Dissezione e analisi valle di Zebra Finch embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo

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Murray, J. R., Stanciauskas, M. E., Aralere, T. S., Saha, M. S. Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development. J. Vis. Exp. (88), e51596, doi:10.3791/51596 (2014).

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Abstract

Il diamante mandarino (Taeniopygia guttata) è diventato un sempre più importante organismo modello in molti settori della ricerca, tra cui tossicologia 1, 2, 3 comportamenti, e la memoria e l'apprendimento 4,5,6. Come l'unico uccello canterino con un genoma sequenziato, il fringuello zebra ha un grande potenziale per l'utilizzo in studi di sviluppo; tuttavia, le prime fasi di sviluppo zebra Finch non sono stati studiati. Mancanza di ricerca in zebra sviluppo Finch può essere attribuito alla difficoltà di sezionare il piccolo uovo e embrione. Il seguente metodo dissezione minimizza i danni tessuto embrionale, che consente di indagine della morfologia e l'espressione genica in tutte le fasi di sviluppo embrionale. Questo permette sia in campo chiaro e fluorescenza imaging di qualità di embrioni, l'uso in procedure molecolari come ibridazione in situ (ISH), saggi di proliferazione cellulare, e l'estrazione di RNA per analisi quantitative come rea quantitatival-time PCR (qtRT-PCR). Questa tecnica permette investigatori di studiare prime fasi di sviluppo che prima erano di difficile accesso.

Introduction

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di ottenere zebra Finch (Taeniopygia guttata) embrioni dalle prime fasi dell'embriogenesi per l'uso in una vasta gamma di studi sullo sviluppo. Zebra finch sono diventati il modello predominante songbird organismo e sono stati ampiamente utilizzati in una varietà di settori, tra cui tossicologia 1,2, comportamento 3, la memoria e l'apprendimento 4,5,6, neuroanatomia comparata 7,8 e lo sviluppo del linguaggio 9,10 . Come l'unico uccello canterino con un genoma sequenziato, il diamante mandarino permette lo studio molecolare e genetico dell'ordine Passeriformi, che rappresenta oltre il 50% delle specie di uccelli conosciute 11, 12,13.

Nonostante l'uso di adulto e giovanile Zebra Finch in una gamma diversificata di settori, pochi studi sono stati condotti su embrioni Zebra Finch, soprattutto durante le prime fasi di sviluppo. Questo può essere attribuito al limitato numero di uovand embrioni, e il loro stato più recente come organismo modello 14,15,16 per gli studi in cui il pollo (Gallus gallus domesticus) è stato precedentemente utilizzato come 17,18,19,20,21 sistema modello predominante. Tuttavia, come gli studenti non-vocali, i polli non sono un sistema modello adeguato per lo studio della base genetica di apprendimento vocale, sviluppo della formazione vocale, ereditarietà, il comportamento e la circuiteria gangli cortico-basale coinvolti in apprendimento motorio 10.

E 'importante notare che gli embrioni Zebra Finch sono molto più delicate e più facilmente danneggiabili di embrioni di pollo durante la dissezione e le procedure molecolari. In particolare, maggiore attenzione è necessaria quando si eseguono operazioni di permeabilizzazione su zebra embrioni fringuello. Forti detergenti ed enzimi che non danneggiare un embrione di pulcino possono danneggiare zebra embrioni fringuello. In termini di cura generale, è necessario mettere zebra fringuelli uova in piccole tazze prima del posizionamento in un incubatoreper evitare che si rompano durante il rotolamento durante l'incubazione.

Zebra finch sono suscettibili di studi comportamentali, facile e prolifico razza per tutto l'anno in cattività, e sono gli studenti vocali. Queste caratteristiche permettono l'uso del diamante mandarino per affrontare la necessità di un organismo modello che integra lo sviluppo, la genetica, e aspetti comportamentali del linguaggio. I metodi dissezioni descritte di seguito, in combinazione con una guida messa in scena recentemente sviluppato specifico zebra finch 22, rendono il diamante mandarino un sempre più utile standardizzato modello di sviluppo dell'organismo. Tuttavia, ottenere embrioni nelle fasi iniziali può essere scoraggiante. Questo protocollo consente agli investigatori di ottenere facilmente embrioni in fase iniziale. Gli studi che indagano lo sviluppo precoce e la base dello sviluppo molecolare di comportamenti complessi in diamante mandarino, o gli effetti tossicologici sullo sviluppo in altri piccoli uccelli passeriformi troveranno questa metodologia dissezione utile.

Protocol

Etica Dichiarazione: I metodi sono stati condotti con diamanti mandarini addomesticati dalla colonia riproduttiva presso il College of William and Mary. Tutte le procedure seguite linee guida RSPCA 23 e sono stati approvati dal College of William and Mary OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Animal Welfare Assurance (# A3713-01) e aveva Institutional Animal Care ed uso commissione (IACUC) approvazione (# 2013-06 -02-8721-dacris).

1. Raccolta delle uova e incubazione

  1. Stabilire zebra coppie di fringuelli su un 14:10 luce: buio ciclo. Fornire cibo, acqua, fieno, e una cassetta nido ad libitum. Nota: cure di routine e l'allevamento di fringuelli zebra è stata ben descritta 23.
  2. Preparare un incubatore pulcino di serie con ripiani ribaltabili. Nota: Mantenere l'incubatore artificiale a 37,5 (+ / - 1) ° C con il 80 - 95% umidità aggiungendo acqua al fondo dell'incubatore su base giornaliera. Lasciare l'incubatrice si stabilizzi per due giorniprima di utilizzare.
    1. Selezionare piccole tazze di alimentazione (5 x 7,6 centimetri) di almeno 2,5 centimetri di profondità per tenere le uova in incubatrice. Foderare il fondo ei bordi inferiori della tazza con due strati di carta assorbente in modo che la coppa è imbottito, pur consentendo le uova rotolano facilmente. Mettere queste tazze sugli scaffali di oscillazione della incubatrice. Nota: Troppo imbottitura può inibire rotolamento, che impedirà di incubazione successo grazie all'adesione embrionale all'interno della shell.
  3. Raccogliere le uova a due ore dopo l'inizio del ciclo di luce. Nota: Questo riduce al minimo le discrepanze in fase di sviluppo per un determinato tempo di incubazione a causa di incubazione dei genitori.
    1. Raccogliere le uova delicatamente con il pollice e l'indice sulla punta e base lungo la lunghezza dell'uovo. Utilizzare un sordo, morbida matita di grafite 4B per etichettare la data prevista e l'ora raccolti dal nido. Nota: La matita 4B morbida riduce il rischio della matita rompere il guscio fragile.
    2. 1.3.2) Porre 1-5 uova etichettate in ogni cup nell'incubatore modo che le uova possono liberamente rotolare per impedire l'adesione embrionale all'interno del guscio. Nota: Inserendo più di 5 uova in una tazza può impedire di rotolamento delle singole uova e ridurre la vitalità degli embrioni.

2. Rimozione di embrioni da Egg

  1. Per preparare per la dissezione, assemblare i seguenti materiali: un bisturi pulito, belle pinze a punta, e due belle punta forcipe supplementari. Inserire 10 x 10 cm pesano carta sulla base della portata dissezione per fornire una superficie pulita, non assorbente per dissezione. Nota: La carta pesare è fondamentale perché consente una facile manipolazione del tuorlo ed è la migliore superficie per tagliare le membrane delicate con un bisturi.
  2. Preparare una aliquota di tampone fosfato salino (PBS 1X) in una provetta di polipropilene da 50 ml, e acquisire almeno tre pipette di trasferimento e un piccolo secchio rifiuti. Se fissa gli embrioni, preparare una aliquota del 4% paraformaldeide (PFA). Attenzione: i vapori PFA sono tossici, und tutti i passaggi che coinvolgono PFA dovrebbe essere fatto all'interno di una cappa di aspirazione per ridurre al minimo l'esposizione. Se il flash congelare gli embrioni, ottenere azoto liquido e tenerlo vicino al campo di applicazione dissezione. La sterilità non è un problema per questo protocollo dissezione, ma garantire che tutti i materiali siano puliti.
  3. Rimuovere l'uovo dal termostato al punto tempo necessario per la fase desiderata come descritto nel diamante mandarino guida staging 22. Nota: Rimuovere le uova dopo 36 ore di incubazione a sezionare fase 6 embrioni (Figura 4A) 22 e rimuovere le uova, dopo 56 ore di incubazione a sezionare fase 12 embrioni (figura 3A) 22.
  4. Utilizzando una lampada a fibre ottiche illuminatore, candela l'uovo tenendolo lungo il suo asse verticale e la luce risplenda attraverso l'uovo per illuminare l'interno. Posizionare la punta del leggero dietro l'uovo e il tuorlo e localizzare embrioni.
    1. Posizionare il bisturi sul lato opposto il tuorlo e tagliare lungo l'uovo da punta abase con debole pressione.
  5. Rimuovere il contenuto dell'uovo applicando accuratamente pressione sulla punta e base dell'uovo con il pollice e l'indice, o leva delicatamente a parte il guscio lungo il taglio con una pinza. Aprire l'uovo direttamente sopra la carta pesare in modo che il tuorlo rotola delicatamente.
  6. Esaminare il tuorlo per la zona bianca di svincolo, che è visibile come un anello bianco debole che circonda lo sviluppo embrionale e orientare il tuorlo con finissima punta pinza in modo che l'embrione si trova nel centro.
    Nota: Se un cerchio bianco debole sulla superficie del tuorlo non si osserva, prendere le pinza sottile e delicatamente rotolare sopra il tuorlo finché l'embrione è sopra il tuorlo. Nota: Per i punti 1 - 9 22, il disco embrionale è minore di 6 mm di diametro ed è visibile come una debole, disco leggermente opaco sulla superficie del tuorlo - vedere la Figura 1 per riferimento. Per le fasi 10 e 22 anziani, pozze di sangue permettono migliorato visibility dell'embrione, ma fare attenzione a evitare la puntura del sacco vitellino, in quanto ciò rende localizzare l'embrione difficile.

3. Separazione di embrioni da tessuto extra-embrionali

  1. Forare i bordi del tuorlo per alleviare la pressione (Figura 1B), ed effettuare tagli singoli tutta la lunghezza del diametro tuorlo fianco del disco embrionale. Ripetere rendendo queste linee diagonali finché la sezione del tuorlo contenente l'embrione è stato separato con successo (Figura 1B). Nota: Questa fase consente la massa tuorlo di rimanere intatto, ma la pressione ridotta sulla superficie del tuorlo consente una maggiore precisione nel taglio intorno l'embrione, evitando danni alle strutture embrionali.
  2. Rimuovere i bordi del tuorlo con una pipetta di trasferimento. Nota: rimuovere il più possibile tuorlo, ma lasciare una piccola quantità in modo che l'embrione non aderisce alla superficie secca della carta pesare e strappo.
  3. Lavare il disco embrionale da Dispenszione 1X PBS a 45 ° verso il basso dell'embrione. Posizionare la punta della pipetta di trasferimento accanto-non sopra il disco embrionale. Se esigenze tuorlo aggiuntivi da rimuovere, separare ogni tuorlo con il bisturi sulla carta pesare prima di trasferire l'embrione alla piastra di Petri. Nota: Questo metodo rimuove l'embrione dalla superficie della carta pesare.
  4. Trasferire l'embrione utilizzando una pipetta di trasferimento con un volume minimo di 1X PBS per un piccolo, piatto di plastica Petri. Lavare l'embrione aggiungendo più 1X PBS nel piatto di Petri e grondante 1X PBS vicino, ma non direttamente, l'embrione. Agitare la piastra di Petri per lavare e rimuovere il tuorlo residuo, inclinare il piatto di Petri, e rimuovere i rifiuti 1X PBS con la pipetta di trasferimento.
    NOTA: Quando la 1X PBS viene rimosso, l'embrione tipicamente non aderisce al fondo del piatto Petri perché la superficie plastica è scivoloso con residuo 1X PBS. Tuttavia, più 1X PBS può essere aggiunta se l'embrione si attacca al piatto.
    Se il fissaggio tegli embrioni, seguire i passaggi 3.5 e 3.6. Se il flash congelamento dell'embrione, passare al punto 3.8 immediatamente.
  5. Se fissa l'embrione di ibridazione in situ, aggiungere subito 4% PFA per il piatto di Petri per sommergere l'embrione. Gocciolare 4% PFA direttamente sulla parte superiore della dell'embrione per appiattirlo; questo impedisce l'embrione da curling. Fissare l'embrione nel 4% PFA a 4 ° C per 12 ore.
    1. Dopo la fissazione, disidratazione embrioni in soluzioni (MeOH) e conservare a -20 ° C in 100% di metanolo metanolo classificato.
  6. Se l'embrione è tra gli stadi 1-8 22, rimuovere la membrana vitellina aderito l'embrione. Nota: Questa fase può essere eseguita durante o dopo il fissaggio. Embrioni di età inferiore ai tappa 8 22 non sono facilmente visualizzati perché aderiscono alla membrana vitellina, oscurando le strutture chiave, come si vede nella figura 2A.
    1. Afferrare il bordo della membrana che si estende oltre la zona di giunzione con pinza extra fini. Carefully capovolgere l'embrione su più volte per lavare via granuli tuorlo residue e per allentare l'aderenza del disco embrionale alla membrana vitellina. Nota: Non toccare il centro dell'embrione, in quanto questo potrebbe danneggiare le strutture embrionali.
    2. Se il divario non sembra tra la zona di giunzione e la membrana vitellina, delicatamente graffiare la zona di congiunzione con la multa supplementare punta pinze per allentarla dalla membrana vitellina. Afferrare la membrana vitellina con la multa supplementare punta pinza e tirare delicatamente dalla dell'embrione. Se necessario, tirare delicatamente l'embrione dalla membrana vitellina afferrando il bordo periferico del disco embrionale in corrispondenza della zona di giunzione.
    3. Gettare la membrana vitellina di rischio biologico 1 rifiuti (livello di biosicurezza 1) dopo la rimozione.
  7. Quando si esegue un saggio ISH sui giovani stadi embrionali, seguire protocolli standard intere mount ISH di embrioni di pollo 24, 25, ma prendere in considerazione i seguenti suggerimenti. Per ridurre i danni agli embrioni durante la procedura di ISH, utilizzare una sola fiala di vetro da 5 ml con tappo a vite per ogni embrione. Compilare solo flaconcini con 2-3 ml di soluzione, assicurando che gli embrioni siano completamente sommersi. Fiale Nutate verticalmente, ponendo 5 ml fiale in un rack di polistirolo (o qualsiasi rack che non mancherà di tenere i flaconi sicuro) che è fissato a un nutator. Nota: Questa precauzione impedisce l'embrione da lacerazione, che può verificarsi quando viene a contatto con il coperchio della fiala durante nutazione orizzontale.
  8. Per gli embrioni fase 0-6 22, il trattamento con 5 mg / ml proteinasi K in 1X PTW per 5 minuti a temperatura ambiente. Trattare embrioni scena 7-12 22 con 10 ug / ml di proteinasi K in 1X PTW per 10 min a 37 ° C per ridurre la colorazione di fondo.
  9. Per produrre una reazione di colore sufficiente a rilevare i bassi livelli di espressione genica nelle fasi 1-10 22, incubare con una concentrazione sonda 10 mcg / ml per 12 ore. Per le fasi più anziani, incubare con 1 & #956; g / ml concentrazione sonda a 60 ° C.
  • Se-flash congelamento dell'embrione, aggiungere rapidamente 2-3 ml di PBS 1X per il piatto di Petri seguente dissezione e inclinare il piatto di Petri per separare l'embrione dai granuli tuorlo. Rimuovere il liquido e ripetere 2 - 3 volte per rimuovere tutti tuorlo. Utilizzando fine punta pinze, trasferimento di embrioni in una provetta pre-etichettati e flash congelare in azoto liquido prima di riporre a -80 ° C.
  • 4. EdU Cell Proliferation Assay. Costituzione e Rilevamento di EdU in Zebra Finch embrioni.

    1. Candela l'uovo usando una lampada a fibre ottiche illuminatore per individuare l'embrione o tuorlo.
    2. Contrassegnare il lato dell'uovo opposto alla posizione dell'embrione o tuorlo nell'uovo per garantire che l'embrione non è danneggiato durante il processo di microiniezione.
    3. Linea un piatto di plastica 60 mm Con plastilina e stampo nella forma di una ciotola di tenere l'uovo con l'orientamento desiderato. Lo spot marcato dovrebbe essereorientata per consentire l'inserimento dell'ago microiniezione utilizzando micromanipolatore. Nota: L'argilla si stabilizzerà l'uovo durante microiniezione e durante l'incubazione nel passaggio 4.11.
    4. Tirare due aghi microiniezione capillari di vetro. Blunt un ago per fare un buco nell'uovo al punto marcato. Preparare il secondo ago microiniezione per l'iniezione da backloading con olio minerale e inserirla nel microinjector.
    5. Impostare il volume della soluzione rilasciato per iniezione a 59,8 nl sulla microinjector.
    6. Caricare l'ago microiniezione con il 10 mM soluzione madre EdU.
    7. Creare un foro nel guscio sul punto marcato con il capillare di vetro smussata, facendo attenzione a non rompere il guscio o far cadere i pezzi del guscio nella cavità uovo. Orientare l'uovo in modo che il foro è ad un angolo di 45 °, consentendo l'ago microiniezione da inserire direttamente attraverso la cavità al tuorlo o embrione.
    8. Utilizzando il micromanipolatore, inserire laloaded ago Circa 1.0 cm nel cavità.
    9. Iniettare la quantità desiderata di soluzione EdU direttamente sullo sviluppo dell'embrione o tuorlo. Nota: Un massimo di 478 nl di EdU può essere iniettato con conseguente morte embrionale.
    10. Subito avvolgere l'uovo e il supporto di argilla con più strati di pellicola trasparente per coprire l'uovo e il piatto per prevenire l'essiccamento dell'embrione durante l'incubazione. Tape i bordi della plastica avvolgono al fondo del piatto per evitare la plastica da scartare durante l'incubazione. Nota: L'involucro di plastica deve essere rimosso solo immediatamente prima dissezione.
    11. Permettono alle cellule proliferanti giudicato a recepire la EdU incubando l'uovo a 37 ° C fino al raggiungimento della fase desiderata. Dopo l'iniezione, non ritorno uovo di ribaltamento ripiani in incubatrice. Posizionare l'argilla piatto rivestito di plastica avvolto su una superficie stabile all'interno dell'incubatrice.
    12. Rimuovere l'involucro di plastica e sezionare l'embrione seguendo il protocollo di cui sopra.Fissare l'embrione in 4% PFA e incubare 12 ore a 4 ° C come sopra descritto. Dopo la fissazione, lavare con 100% di etanolo (EtOH) per 5 min e conservare in fresco 100% EtOH a -20 ° C fino ad ulteriore analisi.

    5. EdU "clic" Protocollo di Reazione

    Le seguenti operazioni sono tutte eseguite in flaconcini di vetro.

    1. Reidratare embrioni con successivi 5 min lavaggi di quanto segue:
    2. EtOH, 75% EtOH e 25% deionizzata sterile distillata (SDD) acqua, 50% EtOH e acqua sdd 50%, 25% EtOH e 75% 1X PTW, 100% 1X PTW
    3. Lavare tre volte in 100% 1X PTW per 10 minuti ciascuno.
    4. Diluire l'additivo tampone di reazione (Kit Component F) combinando 1 parte della soluzione tampone di 10 volte (10 ml) a 9 parti di SDD acqua (90 ml).
    5. Preparare la miscela di reazione in un tubo separato miscelando il seguente: 875 microlitri 1X PBS, 20 microlitri CuSO 4, 5 microlitri azide, 100 microlitri diluito additivo tampone di reazione.Nota: Volume della miscela di reazione può essere ridotta. La reazione funziona se l'embrione è completamente coperto nella miscela di reazione. Aggiungere l'additivo tampone di reazione diluita (passo 5.3) immediatamente prima dell'uso. Tutte le fasi successive vengono eseguite al buio. Coprire gli embrioni con un foglio per proteggere dalla luce.
    6. Coprire le fiale con un foglio di alluminio, e incubare verticalmente a temperatura ambiente per due ore mettendoli in un rack di polistirolo attaccato ad un nutator.
    7. Lavare gli embrioni 3 volte in fresco 1X PBS per 10 min ciascuno.
    8. Incubare gli embrioni in fresco 4% PFA notte a 4 ° C.
    9. Lavare 3 volte in PBS 1X per 10 min ciascuno e conservare fresca 1X PBS a 4 ° C. Coprire gli embrioni con un foglio fino a ulteriori analisi.

    Representative Results

    I passi diagrammed nella figura 1 indicano l'aspetto dell'embrione mentre collegato alla membrana vitellina (A) e dimostrare il corretto metodo per separare l'embrione dal tuorlo (B). L'embrione può essere identificato dalla zona di giunzione, che è molto più leggero la membrana vitellina. L'embrione è spesso difficile distinguere finché il tuorlo è tagliato via. Una volta che l'embrione è sezionato dall'uovo, può essere fisso o Flash congelati per un uso futuro. Se l'ibridazione in situ è prevista per l'embrione sezionato, è necessario rimuovere la membrana vitellina che si aderisce all'embrione attraverso la zona di giunzione. Figura 2 illustra la migliore visibilità dell'embrione appena questa membrana viene rimossa (C), e il modo corretto di sbucciare la membrana vitellina (A, B). Dopo dissezione e fissazione, tutta montare ibridazione in situ è stata eseguita come illustrato nella Figura 3 (A, A ', B, B') E la figura 4 (A, A', B, B ') e Figura 5 (A, B, C) ​​per rilevare le differenze di orthodenticle homeobox 2 (Otx2) espressione in embrioni evolutivamente esposti a basse dosi di metilmercurio. Figura 5 mostra Risultati della sonda senso, dimostrando la mancanza di sfondo. In Figura 4, pur essendo sezionato dall'uovo nello stesso punto temporale, l'embrione evolutivamente esposta al metilmercurio (metilmercurio) progredito a fase 5 22 (B, B '), mentre l'embrione controllo sviluppato alla fase 6 22 (A, A '). Il gruppo di embrioni sezionato e mostrato in figura 4 sono stati raccolti dal nido e portato dal termostato alla stessa ora. Anche se alcuni variazione naturale è presente in fase di sviluppo, sulla base dei dati di dissezione precedenti, è improbabile che le fluttuazioni di temperatura nell'incubatrice comporti solo 2,4 ppm embrioni metilmercurio di essere svipmentally ritardo. Le differenze nelle fasi indicano cambiamenti nella proliferazione cellulare in embrioni evolutivamente esposti a metilmercurio.

    Prima di dissezione, EdU è stato iniettato in una giornata 2 uovo e permesso di incubare una notte. Dopo dissezione e fissazione dello stadio 16 22 embrione, EdU viene visualizzata utilizzando "click" chimica, permettendo la rilevazione di cellule proliferanti, come mostrato nella Figura 6 (A, B, C). E 'importante monitorare con attenzione i punti di tempo in cui collocare le uova in incubatrice e durante dissezioni, come l'esposizione al metilmercurio o eseguire il test EdU può interrompere la progressione evolutiva. La prima iniezione è stata eseguita il giorno 0, che era il giorno di raccolta come specificato nel passo 1.3. Questo embrione è stato sezionato circa 38 ore più tardi (fase 7, 22). Il tasso di sopravvivenza è risultata essere di circa il 90% (stessa velocità di embrioni di controllo) finché la quantità di iniezione era sotto 478 nl.

    22 embrioni, una estrazione dell'RNA è stata eseguita secondo il protocollo del produttore senza ottimizzazione necessaria, come si vede nella Figura 7. La rimozione della membrana vitellina era necessaria per l'estrazione dell'RNA e successive applicazioni qRT-PCR.

    Nota: Le cifre embrioni sono orientate in modo che le regioni anteriore e posteriore sono nella parte superiore e inferiore delle immagini, rispettivamente.

    Figura 1
    Figura 1. Procedura per l'individuazione e sezionare embrioni Zebra Finch, mette in scena 1-10 22. Individuare embrione facendo rotolare delicatamente il tuorlo fino a quando il disco bianco debole è evidente (A). Una volta che l'embrione si trova al centro del tuorlo, il tuorlo è sezionato in modo graduale (B) in cui il primo taglio riduce la pressione della membrana vitellina (1) e tagli successivi (2) delimitare la zona di giunzione (zj) che è aderito alla membrana vitellina. Barre di scala rappresentano 1 mm.

    Figura 2
    Figura 2. Rimozione di membrana vitellina e la visibilità delle strutture embrionali. Dopo la rimozione di un embrione dal tuorlo, posto embrione in una capsula di Petri contenente 4% PFA. Se l'ibridazione in situ deve essere eseguita, visibilità delle strutture embrionali è essenziale e può essere ottenuto rimuovendo la membrana vitellina (A). Afferrare la membrana vitellina con finissima punta pinza e buccia delicatamente dalla dell'embrione gestendo l'embrione direttamente al bordo più esterno, se necessario(B). La rimozione della membrana vitellina aumenta la chiarezza delle strutture embrionali, e permette di embrioni di essere ripreso o trattati con ibridazione in situ (C). Barre di scala rappresentano 1 mm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3. Intero monte ibridazione in situ eseguita su zebra embrioni fringuello evolutivamente esposti al metilmercurio. Pattern di espressione di orthodenticle homeobox 2 (Otx2) sono stati caratterizzati negli embrioni esposti a 0,0 ppm metilmercurio (A, A ') e 2,4 ppm metilmercurio (B, B ') attraverso la dieta dei genitori. Il doRSAL (A) e ventrale (A ') espressione di Otx2 è visibile durante le vescicole mesencefalo e ottiche durante la fase 12 22. Gli embrioni gruppo di trattamento sono stati sezionati nello stesso punto temporale, ma sono stati un ritardo dello sviluppo come visto nella dorsale (B) e ventrale (B ') vista delle strutture della testa, che sono caratteristici della fase 11 22 Abbreviazioni:. mb, mesencefalo; op, vescicola ottica. Barre di scala rappresentano 1 mm.

    Figura 4
    Figura 4. Whole mount   in situ   ibridazione eseguita su embrioni Zebra Finch evolutivamente esposti al metilmercurio. pattern di espressione di orthodenticle homeobox 2 (Otx2) sono stati caratterizzati in fase 6 22 Embry os esposti a 0,0 ppm metilmercurio (A, A ') e la fase 5 di 22 embrioni esposti a 2,4 ppm metilmercurio (B, B') attraverso la dieta dei genitori. Abbreviazioni: am, margine anteriore del mesoderma; no, notocorda, mesoderma notocorda; po, proamnion, blastopore anteriore; ps, stria primitiva 22. Barre di scala rappresentano 1 mm.

    Figura 5
    Montaggio Figura 5. Totale in situ   ibridazione eseguita su zebra embrioni fringuello utilizzando la sonda senso. (A) Fase 5 22 embrioni. (B) Fase iniziale 6 22 embrioni. (C) Fase 11 22 embrioni. Barre di scala rappresentano 1 mm.

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    Figura 6. EdU costitutivo e di protezione in zebra embrioni fringuelli. EdU "click" chimica è stata utilizzata per rilevare le cellule proliferanti in una fase embrionale 16 22 (A, B, C). EdU viene incorporato nel DNA al posto della timidina 26, 27 e viene rilevato utilizzando click chemistry 27. Proliferazione è chiaramente visibile nei bordi laterali dei somiti e la tailbud. Pannello A mostra proliferazione presente esclusivamente nella parte posteriore dell'embrione e mostra anche le cellule proliferative individuali. Pannello B mostra le posizioni proliferative in tutta embrione. Pannello C mostra la regione anteriore e mostra telencefalo altamente proliferativo (TE) con maggiori dettagli. Abbreviazioni: af, piega amniotico; FLB, zampa anteriore gemma; HLB, arti posteriori germoglio; le, obiettivo vescicola; ms, mesencefalo; mt, Metencephalon; opc, coppa ottica; pa, arco faringeo; sm, mesoderma somite; tb, tailbud; TE, telencefalo. Barre di scala rappresentano 1 mm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 7
    Figura 7. Qualità di RNA estratto da embrioni sezionati Zebra Finch. Controllo (0,0 ppm) e 1,2 ppm embrioni metilmercurio sono stati sezionati e flash congelati come descritto al punto 3.8. Ogni corsia mostra RNA estratto da due embrioni omogeneizzati da ciascun gruppo di trattamento.

    Discussion

    Recenti sviluppi di una guida messa in scena embrionale 22 e annotazione del genoma rendono il diamante mandarino organismo modello auspicabile per studi sullo sviluppo. Tuttavia, le piccole dimensioni e la fragilità degli embrioni Zebra Finch, che vanno 3-7 mm fasi 1-10 22, possono rendere difficile dissezioni 11, 14. Individuazione e rimozione pulita embrioni dalla superficie del tuorlo può essere impegnativo. Questo protocollo fornisce dettagli sufficienti per eseguire la procedura con facilità. Questo protocollo dimostra i passaggi critici che non sono in genere conosciuti, ma sono necessarie per garantire una dissezione di successo. Ad esempio, è indispensabile lasciare un piccolo strato di tuorlo tra l'embrione e foglio di carta pesare escludere attaccare.

    Sia l'identificazione e la rimozione dell'embrione può essere difficile. Per risolvere identificare l'embrione sulla superficie del tuorlo, brillare luce direttamente sopra il tuorlo dopo hastato rimosso dal uovo, e guardare il tuorlo con un angolo di 45 ° per trovare l'embrione. Una volta che l'embrione si trova, tagliare il tuorlo pesare sulla carta avendo cura di non strappare l'embrione.

    Se ulteriori applicazioni includono imaging per differenze anatomiche, ibridazione in situ, o saggi di proliferazione cellulare, è importante rimuovere la membrana vitellina in fase 1 - 8 22 per una migliore visualizzazione delle strutture. Se in difficoltà quando si rimuove il tuorlo o la membrana vitellina nelle fasi iniziali, fissare l'embrione nel 4% PFA prima di lavare in PBS 1X per ridurre la fragilità embrionale. Rimuovendo prima la membrana vitellina durante la dissezione come descritto, le strutture sono chiaramente visibili e intatto nel zebra embrioni fringuelli dopo l'esecuzione di ibridazione in situ.

    Una limitazione di EdU è che la somministrazione di volumi di dosaggio su 478 conduce nl a fatalità embrionale. Tuttavia, la vasta gamma di dosaggio permette varying livelli di marcatura delle cellule proliferative.

    La reazione "click" utilizzato in questo kit è il rame (I) catalizzata-Alkyne-azide-cicloaddizione (Cu (I) AAC). In questa reazione specifica, una molecola analogo della timidina-alchino contenente (UDE) viene incorporato dividendo attivamente cellule. Il gruppo alchino nel EdU sporge dalla struttura elicoidale del DNA, e viene rilevato mediante esposizione a una molecola azide coniugato ad una molecola verde fluorescente che si lega al gruppo alchino libero. La fluorescenza verde mostra le nuove cellule proliferanti nell'embrione. La bio-ortogonalità del azide e gruppi alchini impedisce la colorazione non specifica perché queste specie reattive non sono naturalmente presenti negli organismi. Inoltre, poiché il DNA non deve essere denaturato in modo che la reazione avvenga, ulteriori analisi DNA-dipendente può essere facilmente eseguita 27.

    Una limitazione intrinseca di questo metodo è la piccola dimensione e frammentazioneilità di zebra embrioni fringuelli. Rimozione della membrana vitellina di embrioni fasi 1-15 22 può portare a strutture embrionali dannosi se non eseguita con cautela. Tuttavia, questo protocollo semplifica il metodo di dissezione, permettendo che i ricercatori utilizzano primi stadi embrionali esaminare anomalie strutturali e di espressione genica che non sono stati studiata in precedenza. Questo protocollo apre la strada per una pletora di saggi cellulari-molecolari che permetteranno ai ricercatori di determinare le origini dello sviluppo di fenotipi adulti. Ad esempio, sarà possibile esaminare l'espressione del gene implicato nella formazione vocale in varie condizioni ambientali oa seguito di trattamenti farmacologici nelle primissime fasi di sviluppo 28, 29,30,31. Anche se non è dimostrato in questo documento, questo metodo consente potenzialmente di altre procedure, come radioattivo ibridazione in situ su sezioni di tessuto zebra Finch e elettroporazione / a ovo chirurgia 32, 33,34. Dato che il diamante mandarino è stata stabilita come un importante organismo modello all'interno di un vasto corpo di letteratura, questi studi forniscono opportunità non sfruttate per collegare meccanismi di sviluppo con la fisiologia e del comportamento degli adulti, in particolare lo sviluppo del linguaggio 7, 9.

    Disclosures

    Gli autori non hanno nulla da rivelare.

    Acknowledgments

    Gli autori ringraziano le loro fonti di finanziamento, Howard Hughes Medical Institute di Laurea Scienze della Formazione Programma per il College of William and Mary; Sponsor di Grant: NIH (MSS); Numero di Grant: R15NS067566. Si riconoscono anche il sostegno del College of William and Mary, Dipartimento di Biologia e Collegio delle Arti e delle Scienze per l'assistenza con la cura degli animali.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chicken egg incubator We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model   
    Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    Dissection microscope  We use Olympus SZ61
    7'' Drummond capillary for Nanoject II injector Drummond 3-00-203-G/X
    Drummond Nanoject II microinjector Drummond
    Dumont Tweezers #55 World Precision Instruments 14099
    Ethanol (EtOH)
    50 ml Falcon tube (polypropylene) Fisher Scientific 06-443-18 
    FastPrep Lysis Matrix H tubes MP biomedicals 6917-100 Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) Dolan-Jenner Industries  Fiber-Lite MI-150 
    Glass vials with screw cap (DEPC treated) Fisher Scientific 03-338A
    Microcentrifuge eppe tube (1.5 ml) Fisher Scientific 05-408-129
    Mineral oil Sigma-Aldrich M-8410
    Modeling Clay Any brand
    Narshige PB-7 needle puller Narshige
    Omni Bead Ruptor Homogenizer OMNI International 19-010 Used for RNA extraction
    4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. 
    Phosphate buffered saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, adjust pH to 7.4
    Phosphate buffered saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dibasic, 200 ml Barnstead H2O, adjust pH to 6.5
    Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, adjust pH to 7.4, 2 ml Tween-20
    35 ml Plastic Petri dish  Fisher Scientific 08-757-100A
    plastic wrap Any brand
    Prepease RNA Spin Kit PrepEase, Affymetrix 78766 1 KT Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Reaction Mix: 875 μl 1xPBS, 100 mM 20 μl CuSO4 (Kit Component E), 5 μl Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 μl diluted reaction buffer additive (Kit Component F) Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    sdd H2O
    Seed cup  We use it as a container when incubating eggs
    Stainless steel scalpel 
    Standard nest box We use Abba Plastic Finch Nestboxes
    4 ml, Teflon Lined Cap, Glass Vials Fisher Scientific 02-912-352
    Transfer pipettes (polyethylene) Fisher Scientific 13-711-7M 
    4 x 4 weigh paper Fisher Scientific 09-898-12B

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    References

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