפשר את מסת החלמון תישאר שלמה, אבל הלחץ המופחת על פני השטח של החלמון מאפשר יותר דיוק בעת חיתוך סביב העובר, מניעת נזק למבנים עובריים.
  2. הסר את הקצוות של החלמון עם טפטפת העברה. הערה: סר כמו חלמון ככל האפשר, אבל להשאיר כמות קטנה, כדי שהעובר לא ידבק למשטח היבש של הנייר והדמעה לשקול.
  3. שטוף את הדיסק העוברי על ידי dispensing 1X PBS בזווית של ° 45 לכיוון החלק התחתון של העובר. הנח את קצה פיפטה ההעברה לצד, לא מעל הדיסק העוברי. אם הצרכים של חלמון נוסף שיש להסירו, להפריד בין כל חלמון עם האזמל על נייר לשקול לפני העברת העובר לצלחת פטרי. הערה: שיטה זו מסירה את העובר מפני שטח של נייר לשקול.
  4. העבר את העובר באמצעות פיפטה העברה יחד עם נפח מינימאלי של 1X PBS לצלחת קטנה, פטרי מפלסטיק. שטוף את העובר על ידי הוספה יותר 1X PBS לתוך צלחת פטרי ונוטפות 1X PBS קרובה, אך לא ישירות על גבי, את העובר. לערבל את צלחת פטרי לשטוף ולהסיר את חלמון שייר, להטות את צלחת פטרי, ולהסיר פסולת 1X PBS עם טפטפת ההעברה.
    הערה: כאשר PBS 1X מוסר, העובר בדרך כלל אינו עומד בחלק התחתון של צלחת פטרי בגלל משטח הפלסטיק הוא חלקלק עם שיורי 1X PBS. עם זאת, ניתן להוסיף יותר 1X PBS אם העובר נדבק לצלחת.
    אם לא תיקוןהוא עובר, בצע את שלבי 3.5 ו3.6. אם הבזק הקפאת העובר, דלג לשלב 3.8 באופן מיידי.
  5. אם תיקן את העובר לכלאה באתר, להוסיף מייד PFA 4% לצלחת פטרי כדי להטביע את העובר. לטפטף PFA 4% ישירות על גבי החלק העליון של העובר על מנת לשטח אותו; זה מונע את העובר ממסתלסל. תקן את העובר בPFA 4% ב-C ° 4 לשעות 12.
    1. לאחר קיבוע, מייבש את העוברים במתנול מדורג פתרונות (MeOH) ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס ב100% MeOH.
  6. אם העובר הוא בין שלבי 1 - 8 22, להסיר את קרום vitelline דבק בעובר. הערה: ניתן לעשות זאת בשלב זה במהלך או לאחר הקיבוע. עוברים צעירים משלב 8 22 לא דמיינו בקלות משום שהם לדבוק בקרום vitelline, טשטוש מבנים מרכזיים כפי שניתן לראות באיור 2 א.
    1. גריפ הקצה של הקרום שמשתרע מעבר לאזור של צומת עם מלקחיים עדינים נוספים. Carefully להעיף את העובר על מספר רב של פעמים כדי לשטוף את גרגרי חלמון שייר וכדי לשחרר את ההיצמדות של הדיסק העוברי לקרום vitelline. הערה: אל תיגע במרכזו של העובר, שכן הדבר יפגע במבנים עובריים.
    2. אם פער אינו מופיע בין האזור לצומת וקרום vitelline, בעדינות לגרד את האזור של צומת עם קנס הנוסף הטה מלקחיים כדי לשחרר אותו מקרום vitelline. גריפ קרום vitelline עם קנס הנוסף הטה מלקחיים ומשוך בעדינות מן העובר. במידת צורך, משוך בעדינות את העובר מהקרום vitelline על ידי אחיזה בקצה ההיקפי של הדיסק העוברי באזור של צומת.
    3. מחק את קרום vitelline בפסולת ביולוגית מסוכן 1 (רמת בטיחות ביולוגית 1) לאחר ההסרה.
  7. בעת ביצוע assay ISH בשלבים עובריים צעירים, בצע את פרוטוקולי ההר ISH סטנדרטיים לגמרי עבור עובר חומוס 24, 25, אלא לשקול את ההצעות הבאות. כדי לצמצם את פגיעה בעוברים במהלך הליך ISH, השתמש בקבוקון זכוכית 5 מיליליטר יחיד עם כובע בורג לכל עובר. רק למלא בקבוקונים עם 2 - 3 מיליליטר של תמיסה, להבטיח כי העוברים הם שקועים באופן מלא. בקבוקוני Nutate אנכי על ידי הצבת 5 מיליליטר בקבוקונים למדף קלקר (או כל מתלה שתשאיר את הבקבוקונים מאובטחים) כי הוא מאובטח לnutator. הערה: אמצעי זהירות זה מונע את העובר מלהיות קרוע, אשר יכולה להתרחש כאשר הוא בא במגע עם את המכסה של הבקבוקון במהלך nutation האופקי.
  8. בשלב עוברים 6 - 0 22, לטפל עם 5 מיקרוגרם / מיליליטר proteinase K ב1X PTW במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. טיפול בעוברים מבוימים 7-12 22 עם 10 proteinase מיקרוגרם / מיליליטר K ב1X PTW 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפחית מכתים רקע.
  9. כדי לייצר תגובת צבע מספיק כדי לזהות רמות נמוכות של ביטוי גנים בשלבי 1 - 10 22, דגירה עם ריכוז בדיקה 10 מיקרוגרם / מיליליטר לשעה 12. לשלבים בוגרים יותר, דגירה עם 1 & #956; גר '/ מיליליטר ריכוז בדיקה ב60 ° C.
  • אם עובר הקפאת פלאש, להוסיף במהירות 2 - 3 מיליליטר 1X PBS לצלחת פטרי הבא לנתיחה ולהטות את צלחת פטרי כדי להפריד את העובר מגרגירי החלמון. הסר את הנוזל וחזור 2 - 3 פעמים כדי להסיר את כל החלמון. באמצעות קנס שקצהו מלקחיים, עובר העברה לצינור microcentrifuge מראש שכותרתו ופלאש הקפאה בחנקן נוזלי לפני האחסון ב -80 ° C.
  • 4. הנייד edu למניעת הפצת הנשק Assay. התאגדות ואיתור של edu בעוברי פינץ' זברה.

    1. נר הביצה באמצעות מנורת הפנס סיבים האופטיים לאתר את העובר או חלמון.
    2. סמן את הצד של ההפך הביצה למיקום של העובר או חלמון בתוך הביצה כדי להבטיח שהעובר לא נפגע במהלך תהליך microinjection.
    3. קו צלחת פלסטיק 60 מ"מ עם פלסטלינה ולעצב אותו בצורה של קערה כדי להחזיק את הביצה בכיוון הרצוי. המקום המסומן צריך להיותאוריינטציה כדי לאפשר החדרת מחט microinjection באמצעות micromanipulator. הערה: החימר יתייצב הביצה במהלך microinjection וברחבי הדגירה בשלב 4.11.
    4. משוך שתי מחטי microinjection נימי זכוכית. להקהות מחט אחת לתקוע חור לתוך הביצה בנקודה המסומנת. הכן את מחט microinjection השנייה להזרקה על ידי backloading אותו עם שמן מינרלים והכנסתו לmicroinjector.
    5. הגדרת עוצמת הקול של פתרון שפורסם לכל זריקה ל59.8 NL על microinjector.
    6. טען את מחט microinjection עם פתרון המניות edu 10 מ"מ.
    7. ליצור חור במעטפת על המקום המסומן בנימי הזכוכית הקהות, נזהר שלא לשבור את הקליפה או ירידה חתיכות של הפגז לתוך חלל הביצה. לכוון את הביצה כך שהחור הוא בזווית של ° 45, המאפשר למחט microinjection להיות מוכנסת ישירות דרך החלל לחלמון או העובר.
    8. שימוש micromanipulator, הכנס אתנטען מחט כ 1.0 סנטימטר לתוך החלל.
    9. הזרק את הכמות הרצויה של פתרון edu ישירות על העובר או החלמון מתפתח. הערה: מקסימום של 478 NL של edu ניתן להזריק מבלי לגרום למוות עוברי.
    10. מייד עוטף את הביצה ואת בעל חימר עם מספר שכבות של ניילון נצמד כדי לכסות את הביצה ואת המנה, כדי למנוע התייבשות של העובר במהלך דגירה. קלטת הקצוות של העטיפה הפלסטיק לחלק התחתון של המנה, כדי למנוע מהפלסטיק unwrapping במהלך דגירה. הערה: הניילון נצמד צריך רק להסיר מייד לפני הניתוח.
    11. אפשר התאים מתרבים עתה לשלב edu על ידי דוגרים הביצה על 37 מעלות צלזיוס עד שיגיע לשלב הרצוי. לאחר הזרקה, לא יחזור ביצה להטיית מדפים בחממה. מניחים את הצלחת עטופה בפלסטיק חימר בשורה על משטח יציב בתוך האינקובטור.
    12. הסר את הניילון הנצמד ולנתח את העובר בעקבות הפרוטוקול האמור.תקן את העובר בPFA 4% ו דגירה שעות 12 על 4 מעלות צלזיוס כפי שתואר לעיל. לאחר קיבוע, לשטוף עם 100% אתנול (EtOH) למשך 5 דקות וחנות בEtOH 100% טריים ב -20 ° C עד לניתוח נוסף.

    5. Edu "לחץ על" פרוטוקול תגובה

    כל הצעדים הבאים מבוצעים בבקבוקוני זכוכית.

    1. רעננותם עוברים עם שטיפות 5 דקות רצופות מהפעולות הבאות:
    2. EtOH, 75% EtOH ו25% deionized סטרילי מים מזוקקים (SDD), 50% EtOH ו50% מים SDD, 25% EtOH ו75% 1X PTW, 100% PTW 1X
    3. לשטוף שלוש פעמים ב100% PTW 1X 10 דקות כל אחד.
    4. לדלל את תוסף תגובת חיץ (קיט הרכיב F) על ידי שילוב של חלק 1 של פתרון 10X חיץ המניה (10 μl) עד 9 חלקים SDD מים (90 μl).
    5. מכין את תערובת התגובה בצינור נפרד על ידי הערבוב הבא: 875 μl 1X PBS, 20 μl CuSO 4, 5 אזיד μl, 100 μl תוסף חיץ תגובה בדילול מלא.הערה: נפח של תערובת התגובה וניתן לשנותם במורד. התגובה תעבוד אם העובר מכוסה לחלוטין בתערובת התגובה. מוסיף את התוסף בדילול חיץ תגובה (שלב 5.3) מייד לפני השימוש. כל הצעדים הבאים מבוצעים בחושך. כסה את העוברים עם נייר כסף כדי להגן מפני האור.
    6. מכסה את צלוחיות עם נייר אלומיניום, ודגירה אותם במאונך בטמפרטורת חדר במשך שעות על ידי הצבת אותם במעמד קלקר המצורף nutator.
    7. לשטוף את העוברים 3 פעמים בטריים 1X PBS 10 דקות כל אחד.
    8. דגירה את העוברים בPFA 4% טריים הלילה בשעה 4 ° C.
    9. לשטוף 3 פעמים ב 1X PBS 10 דקות כל אחד וחנות ברענן 1X PBS ב 4 ° C. כסה את העוברים בנייר עד לניתוח נוסף.

    Representative Results

    הצעדים נתחו באיור 1 מצביעים על הופעתו של העובר בזמן שמחובר לממברנה vitelline () ולהדגים את השיטה הנכונה כדי להפריד את העובר מן החלמון (ב '). העובר יכול להיות מזוהה על ידי האזור של צומת, שהוא הרבה יותר קל מאשר קרום vitelline. העובר עצמו הוא לעתים קרובות קשה להבחין עד החלמון הוא חתך משם. ברגע שהעובר הוא גזור מהביצה, זה יכול להיות קבוע או הבזק הוקפא לשימוש עתידי. אם הכלאה באתר מתוכנן לעובר גזור, יש צורך להסיר את קרום vitelline כי הוא דבק בעובר דרך האזור של צומת. איור 2 ממחיש את הנראות משופרות של העובר ברגע שקרום זה מוסר (ג), והדרך הנכונה לקלף את קרום vitelline (A, B). לאחר נתיחה וקיבעון, הר שלם הכלאה באתרו בוצע כפי שניתן לראות באיור 3 (, א ', ב', ב '') ואיור 4 (, א', ב ', ב') ואיור 5 (A, B, C) ​​כדי לזהות הבדלים בorthodenticle homeobox 2 (ביטוי Otx2) בעוברים מבחינה התפתחותית שנחשפו למינונים נמוכים של מתיל כספי. איור 5 מראה תוצאות בדיקה תחושה, חוסר הפגנה של רקע. באיור 4, למרות היותו גזור מן הביצה באותה נקודת הזמן, את העובר מבחינה התפתחותית החשוף לתיל כספי (MeHg) התקדם שלב 5 22 (ב ', ב'), ואילו עובר השליטה פיתח לשלב 6 22 (, '). הקבוצה של עוברים גזורים ומוצגת באיור 4 נאספו מהקן ולקחה מן החממה באותו הזמן. למרות שחלק וריאציה טבעית נמצאת בפיתוח, המבוסס על נתונים נתיחה קודמים, אין זה סביר כי תנודות טמפרטורה בחממה יגרמו רק את העוברים מהתיל כספיים עמודים לדקה 2.4 להיות develo עיכב pmentally. ההבדלים בשלבים להצביע על שינויים בהתפשטות תאים בעוברים התפתחותית החשופים לתיל כספי.

    לפני הנתיחה, edu הוזרק ליום 2 ביצים ואיפשר לדגירת הלילה. לאחר נתיחה וקיבעון של השלב 16 22 עובר, edu היה דמיינו באמצעות "לחץ על" כימיה, המאפשר זיהוי של תאים מתרבים כפי שניתן לראות באיור 6 (A, B, C). חשוב לעקוב בקפידה נקודות זמן בעת ​​ביצוע ביצים באינקובטור ובמהלך הניתוחים, כמו חשיפה לתיל כספי או ביצוע assay edu עלול לשבש התקדמות התפתחותית. ההזרקה המוקדמת בוצעה ביום 0, אשר היה היום של איסוף כמפורט בשלב 1.3. העובר הזה היה גזור כ 38 שעות מאוחר יותר (שלב 7 22). שיעור ההישרדות נמצא כ 90% (שיעור זהה עובר בקרה), כל עוד סכום ההזרקה היה תחת 478 NL.

    "Jove_content"> מתודולוגיה לנתיחה זו מאפשרת גם להפקת RNA באיכות גבוהה. לאחר לנתח שלב 16 22 עוברים, מיצוי RNA בוצע על פי הפרוטוקול של היצרן ללא אופטימיזציה הנדרשת, כפי שניתן לראות באיור 7. הסרת קרום vitelline הייתה מיותרת להפקת RNA, ומאוחר יותר יישומי qRT-PCR.

    הערה: כל נתוני העובר הם בכיוון, כך שהאזורים הקדמי והאחוריים הם בחלק העליון והתחתון של התמונות, בהתאמה.

    איור 1
    איור 1. נוהל איתור ולנתח עוברים פינק זברה, שלבי 1-10 22. אתר עובר על ידי בעדינות מגלגל את החלמון עד לבן הדיסק הקלוש הוא לכאורה (א '). ברגעעובר נמצא במרכזו של החלמון, החלמון הוא גזור באופן הדרגתי (ב ') שבו החתך הראשון מקל על לחץ של קרום vitelline (1) וקיצוצים שלאחר מכן (2) גובל באזור של צומת (ZJ) שהוא דבק בקרום vitelline. ברים סולם מייצגים 1 מ"מ.

    איור 2
    איור 2. הסרת קרום vitelline ונראות של מבנים עובריים. בעקבות ההסרה של העובר מהחלמון, עובר מקום בצלחת פטרי המכילה 4% PFA. אם הכלאה באתר צריכה להתבצע, נראות של המבנים העובריים היא חיוניות ויכולות להיות מושגת על ידי הסרת קרום vitelline (א '). גריפ קרום vitelline עם קנס נוסף הטה מלקחיים ובעדינות לקלף אותו מעובר על ידי טיפול בעובר באופן ישיר בקצה החיצוני, במידת צורך(ב). הסרת קרום vitelline מגבירה בהירות של מבנים עובריים, ומאפשרת לעוברים להיות צילמו או מעובד עם הכלאה באתרו (C). ברים סולם מייצגים 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 3
    איור 3. הר שלם הכלאה באתרו שבוצע על העוברים פינק זברה התפתחותית חשופים לתיל כספי. דפוסי ביטוי של orthodenticle homeobox 2 (Otx2) התאפיינו בעוברים שנחשפו ל0.0 תיל כספי עמודים לדקה (, ') ו2.4 תיל כספי עמודים לדקה (ב', ב ' ') באמצעות דיאטת הורים. המטלותrsal () וביטוי הגחון (א ') של Otx2 גלוי לאורך שלפוחית ​​המוח התיכון והאופטי בשלב 22 12. עוברי קבוצת הטיפול נותחו באותה נקודת הזמן, אבל היו עיכוב התפתחותי כפי שניתן לראות בגב (B) ומבט הגחון (ב ') של מבני ראש, אשר אופייניים לשלב 11 22 קיצורים:. MB, המוח התיכון; אופ, שלפוחית ​​אופטית. ברים סולם מייצגים 1 מ"מ.

    איור 4
    איור 4. הר שלם   באתר   הכלאה בוצעה על העוברים פינק זברה התפתחותית החשופים לתיל כספי. דפוסי ביטוי של orthodenticle homeobox 2 (Otx2) אופיינו בשלב 6 22 אמברי מערכת הפעלה חשופה לתיל כספי 0.0 עמודים לדקה (, ') ושלב 5 22 עוברים שנחשפו ל2.4 תיל כספי עמודים לדקה (ב', ב ') באמצעות דיאטת הורים. קיצורים: בבוקר, בשולים קדמי של המזודרם; לא, notochord, המזודרם notochord; פו, proamnion, blastopore הקדמי; ps, תכונה ראשונית 22. ברים סולם מייצגים 1 מ"מ.

    איור 5
    איור 5. הר שלם באתרם   הכלאה בוצעה על עוברים פינק זברה באמצעות בדיקה תחושה. () שלב 5 22 עובר. (ב ') בשלב מוקדם 6 22 עובר. (C) שלב 11 עובר 22. ברים סולם מייצגים 1 מ"מ.

    6 "src =" / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg "/>
    איור 6. התאגדות edu וtection דה בעוברים פינק זברה. Edu "לחץ" כימיה הייתה בשימוש כדי לזהות תאים מתרבים בשלב 16 22 עובר (A, B, C). Edu הוא שולב DNA במקום של תימידין 26, 27 והוא זוהה באמצעות לחץ כימיה 27. התפשטות היא נראית בבירור בקצוות לרוחב של somites, וtailbud. לוח מראה ריבוי המתרחש באופן בלעדי באחורי של העובר וגם מראה תאי שגשוג פרט. הלוח ב 'מציג את מיקומי שגשוג בכל העובר. לוח ג מראה האזור הקדמי, ומציג את telencephalon השגשוג מאוד (TE) ביתר פירוט. קיצורים: af, לקפל מי שפיר; FLB, ניצן forelimb; HLB, ניצן hindlimb; le, שלפוחית ​​עדשה; ms, mesencephalon; הר, Metencephalon; OPC, גביע אופטי; הרשות, קשת בלוע; SM, המזודרם somite; שחפת, tailbud; te, telencephalon. ברים סולם מייצגים 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 7
    איור 7. איכות של RNA המופק מעוברים גזורים פינק זברה. בקרה (0.0 עמודים לדקה) ו1.2 עוברי תיל כספיים עמודים לדקה נותחה ופלאש קפוא כפי שמתואר בשלב 3.8. כל נתיב מציג RNA המופק משני עוברים הומוגני מכל קבוצת טיפול.

    Discussion

    פיתוח אחרונים של מדריך עובריים בימוי 22 וביאור הגנום לעשות פינק הזברה אורגניזם מודל רצוי למחקרים התפתחותיים. עם זאת, בגודל ושבריריות הקטן של העוברים פינק זברה, אשר נעו מ 3 עד 7 מ"מ בשלבי 1 - 10 22, יכולים לעשות והניתוחים קשים 11, 14. איתור והסרה נקיה עוברים מפני שטח של החלמון יכול להיות מאתגר. פרוטוקול זה מספק פירוט מספיק כדי לבצע את ההליך בקלות. פרוטוקול זה מדגים את השלבים הקריטיים, כי הם בדרך כלל לא ידועים, אך נחוצים כדי להבטיח לנתיחה מוצלחת. לדוגמא, זה הכרחי כדי להשאיר שכבה קטנה של חלמון בין העובר והגיליון לשקול נייר כדי למנוע דבק.

    שני זיהוי וההסרה של העובר יכולים להיות קשים. כדי לפתור זיהוי העובר על פני השטח של החלמון, להאיר ישירות מעל החלמון אחרי זה ישהוסר מהביצה, ולהסתכל על החלמון בזווית של ° 45 למצוא את העובר. ברגע שהעובר נמצא, לחתוך את החלמון בשוקל נייר נזהר שלא לקרוע את העובר.

    אם יישומים נוספים כוללים הדמיה להבדלים אנטומיים, הכלאה באתר, או מבחני התפשטות תאים, חשוב להסיר את קרום vitelline בשלב 1 - 8 22 להדמיה טובה יותר של מבנים. אם נתקל בקשיים בעת הסרת החלמון או קרום vitelline בשלבים מוקדמים, לתקן את העובר בPFA 4% לפני שטיפה ב1X PBS להפחתת שבירות עוברית. על ידי הסרת ראשונה קרום vitelline במהלך הנתיחה כפי שתואר, מבנים גלויים לעין וללא שינוי בעוברים פינק זברה לאחר ביצוע הכלאה באתרו.

    הגבלה של edu היא ממשל שכרכי מינון מעל 478 מוביל NL הרוג עוברי. עם זאת, טווח המינון העצום מאפשר varyinרמות גרם של תיוג תא שגשוג.

    התגובה "לחץ" בשימוש בערכה זו היא הנחושת (AAC Cu (I)) (I) האיץ-alkyne-תזיד-cycloaddition. בתגובה הספציפית הזה, מולקולה אנלוגית תימידין המכיל alkyne (edu) משולבת באופן פעיל על ידי חלוקת תאים. קבוצת alkyne בedu בולטת החוצה ממבנה הסליל של ה-DNA, והוא זוהה על ידי חשיפה למולקולה אזיד מצומד למולקולה ירוקה, ניאון אשר נקשר לקבוצת alkyne בחינם. הקרינה הירוקה מראה תאים מתרבים לאחרונה בעובר. יו orthogonality של אזיד והקבוצות alkyne מונעים כתמים שאינם ספציפיים, כי מינים תגובתי אלה אינם נוכחים באופן טבעי ביצורים. כמו כן, כי ה-DNA לא צריך להיות מפוגל על מנת שהתגובה להתרחש, ניתוח ה-DNA תלוי נוסף יכול להיות מבוצע 27 בקלות.

    מגבלה המובנית של שיטה זו היא בגודל הקטן וFragility של עוברים פינק זברה. הסרת קרום vitelline של עוברים בשלבים 1 - 15 22 יכול לגרום למבנים עובריים מזיקים אם אינו מבוצע בזהירות. עם זאת, פרוטוקול זה מפשט את השיטה לנתיחה, ומאפשר לחוקרים להשתמש בשלבים עובריים מוקדם לבחון אנומליות מבנית וביטוי גנים שלא נחקר בעבר בעומק. פרוטוקול זה מפותח את הדרך לשפע של מבחני סלולריים מולקולריים שיאפשר לחוקרים לקבוע את מקורותיה ההתפתחותי של פנוטיפים מבוגרים. לדוגמא, ניתן יהיה לבחון ביטוי גנים מעורב בלמידה ווקאלית בתנאים סביבתיים שונים או בעקבות טיפולים תרופתיים בשלבים המוקדמים של פיתוח 28, 29,30,31. למרות שלא הפגין במאמר זה, בשיטה זו פוטנציאל המאפשרת להליכים אחרים כגון רדיואקטיביים הכלאה באתרו על סעיפי זברה פינק רקמות וelectroporation / באובניתוח o 32, 33,34. בהתחשב בכך שפנק הזברה כבר נקבע כאורגניזם מודל חשוב בתוך גוף עצום של ספרות, במחקרים מסוג הזדמנויות שלא נוצל לקשר מנגנוני התפתחות בפיזיולוגיה והתנהגות בוגרים, בפרט התפתחות השפה 7, 9.

    Disclosures

    יש המחברים אין לחשוף.

    Acknowledgments

    המחברים מודים למקורות המימון שלהם, תכנית הווארד יוז הרפואי במכון לתואר ראשון מדע חינוך למכללת ויליאם ומרי; נותן חסות לגרנט: NIH (MSS); מספר גרנט: R15NS067566. הם גם מכירים תמיכה ממכללת ויליאם ומרי, החוג לביולוגיה במכללה לאמנויות ומדעים לקבלת סיוע בטיפול בבעלי חיים.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chicken egg incubator We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model   
    Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    Dissection microscope  We use Olympus SZ61
    7'' Drummond capillary for Nanoject II injector Drummond 3-00-203-G/X
    Drummond Nanoject II microinjector Drummond
    Dumont Tweezers #55 World Precision Instruments 14099
    Ethanol (EtOH)
    50 ml Falcon tube (polypropylene) Fisher Scientific 06-443-18 
    FastPrep Lysis Matrix H tubes MP biomedicals 6917-100 Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) Dolan-Jenner Industries  Fiber-Lite MI-150 
    Glass vials with screw cap (DEPC treated) Fisher Scientific 03-338A
    Microcentrifuge eppe tube (1.5 ml) Fisher Scientific 05-408-129
    Mineral oil Sigma-Aldrich M-8410
    Modeling Clay Any brand
    Narshige PB-7 needle puller Narshige
    Omni Bead Ruptor Homogenizer OMNI International 19-010 Used for RNA extraction
    4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. 
    Phosphate buffered saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, adjust pH to 7.4
    Phosphate buffered saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dibasic, 200 ml Barnstead H2O, adjust pH to 6.5
    Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, adjust pH to 7.4, 2 ml Tween-20
    35 ml Plastic Petri dish  Fisher Scientific 08-757-100A
    plastic wrap Any brand
    Prepease RNA Spin Kit PrepEase, Affymetrix 78766 1 KT Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Reaction Mix: 875 μl 1xPBS, 100 mM 20 μl CuSO4 (Kit Component E), 5 μl Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 μl diluted reaction buffer additive (Kit Component F) Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    sdd H2O
    Seed cup  We use it as a container when incubating eggs
    Stainless steel scalpel 
    Standard nest box We use Abba Plastic Finch Nestboxes
    4 ml, Teflon Lined Cap, Glass Vials Fisher Scientific 02-912-352
    Transfer pipettes (polyethylene) Fisher Scientific 13-711-7M 
    4 x 4 weigh paper Fisher Scientific 09-898-12B

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches. Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).
    2. Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata). Chemosphere. 90, 125-131 (2013).
    3. Maney, D. L., Goodson, J. L. Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds. Adv Genet. 75, 83-119 (2011).
    4. Kirn, J. R. The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning. Brain and Language. 115, 29-44 (2010).
    5. Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).
    6. Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning. PLoS One. 6, (2011).
    7. Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language. Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).
    8. Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch. Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).
    9. Jarvis, E. D., et al. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).
    10. Brainard, M. S., Doupe, A. J. Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research. Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).
    11. Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches. J Physiol Paris. (2012).
    12. Warren, W. C., et al. The genome of a songbird. Nature. 464, 757-762 (2010).
    13. Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).
    14. Birkhead, T. R., et al. Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).
    15. Haesler, S., et al. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
    16. Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival. Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).
    17. Stern, C. D. The chick; a great model system becomes even greater. Dev Cell. 8, 9-17 (2005).
    18. Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins. Brain Research. 1424, 67-101 (2011).
    19. Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).
    20. Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Development. 7, (2012).
    21. Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).
    22. Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata. J Morphol. (2013).
    23. Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. (2001).
    24. Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue. Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).
    25. Pizard, A., et al. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).
    26. Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling. Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).
    27. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).
    28. Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata). Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).
    29. Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch. Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).
    30. Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus. Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).
    31. Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites. The Auk. 127, 156-161 (2010).
    32. Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. Journal of Visualized Experiments. (2012).
    33. Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes. PLoS One. 7, (2012).
    34. Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities. The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics