전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비

Biology
 

Summary

제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

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Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604, doi:10.3791/51604 (2014).

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Abstract

제브라 피쉬 배아는 이제 일반적으로 발달 과정의 유전자 제어를 조사하고 선천성 이상을 모델로 기본 및 생물 의학 연구에 사용됩니다. 인생의 첫 번째 날 동안, 제브라 피쉬 배아는 수정, 절단, 낭 배기, 분할, 이러한 신장, 심장, 중추 신경계와 같은 구조의 기관 형성 등 많은 발달 단계를 통해 진행됩니다. 배아 라운드 노른자 질량과 공동으로 개발하고 있기 때문에 젊은 제브라 피쉬 배아의 해부학은 이러한 이벤트의 많은 관련된 조직의 시각화 및 분석을위한 몇 가지 과제를 제시한다. 따라서, 정확한 분석 및 tailbud 20 체절 단계와 같은 사용하여 염색 된 것과 같은 (각각 10, 19 시간 포스트 수정 (HPF),) 사이의 고정 된 배아 표본 실험 표현형의 이미징 전체는, 현장 하이브리드 (WISH)에 탑재 노른자 B에서 배아를 제거하는 것이 바람직하다모두와 유리 슬라이드에 평면을 배치합니다. 그러나, 편평한 마운트 절차를 수행하는 단계 지루한 일 수있다. 따라서, 평면 성공적이고 효율적인는 준비가 크게 절개 기법의 시각적 데모를 통해 용이하게 장착하고, 또한 최적의 조직 처리를 보조 시약을 사용하여 도움을 주었다. 여기서, 우리는 제브라 피쉬 배아에서 유전자 발현 중 하나 또는 두 가지 색 검출을 위해 우리 WISH 프로토콜을 제공하고, 평면 실장 절차 더러워 고정 표본이 예에서 수행 될 수있는 방법을 보여준다. 이 평면 장착 프로토콜은 초기 제브라 피쉬의 개발 과정에서 나오는 많은 배아 구조의 연구에 광범위하게 적용 가능하며, 고정 된 배아 샘플에서 수행 다른 염색 방법과 함께 구현 될 수있다.

Introduction

제브라 피쉬, 다니오 rerio는 발달 생물학의 연구에 널리 사용되는 생물이되고있다. 제브라 피쉬는 가족 Cyprinidae에 속하는 열대 담수 척추 동물 종이다. 그들은 쉽게 얻을 저렴하고, 하나를 유지하기 쉽다 있었던 것에 지브라 피쉬는 원래 전위 수질 오염의 위험에 대한 정보를 얻기 위해 환경 연구에 사용 하였다. 지난 30 년 동안, 제브라 피쉬는 이유로 호스트에 대한 유전자 다루기 쉬운 척추 동물 모델 시스템으로 인식되고있다. 제브라 피쉬는 포유 동물 2,3 고등 척추 동물과 해부학 및 생리 학적 보존의 높은 수준을 보여줍니다. 최근 게놈 서열 주석 인간 유전자의 약 70 %가 적어도 하나의 제브라 피쉬의 대응 4이 있다고 밝혔다. 예를 들어, 신장 개발 과정에서 중요한 역할을 많은 orthologous 유전자는이 종의 5 ~ 7 사이에 확인되었습니다. 이 드라세포 및 분자 생물학 관련하여 보존 매틱 정도는 제브라 피쉬 8 인간의 질병의 다양한 모델을 만들 연구자 사용할 수 있으며, 제브라 피쉬 화학 유전 스크린 (9)를 이용하여 잠재적 인 약물 요법을 식별하기위한 유용한 도구가되었다.

또한, 제브라 피쉬 모델뿐만 아니라 복잡한 발달 과정과 인간에서 볼 수 있습니다 다양한 질환을 요점을 되풀이하지만, 몇 가지 추가 속성도 함께 배아 연구를위한 모델 생물로의 매력을 높일 수 있습니다. 제브라 피쉬는 난생하고 수정 (10)의 시작에서 태아에 쉽게 접근 할 수있는 연구자를 제공하는 방송 산란을 통해 재현하고 있습니다. 다른 장점은 태아의 크기, 투명도 및 빠른, 외부 개발 (10)이 (가) 있습니다. 또한, 제브라 피쉬의 성인은 높은 생산력을 가지고 일반적으로 200 ~ 500 사이의 범위는 상대적으로 큰 클러치 크기를 생산일주일, 궁극적으로 쉽게 9 이러한 표현형 기반 화학 화면으로 높은 처리량 실험을 수행 할 연구원을 가능하게한다.

그럼에도 불구하고, 제브라 피쉬 모델에 의해 전시되는 장점의 과다에도 불구하고, 분석 및 초기 개발 단계에서 얻은 실험 결과의 통신과 관련된 문제가 있습니다. 어떤 경우에는, 제브라 피쉬 배아의 고유 해부학 하나의 데이터의 시각화를 모호 있었다. 발달이 진행됨에 따라 (11)을 수정 한 후, 초기 셀은 여러 분열 이벤트를 겪는다. 낭 배기 후, 배아 축이 노른자 11 감싸되도록 tailbud 단계 (10 HPF)에서 나온다. 이후의 개발은 분할 기간을 통해 진행되는 트렁크 대량으로 성장하고 또한 축 방향으로 길게 연장되는 노른자의 일부와 함께 꼬리 자체 골목 중앙 노른자 질량에서, 연장하도록11. tailbud 20 체절 단계 (19 HPF) 사이에, 같은 WISH 등 다양한 염색 프로토콜의 이용 후 특정 발달 기능을 관찰하기 위해 시도, 모두에 의한의 배아 및 불투명도의 형상을 시각화하고 사진에 도전 할 수있다 난황. 이러한 문제를 해소하기위한 한 가지 방법은 노른자를 제거하고 더 간단한 방식으로 분석 할 수있는 이차원 샘플로 배아를 평탄화하는 것이다.

다음과 같은 프로토콜 및 비디오 자원이 성공적으로 deyolk 및 평면 하나 또는 두 개의 컬러 WISH 염색의 예를 사용하여, 고정 및 염색 다음 배아를 마운트하는 방법에 대한 가이드를 제공합니다. WISH 보존 시료에서 특정 핵산의 검출을 가능하게하고, 따라서 조직 내에서 검출되는 유전자 발현의 사이트 (들)을 허용 널리 사용되는 기술이다. WISH 기술은 광범위하게 설명되었지만, 다양한 색상의 기판뿐만 아니라 수행 할 수 플루orescent 탐지 시스템 12-20. 여기에서 우리는 개발의 tailbud와 분할 단계 사이에 제브라 피쉬 배아에 사용되는 우리의 수정 WISH 프로토콜을 제공합니다. 아래 프로토콜의 초기에 언급 한 바와 같이 대체 WISH 프로토콜은 그러나 여기서 설명하는 플랫 마운트 절차와 호환된다. 또, 평면 실장 등이 프로토콜에 설명되지 않은 전체 마운트 면역 조직 또는 세포 계보 추적 라벨 등 기존의 시각화 기법을 임의의 개수와 함께 이용 될 수있다. 전반적으로, 평면 설치의 기술은 더 나은 제브라 피쉬의 배아 발달의 초기 단계 실험에서 얻은 데이터의 뛰어난 분석 및 프리젠 테이션을 활성화 할 수 있습니다.

Protocol

이 프로토콜에 설명 된 제브라 피쉬 배아를 사용하기위한 절차는 노트르담 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 참고 : 파트 1-5에 기재된 절차는 대표적인 결과에 여기에 제공된 배아 이미지를 생성하는 데 사용 하였다. 다른 WISH 절차 12-16 또는 특정 항체를 사용하여 특정 단백질에 대한 면역 조직 화학 라벨 등의 시각화 기술을 원하는대로 부품 1-5에서 설명하는 절차를 대체 할 수 있습니다. 부품 1-5에 설명 된 프로토콜, 초기 배아 고정 및 최종 염색 고정 단계를 위시 제브라 피쉬 배아에 평평하게 마운트를 수행하는 평면 설치의 샘플에서 노른자 입자를 제거 할 수있는 능력에 영향을 미치는 주요 조작입니다. 초기 고정 갓 해동 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) / 1X PBS와의 고정을 수행 할 때 가장 좋은 평면 실장 결과가 얻어진다차가운 얼음 4 % PFA/1x PBS (갓 해동을 가질 필요는 없습니다), 그리고이 부품 6-8와 함께 다른 염색 방법을 대체 할 때 독자가이 고려하는 것이 좋습니다와 최종 WISH 염색 반응.

1. 배아 컬렉션, 고정 및 저장

  1. 그들은 밤새 칸막이로 구분되도록 시스템 물 챔버 성인 zebrafish의 남성 (들)과 여성 (들)을 배치하여 상대 새장을 준비합니다.
  2. 성인 사이의 칸막이를 제거하고 해당하는 배아 단계가 클러치를 수집하기 위해 짝짓기 15-30 분 ~ 내 미세 철망 차 여과기를 사용하여 수정 된 알을 수집합니다.
  3. 거꾸로 스트레이너를 켜고 E3 솔루션의 약 25 ㎖가 들어있는 배양 접시에 배아를 전송하는 물총 병에서 분배 E3의 벌금 스트림으로 표면을 씻어.
  4. 클러치를 수집 한 후, 약 50 ~ 60 배아는 배양되는 등 여러 가지 요리로 그들을 분할E3 용액 25 ㎖를 각각의 접시에. 참고 : 배아의 과밀 수용은 클러치 손질이 원하는 단계 (들)을 적시에 수집 할 수 있도록이 문제를 방지하기 위해주의해야 내 극적인 발달 비동기로 이어질 수 있습니다.
  5. 제브라 피쉬의 표준 준비 시리즈 11에 따라 개발 평가를 가능하게하는 28.5 ° C에서 배아를 품어.
  6. 부드럽게 평평한 바닥 microcentrifuge 관으로, 20 체절 단계 (19 HPF)까지, 선택 평가시기에 태아의 원하는 번호를 배치하는 플라스틱 전송 피펫을 사용합니다. 참고 : 그들은 연약하고 쉽게 전송 피펫으로 분쇄 또는 공격적인 처리에 의해 손상 될 수있는, 젊은 배아의 취급에주의하십시오. 다르게는, 유리 바이알 배아의 고정 및 처리를 위해 사용될 수있다. 이후의 모든 프로토콜 세척 플라스틱 전송 피펫 (3.11, 3.14 단계) riboprobe 추가 및 제거를 제외하고, 이용 될 수있다.
  7. 차가운 얼음 4 % PFA/1x PBS로 E3를 교체하고실온에서 또는 4 박 ° C에서 4 시간 동안 4 % PFA/1x PBS에서 자신의 chorions의 배아를 고정합니다. 주의의 주 : PFA는 독성이 장갑 및 실험실 코트를 포함하여 적절한 개인 보호 장비를 착용하고있는 동안 PFA 솔루션은 화학 후드에서 처리되어야한다. 원액을 할 때조차 과립 PFA는 정전기를 분산하는 경향이 수 또한, PFA 분말, 예외적으로 취급시주의해야한다. 일반적 PFA는 PFA 분체를 용해 끓게 1X PBS를 가열함으로써 제조 된 후, 용액을 -20 ℃에서 분취 액으로 저장된다 용액이 냉각되면 미세한 침전물이 4 % PFA/1x PBS에 존재하는 경우, 필터는 0.45 μm의 필터 시스템을 통해 전달하여 냉동 위해 분취 전에 냉각 된 용액을 살균. 만 새로 제조 또는 갓 해동 PFA는 배아의 초기 (즉, 기본) 고정하는 데 사용됩니다.
  8. 수정 프로그램을 제거하고에 전송 한 다음, 1X PBST로 두 번 배아를 씻어배양 접시.
  9. 실체 현미경을 이용하여 배아를보고 두 번째 쌍의 개방 융모막을 찢어 사용하는 동안 한 쌍 부드럽게 배아를 활용하는 데 사용되도록 배아를 둘러싼 chorions을 제거하는 미세 집게 두 쌍을 사용합니다.

2. 배아 Permeablization

  1. 다시 microcentrifuge 관 또는 유리 병에 dechorionated 배아를 전송 한 후 남아있는 융모막 파편을 제거하기 위해 1X PBST로 두 번 씻어.
  2. 1X PBST를 제거하고 100 % 메탄올 (메탄올)로 두 번 배아를 씻어.
  3. 적어도 20 분 동안 -20 ° C에서 배아를 놓습니다. 주 : 태아는 1 년 이상 메탄올에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 메탄올은 chorions이 제거되지 않는 한, 따라서이 단계를 진행하지 마십시오 chorions 끈적합니다.
  4. 100 % 메탄올을 제거하여 배아를 재수와 1X PBST로 두 번 한 후, 50 % MeOH/1x PBST, 30 % MeOH/1x PBST로 5 분 각각 실온에서 그들을 씻어. </ 리>
  5. 1X PBST 50 ㎖에 갓 해동 단백질 분해 효소 K 재고 (10 ㎎ / ㎖)의 25 μl를 추가하여 새로운 단백질 분해 효소 K 작업 용액 (5 ㎍ / ㎖) 준비합니다.
  6. 배아에서 1X PBST를 제거한 다음, 배아 단계에 따라 단백질 분해 효소 K 작업 솔루션을 교체하고 품어 : <= 1 분 5 somites; 10 ~ 12는 1.5 분 동안 somites; 2 분, 3 분 20 somites 15 somites.
  7. 단백질 분해 효소 K 작업 용액을 제거하고 1X PBST로 두 번 배아를 씻어.
  8. 1X PBST를 제거하고 실온에서 20 분 이상 얼음 차가운 4 % PFA/1x PBS로 교체합니다.

3. R​​iboprobe 합성, 프레 하이브 리다이 제이션, 하이브리드 및 프로브 제거

  1. 얼음에 효소를 유지하면서 PCR의 100-200 NG도 (그 유전자에 상응하는 서열을 함유하는 DNA 템플릿을 결합하여, 1.5 밀리리터 microcentrifuge 관에서 실온에서 안티센스 riboprobe 시험 관내 전사 반응을 조립digoxygenin 또는 형광 표시 리보, 적절한 RNA 중합 효소하는 순서에 따라 (SP6, T3, T7의 2 μL의 제품 또는 선형화 된 플라스미드 DNA 1.5 μg, 기술 12, 13와 같이 제조), 2 μL는 PCR 제품 또는에 통합 ) DNA 플라스미드에 존재하는, 배 전사 버퍼 2 μL, RNA 분해 효소 억제제의 0.5 μL, 분자 수준 증류수로 20 UL의 총 부피를 가지고 (DNA 분해 효소, 무료 RNA 분해 효소). 참고 : 배 전사 버퍼가 10 ~ 20 분 동안 37 ° C의 수조에 관을 배치하여 데워진, 모든 구성 요소가 솔루션을 보장하기 위해 이후 와동해야한다. 흰색 부스러기가 있으면, 또 다른 5-10 분 및 와류위한 튜브를 부화. 전사 버퍼가 완전히 용해 완전히 혼합되지 않은 경우 전사 반응은별로 수율을 실패하거나 할 수 있습니다.
  2. 구성 요소를 혼합하고 수조에서 2 시간 동안 37 ° C에서 각각의 반응을 품어.
  3. 반응 TU를 제거수조에서 (들), 그리고 50 μL의 총 부피를 가지고 내가 버퍼 배 DNA 분해 효소, I 효소 DNA 분해 효소의 2 μL의 5 μL, 분자 수준의 증류수 23 μl를 추가하여 각 샘플의 DNA 템플릿을 파괴, 다음 수조에서 20 분 동안 37 ° C에서 각각의 튜브를 품어.
  4. 다음 단계에서 RNA 펠렛의 시각화를 촉진하는 글리코겐 주식의 1 μL 다음, 3 M 아세트산 나트륨, 산도 5.2과 얼음 차가운 100 % 에탄올 110 μL의 5 μl를 추가 한 후 배양하여 각 microcentrifuge 관에서 에탄올 침전을 수행하는 적어도 1 시간 또는 하룻​​밤 -20 ° C에서 튜브.
  5. 원심 분리기 최고 속도 20 분 동안 4 ° C에서 각각의 microcentrifuge 관은, 다음 100 % 에탄올 상층 액을 제거하고 70 %의 얼음 냉 에탄올 100 μL로 교체.
  6. 원심 분리기 5 분 동안 4 ° C에서 각각의 microcentrifuge 관은, 다음 5 분 펠렛을 건조 70 % 에탄올의 상층 액과 공기를 제거하고 마지막으로 미주리의 100 μl를 추가lecular 그레이드 펠렛을 재현 탁하고 nanodrop 분광 광도계를 사용 riboprobe 스톡 농도를 정량화하는 증류수. 참고 : 펠렛 솔루션으로 간 후, riboprobe 재고가 얼음에 보관하고 -20 ° C에서 보관해야합니다.
  7. 예비 혼성화 과정에 대한 고정 된 배아를 준비하기 위해, 각 샘플에서 4 % PFA/1x PBS를 제거하고 1X PBST로 두 번 배아를 씻어.
  8. 각 하나의 평평한 바닥 microcentrifuge 관에 1X PBST에서 25 ~ 40 배아 사이에 전송합니다. 참고 : 배아의 인구 과잉 나중에 고르지 못한 염색으로 이어질 것입니다, 손질이 약 40 배아 각 튜브에 샘플 크기를 제한하기 위해주의해야한다.
  9. HYB +의 500 ~ 1,000 ㎕를 각 튜브에 1X PBST를 교체합니다.
  10. 70 ° C로 설정 오븐에 배아의 관 (들)을 배치하고 예비 혼성화를 수행하기 위해 4 시간 동안이 온도에서 그들을 품어.
  11. riboprobe (digoxygenin 및 / 또는 fluoresc의 100-500 NG를 추가하여 riboprobe / HYB + 솔루션을 준비합니다신선한 HYB + 500 μL에) EIN 표지 한 다음 prewarm에 3.11 단계 이전에 적어도 20 분 동안 70 ° C에서이 솔루션을 품어. 참고 : 단일 및 / 또는 이중 색채 라벨, 이들 유전자에 해당하는 리보 프로브를 각각 riboprobe / HYB + 칵테일로 결합 할 필요를 사용하여 여러 유전자 전 사체를 감지합니다.
  12. 배아의 각 튜브에서 + 예비 혼성화의 HYB을 제거하고 충분한 riboprobe / HYB로 교체 + 배아를 커버 할 수 있습니다. 참고 : 일반적으로, riboprobe / HYB +의 200 ~ 250 ㎕를 하나의 평평한 바닥 microcentrifuge 관에있는 배아를 커버 할 필요가있다. Riboprobe / HYB + 추가 및 제거는 일반적으로 샘플 간의 교차 오염을 방지하기 위해 피펫 및 장벽 팁을 사용하여 수행됩니다.
  13. 밤새 ribroprobe / HYB의 +와 70 ° C에서 배아를 품어.
  14. 70 ° C에서 하룻밤 세척 솔루션과 미리 따뜻하게의 다음 세트를 준비 : 50 SSCT 2 배 SSCT formamide/2x % 및 0.2 배의 SSCT을. 참고 : 50 ml의 알을 준비하는 것이 편리하다초과는 상온에서 저장하고 이후에 나중에 사용하기 위해 재가열 될 수 있기 때문에 각각의 iquots는 솔루션을 씻는다.
  15. -20 ℃ riboprobe / HYB + 펫 및 장벽 팁과 저장소를 사용하여 제거를 주 : 일반적으로 각 riboprobe / HYB + 믹스 신호의 감소없이 여러 번 (예를 들면, 3 개 이상)을 사용할 수있다. 다시 riboprobe / HYB +가 낮은 배경과 연결되어 있지만, 그러나, riboprobe 혼합물은 분해의 대상이 될 수있는 재사용 명심하십시오.
  16. 70 ° C에서 30 분 동안 50 % formamide/2x SSCT로 두 번 배아를 씻으
  17. 70 ° C에서 15 분 동안 2 배 SSCT 한 번 배아를 씻으
  18. 70 ° C에서 30 분 동안 0.2 배의 SSCT 회 배아를 씻으
  19. 0.2 배의 SSCT를 제거하고 실온에서 MABT로 두 번 배아를 씻어.

4. 안티 digoxygenin 항체 배양 및 검출

  1. 신선한 블록 솔루션을 준비합니다.
  2. MABT를 제거하고 블록 솔루션으로 교체기.
  3. 실온에서 2-4 시간 동안 차단 솔루션의 배아를 품어. 참고 : 긴 블록 배양 젊은 제브라 피쉬 배아 단계 (<15 somites)으로 최적의 결과를 제공합니다. 하룻밤 (~ 8 시간까지) 이후 4 ° C에서 배양, 긴 블록의 절차를 수행 상온 또는 상온의 조합에 8 ~ 12 시간 동안 블록 배양을 수행 플러스합니다.
  4. 신선한 블록 솔루션 (예를 들어, 블록의 5 ㎖ 당 1 μL)의 5,000 배 희석함으로써 방지 digoxygenin 항체 솔루션을 준비합니다.
  5. 블록을 제거하고 항체 / 차단 솔루션을 추가합니다.
  6. 포일에서 샘플을 커버하고 4 ° C에서 또는 실온에서 4 시간 동안 밤새 품어.
  7. anti-digoxygenin/block를 제거하고 MABT와 태아에게 적어도 10 번 씻는다. 참고 : MABT 세척을 위해 12 잘 접시에 배아를 전송합니다. 이것은 큰 샘플 수량을 처리 할 때 유용하다 배아 세척 될 수있는 속도를 증가시킨다ND는 쉽게 입체 현미경 하에서 염색 반응 (4.11 단계)의 진행 상황을 모니터 할 수 있습니다. 참고 :이 단계의 배아에서 동안 긴 모니터링을 필요로 높은 배경 나 얼룩을 제공하는 경향이 프로브를위한 유용한 치료입니다, 4.8 단계로 진행하기 전에 4 ° C에서 MABT에서 하룻밤 배양하여 '슈퍼 세척'될 수있다 일을 일한다.
  8. 미리 염색 버퍼와 원하는 염색 용액 (보라색 또는 빨간색 기판)을 준비합니다.
  9. MABT를 제거하고 실온에서 5 분 동안 미리 염색 버퍼에 배아를 씻어.
  10. 미리 염색 버퍼를 제거하고 얼룩 솔루션을 추가합니다.
  11. 실체 현미경에서 배아의 모양을 확인하여 모든 15 ~ 30 분 실온 염색 반응의 진행을 모니터링합니다. 참고 : 염색 반응의 속도는 얼룩의 완성을위한 더 많은 시간을 제공하기 위해 필요한 경우, 4 ° C에 샘플을 전송하여 느려질 수 있습니다. 일단 4 냉각° C 그러나, 반응물을 실온까지 승온에 의해 가속 될 수 없다.
  12. 염색 반응이 완료되면, 염색 액을 제거하고 1X PBST로 교체한다.
  13. 5 분 1X PBST로 두 번 씻으십시오. 참고 : 다른 기판과 다른 유전자를 검출하지 않으면 적어도 20 분 동안 얼음 차가운 4 % PFA/1x PBS에서 샘플을 수정하고 6.1 단계로 진행합니다. 그렇지 않으면 5.1 단계로 진행합니다.

5. 안티 형광 항체 배양 및 검출

  1. 1X PBST를 제거하고 실온에서 15 분마다 0.1 M 글리신, pH를 2.2로 두 번 배아를 씻어. 참고 : 글리신 세척의 시간이 완전히 처음 염색 반응을 비활성화하는 것이 필수적입니다.
  2. 0.1 M 글리신을 제거하고 실온에서 5 분 동안 MABT로 두 번 배아를 씻어.
  3. 신선한 블록 솔루션 (예를 들어, 블록의 5 ㎖ 당 1 μL)의 5,000 배 희석함으로써 방지 형광 항체 솔루션을 준비합니다.
  4. MABT를 제거하고 항체 / 차단 솔루션을 추가합니다. 팔로우는 플루오 레세 인 표지 ribroprobe의 검출을 수행하는 단계를 4.6-4.13. 주 : 최종 염색 반응이 완결 될 때, 샘플의 최종 고정이 차가운 얼음 4 % PFA/1X PBS에서 수행되는 것이 필수적이다. 따뜻한 PFA 솔루션을 고정 플랫 마운트 절차에 대한 해부와 deyolking 동안 배아에서 제거하기가 어렵습니다 스티커 노른자와 관련되는 경향이있다.

6. 배아 해부 및 배아의 초기 Deyolking

  1. 평면 설치를위한 고정, 스테인드 배아를 선택합니다.
  2. 1X PBST를 함유하는 플라스틱 또는 유리 페트리 접시에 배아 선택된 샘플을두고 전송 피펫을 사용한다.
  3. 실체 현미경 접시를 놓고 측면보기를 얻을하고 머리와 꼬리 끝이 가시화되도록 미세 집게 또는 속눈썹 도구의 쌍을 사용하여 배아를 굴립니다.
  4. 일에 절개를 만들기 위해 미세 집게 한 쌍을 사용하여노른자 절개를위한 수단을 제공하기 위해 그 사이에 전자의 머리와 배아의 꼬리 사이의 중앙에 위치한 위치에 노른자와 배아를 개최 미세 집게의 두 번째 쌍을 사용합니다. 참고 : 다른 방법으로, 노른자의 두 가지 주요 절개, 하나의 머리에 가까운 배아의 꼬리에 다른 가까이합니다.
  5. 노른자 세포 공동에서 노른자를 특종 미세 집게 및 / 또는 채찍 도구를 사용합니다.
  6. 길잃은 노른자를 제거하는 1X PBST 부드럽게 배아를 씻어.

배아의 7. 미세 Deyolking

  1. 1X PBST 1 ~ 2 방울과 평면 유리 슬라이드에 배아를 전송합니다.
  2. 부드럽게 복부 (노른자) 측이 유리 슬라이드에 향 태아의 위치를​​ 채찍질 도구 및 미세 집게를 사용합니다.
  3. 배아가 유리 슬라이드에 대하여 평면에서 유지되도록 래시 도구를 사용하여 1X PBST 용액 가장​​자리 배아를 드래그.
  4. 부드럽게 속눈썹을 할 수 사용하여 태아의 복부 표면을 긁어배아를 추출하지 않고 난황 과립을 제거하기 위해 올 일반. 동시에 속눈썹 도구로 긁어 동안 배아를 고정하는 미세 집게의 쌍을 사용합니다. 참고 : 노른자 입자의 제거는 5 ~ 10 분 동안 반복 스크 레이 핑을 요구할 수 있습니다.
  5. PBST 용액을 과량의 노른자위 어지러워 지거나 증발하기 시작하면, 플라스틱이나 유리 전송 피펫을 사용하여 슬라이드에 1X PBST의 1-2 신선한 방울을 추가 한 다음 추가 노른자위 과립의 깨끗한 솔루션 영역으로 배아를 드래그 제거.
  6. 노른자가 만족하게 제거되었을 때, 온화 스트레이 난황 과립을 제거하기 위해 최종 헹굼위한 1x PBST 함유 플라스틱 또는 유리 페트리 접시에 다시 배아를 이동하는 전송 피펫을 사용한다.
  7. 100 % 글리세롤을 함유하는 플라스틱이나 유리 페트리 접시에 플라스틱이나 유리 전송 피펫을 사용 deyolked 배아를 전송합니다.
  8. 배아를 적응하기 위해 ~ 5 분 동안 100 %의 글리세롤의 배아를 품어.

8. 유리 슬라이드에 장착

  1. 100 % 글리세롤의 1 ~ 2 방울의 깨끗한 유리 슬라이드에 deyolked 배아를 전송합니다.
  2. 복부 (노른자) 쪽이 유리 슬라이드를 향 배아를 놓습니다.
  3. 배아는 유리 슬라이드에 대한 평면 위치에 유지되도록 채찍질 도구를 사용하여 글리세롤 방울의 가장자리로 배아를 끕니다. 배아 축이 곡선 인 경우, 태아가 직선 축과 슬라이드에 평평하게 배치 할 수 있도록 미세 집게 부드럽게 긴장을 완화하기 위해 남은 노른자 세포막에 아주 작은 절개를 만들기 위해 사용합니다.
  4. 18 X 18mm 유리 커버 슬립의 네 모서리에 점토의 작은 디 보트를 놓습니다. 참고 : 다른 방법으로, 진공 그리스 (15)의 작은 방울을 만드는 찰흙을 대체 할 수 있습니다.
  5. 시료 주위에서 글리세롤 기포의 발생을 최소화하기 위해 커버 슬립을 구부림, 배아에 천천히 유리 커버 슬립을 배치.
  6. 100 % 글리세롤의 추가 하락을 추가유리 커버 슬립의 측면을 커버 슬립하고 유리 슬라이드 사이의 공간을 채우기 위해.
  7. 단단히 유리 사이의 배아를 놓고 표류 제거하기 위해 커버 슬립의 네 모퉁이에 천천히 조심스럽게 아래로 누릅니다. 참고 : 배아를 분쇄하지 않도록주의하십시오.
  8. 원하는 배아가 배치되어 있지 않은 경우, 커버 슬립을 제거하는 미세 집게를 사용한다. 태아의 위치를​​ 변경할 수 있도록 추가 절개를 만들 수있는 배아 및 / 또는 미세 집게의 위치를​​ 변경하기 위해 채찍 도구를 사용합니다. 반복 8.4-8.7 단계를 반복합니다.
  9. 스테레오 또는 복합 현미경을 사용하여 표본을 관찰 및 / 또는 이미지.
  10. 저장 편평 몇 주 또는 일시적으로 실온에서 4 ° C에서 어둠 속에서 골판지 슬라이드 홀더 평면을 탑재합니다.보기 참고 : WISH 얼룩은 시간이 지남에 따라 점차적으로, 특히 붉은 기판의 반응을 사라질 것이다, 무기한 글리세롤 보존 할 수 없습니다. 글리세롤에 보관하면 자주색 얼룩도에 비해 더 쉽게 퇴색PFA는 (8.11 단계 참조). 흥미롭게도, 오히려 글리세롤보다 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입에 장착 배아 실내 온도 15에 무기한 저장을 가능하게 할 수있는 게시되었습니다.
  11. 퍼플 기판 더러워 샘플의 장기 저장을 위해, 유리 커버 슬립을 제거하고 1X PBST로 두번 세정 배아를 헹군 후 장기간 저장을 위해 4 % PFA/1x PBS로 microcentrifuge 관에 옮긴다. 참고 : 또는 1X PBST의 배아는 유전자형에 대한 DNA 분리와 같은 추가 분석을 위해 처리 할 수​​ 있습니다.

Representative Results

평면형 장착 프로토콜 절차 몸 축 이차원 준비 (도 1a)에, 중앙에 위치한 노른자위 공 감싸되는 정상적인 해부학에서 제브라 피쉬 배아의 변환을 수반한다. 젊은 제브라 피쉬 배아의 전체 마운트 영상은 배아 축이 노른자를 감싸 방법의 특성에 의해 제한됩니다. 그 결과, 전체의 횡 방향 또는 등쪽 전체 스테인드 배아 표본만을 축 또는 애매한 특정 조직 (도 1b)의 일부를 캡처 할 수 마운트. 비교함으로써, 배아의 deyolking 및 평탄화 한 번 (그림 1B)에 시각화 할 수있는 전체 배아 축 수 있습니다. 이러한 제한은 레이블 WISH 스테인드 (13)를 통해 somites 7에 인접 신장 전구 세포의 하위 집합을 표시 (보라색) irx3b을 감지하는 안티센스 리보 프로브로 표지 된 배아 및 myod1 (적색) 검사에 의해 입증 된somites (그림 1B). irx3b + 신장 조상의 필드 irx3b 성적이 좌우 카메라 각도와 시각화 신장 필드가 사실상 불가능하고, 중추 신경계에 풍부하기 때문에 측면보기 마운트 전체에 가려; 필드가 노른자 (그림 1B)를 감싸 때문에 배아 등의 카메라보기로 회전 할 때 더, irx3b + 신장 조상의 분야는 부분적으로 만 볼 수 있습니다. 그러나, 평면 설치 다음과 같은 배아의 지느러미보기 irx3b + 트렁크 및 기타 배아 구조 (그림 1B)를 따라 somites 관련 간단한 방식으로 분석 할 수있는 신장 조상의 전체 필드 수 있습니다. 따라서, 정교한 공간 도메인은 이상적으로이 방법으로 설명 할 수있다.

몇 가지 주요 단계는 평면 마운트 절차의 성공적인 실행에 참여하고 있습니다. 이 techniqu을 수행하려면전자, 노른자 공을 먼저 배아 실체 현미경을 사용하여 시각 동안 같은 미세 집게 한 쌍의 미세한 악기와 함께 할 수있는 적절한 배아 (그림 2A)에서 분리해야합니다. 노른자 공의 원유 제거 후, 미세한 속눈썹 도구는 배아 (그림 2B)에 부착 남아있다 노른자 과립을 쳤어요하기 위해 사용된다. 남은 노른자위 과립의 제거는 배아 조직의 시각화를 용이하게하는 것을 돕는다. 마지막으로, 배아 deyolked는 관측 및 제품 이미징 소프트웨어를 사용하여 샘플의 문서와 현미경에 부착 된 카메라를 가능하게 유리 슬라이드 (도 2c)에 안정적으로 위치 시키도록 조작된다. 속눈썹 도구는 손잡이 원하는 경우 (그림 3A, 재료 테이블)에 장착 할 수있는 순간 접착제를 사용하여 피펫 팁에 적합한 속눈썹을 부착하여 구성 할 수있다 만든 장치입니다. 다른 속눈썹 샘플 생산 조달 할 수있다길이와 각 사용자들이 평면 마운트 절차 실험을 시작하면 서로 다른 선입견을 가질 수있다 테이퍼 (그림 3B)의 측면에서 약간 다른 특성을 가진 도구를 채찍. 채찍 샘플의 예는 자연, 인간의 속눈썹을 흘렸다 자연스럽게 동물 철사 머리카락이나 수염을 흘리다, 그리고 마지막으로 상업적으로 이용 가능한 속눈썹의 합성 품종 소매 화장품 부서에서 찾을 수 있습니다.

주변과 유리 슬라이드 (도 4a)에 위치 샘플 (들)을 함유하는 근거리 고해상도 분석을 위해 이미징 될 수있다. 프로브의 조합은 두 가지 색상 소원을 초기 개발 단계에서 야생형 배아의 신장을 야기 개발 신장 조상 레이블을 한 다음 평면 준비가 샘플 (그림 4B, 4C를 수행 한 마운트에 사용되었다 ). 초기 체절 단계에서, 신장 전구 세포는 일까지 U 자형 패턴 내에서 구분됩니다부수적으로 델타 C (DLC) (빨강) (왼쪽 열, 그림 4B) 6,7을 표현 근축 중배엽 주변 (보라색) pax2a 성적 증명서의 유효 이자율 식입니다. DLC 성적 증명서는 보라색 기판 검출하고, 후뇌 마커 krox20 (빨간색)와 함께 표시되었을 때 이전에 언급 한 바와 같이 비교, 신장 조상의 주동이의 하위 도메인은 DLC (오른쪽 열, 그림 (b))을 표현하는 시각화 된 6,7. 플랫 마운트 준비는 나중에 somitogenesis 단계를 연구하는 유사하게 사용할 수 있습니다. 14 체절 단계에서, 우리는 신장 마커 pax2a, slc4a4 및 somites (그림 4C)를 표시 smyhc1 (빨간색)와 함께 (보라색) slc12a3의 발현을 분석 하였다. 공개하면서이 조합은, pax2a로 전체 신장 전구 도메인의 매핑을 사용하는 주동이의 하위 도메인 EXPR 세포의 하위 집합slc4a4a을 essed 및 slc12a3을 표현 신장 조상의 비 중첩 꼬리 하위 도메인으로 구분 하였다.

두 가지 색의 WISH 플랫 마운트 준비는 작은 분자 6,7의 환경 노출 (그림 5)에서 유전자 변이 또는 다른 동요와 제브라 피쉬의 기관 형성 기간 동안 휴대 도메인의 연구에 가치가있다. 제브라 피쉬의 NLS와 리브 돌연변이는 알데히드 탈수소 효소 1A2 레티노 산 (RA)의 생합성에 필요한 효소를 인코딩 (이전 raldh2로 알려진 aldh1a2,)에 변이를 항구. RA는 사구체 6,7라고도 배아 신장의 혈액 필터를 만들기 위하여 올릴 족 세포 세포의 형성 등 많은 신 세포 유형의 적절한 발달에 필수적이다. WISH는 병용 t의 경계와 wt1a와 족 세포의 전구 세포에 라벨을 실시 하였다그는 야생형 배아 krox20와 smyhc1와 후뇌로 somites을 개발, 돌연변이 배아, 리브 돌연변이 배아 및 ALDH 효소의 화학 억제제, DEAB (그림 5)으로 처리 배아를 NLS. DEAB 처리 된 배아 wt1a 성적 증명서의 폐기 (그림 5, 오른쪽 열)을 보여 주었다 동안 부족한 aldh1a2 식 배아, 야생형의 배아에 비해 감소 wt1a 식을 보여 주었다. 종합하면, 이들 결과는 대표적인 평면 실장 기술은 분석 및 문서 초기 배아의 정밀도 차이를 해부하고, 따라서 귀중한 개발 연구에 구현하는 방법을 보여준다.

그림 1
플랫 마운트 prepa의 그림 1. 개요제브라 피쉬 배아에 대한 배급. 중앙 노른자 질량이 평평한 표면에 제거하고 배아가 안정적으로 배치되어 있기 때문에 A) 평면 설치의 절차는 배아 축을 따라 조직을 동시에 볼 수 있습니다. 전체 마운트의 B) 이미지 측면과 등 부분에 얼룩이 배아를 기원합니다, 다음 평평한 마운트 준비가 수행 된 후. 배아는 irx3b (보라색)과 myod1 (적색) 인코딩 유전자 성적 증명서를 감지하는 안티센스 프로브로 염색했다.

그림 2
그림 2. 제브라 피쉬 배아에 대한 평 마운트 절차의 개략도. A) 배아 제 조잡한 노른자 질량의 대부분을 제거 할 수있다 deyolked 후 (B) 복부 표면 미세 잔존 난황 과립을 제거 deyolked되고,배아를 세척 후 (C)는 시각적 분석 및 / 또는 사진 촬영을위한 유리 슬라이드 등의 측면을 장착합니다.

그림 3
그림 3. 예를 채찍질 도구의 사진이 미세 집게와 비교. A) 제 속눈썹 도구는 뷰의 상단에 제공되는 밀리미터 참조, 참조. B) 미세 집게 옆에 채찍질 도구의 확대 된 뷰를 제공하는 메트릭 자에 인접하여 위치, 미세 집게의 표준 쌍과 함께 몇 군데 있었다 . 두 개의 서로 다른 속눈썹 도구에서 얻은 채찍을 표시하는 데 사용되는 별표 (*)로 도시되어 자연적으로 인간의 속눈썹을 흘리다, 그리고 두 개의 별표 (**)는 자연스럽게 흘려 고양이 수염에서 얻은하고 정돈 된 속눈썹을 표시하는 데 사용 다소 무딘 끝을 확인합니다. 각 캘리포니아에있는SE는, 속눈썹은 피펫 팁을 통해 스레드와 점진적으로 처리 장치에 부착 된 피펫으로 속눈썹을 고정 / 안정 강한 실을 만드는 순간 접착제의 여러 코트에 부착 하였다.

그림 4
야생형 제브라 피쉬 배아의 신장 전구 분야의 발달 변화의 그림 4. 특성. A) (B, C). B) 야생 유형 1에서 배아, 3, 5 체절 단계가주는 신 전구 필드의 구성을 평가하기 위해 두 가지 색상 WISH에 의해 염색에 분석을 위해 몇 군데 지역을 나타내는 회로도를 밀어 배아 신장, 또는 pronephros에 상승. (보라색 염색) 전사 인자 pax2a을 인코딩 (왼쪽 열) 성적 증명서는 신장 P를 포함하여 태아의 여러 집단을 표시중간 중배엽에서 나온다 rogenitor 필드. 노치 리간드 DLC를 인코딩 성적 증명서 (빨간색으로 염색) 근축 중배엽에서 형성 somites을 표시합니다. (보라색 염색) DLC의 성적 표현과 후뇌 rhombomere 마커 krox20 (빨간색으로 염색)이 같은 배아에서 조사하는 경우 (오른쪽 열), DLC 표현 somites에 인접 신장 조상의 주동이의 하위 도메인에서 관찰 할 수있다 14 체절 단계에서 pax2a. C) 야생 형 배아와 DLC의 공동 염색 동안 가려되었다 1-5)을 두 번이나 (보라색 신장 마커의 조합으로 트리플 염색, 체절 마커 smyhc1 (빨강) 와 후뇌 rhombomere 마커 krox20 (또한 빨간색). 이 단계에서 (상단 패널), pax2a 성적은 신장 전구 세포 경계를 구분하는 것을 계속한다. (중간, 낮은 패널) 신장 전구 영토 내에서 주동이의 하위 도메인이 표시됩니다slc4a4slc12a3을 인코딩 성적 증명서에 의해 꼬리 하위 도메인을 표시합니다.

그림 5
(보라색) wt1a의 15 체절 단계에서 그림 5. 유전자 변이 또는 레티노 산의 생합성을 조절하는 화학 물질의 유전 섭동에 의한 표현형의 특성을 평면 장착 준비의 사용. WISH 발현 패턴과 smyhc1/krox20 (빨간색)을 비교 하였다 레티노 산 (RA) 생산의 부족과 야생의 종류와 태아 사이에 의한 알데히드 탈수소 효소 1A2 (NLS리브 돌연변이) 또는 diethylaminobenzaldehyde (DEAB)와 retinaldehyde 탈수소 효소 활성 화학 물질의 억제에 결함. 리브의 RA 생산의 감소는, NLS보다 약간 더 심한리브 배아는 야생 유형의 DEAB 처리를 wt1a 표현의 완전한 폐기와 연결되어있는 동안 유사하게, NLS에게 돌연변이 배아를 개최보다 wt1a 성적 증명서의 약간 감소 염색을 표현하고있다.

Discussion

제브라 피쉬는 최근 몇 년 동안 연구 커뮤니티 전반에 걸쳐 매우 중요한 모델 생물적일 수있다. 제브라 피쉬가 높은 척추 동물의 유전 적 보존의 상당한 정도를 전시하고, 그들의 해부학, 번식 및 수명주기에 관한 장점은 실험 분석이 종은 매우 순종합니다. 더욱이, 제브라 피쉬에 적용 분자 기술의 진보는 더욱 과학적 연구에서이 모델 생물의 사용을 장려하고있다. 예를 들어, 형질 전환 제브라 피쉬 라인의 큰 다양성은 질병의 진행을 연구하고 기관 형성 등의 개발의 핵심 메커니즘을 기초 많은 근본적인 질문에 대답하기 위해 생성되었습니다.

따라서, 질병 및 개발 연구 모두에서 제브라 피쉬의 동적 사용을 기반으로, 세포 라벨링 방법 및 신호 정량 데이터 분석의 중요한 부분입니다. 동안 형광등을 사용 방법tibodies가 형질 전환 지브라 피쉬에서 단백질 발현을 검출하는 데 사용될 수 있으며, 연구자들은 전형적으로 고정 된, 비 - 형질 전환 지브라 피쉬 샘플의 유전자 전 사체의 시공간 현지화를 검사 WISH 12-16 같은 표준 절차에 의존한다. 사실, WISH 생물학 (16)에서 가장 널리 사용되는 방법 중 하나이며, 유전자 돌연변이 및 화학적 유전 섭동의 표현형을 특성화하는 데 사용되는 중요한 도구이다. 그럼에도 불구하고, WISH는 잠재적 인 함정과 도전의 번호와 연결되어 있습니다. 안티센스 ribroprobe의 특이성을 확인하기 위해, 감지 리보 프로브는 안티센스 riboprobe 염색 패턴의 특이성을 평가하기위한 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 섹션 (4, 5)는 라벨 및 플루오 레세 인 표지 프로브이어서 digoxygenin-표지 프로브의 검출 순서로 제시되어 있지만,이 순서는 역전 될 수있다. 일반적으로 약한 신호 (낮은 발현 수준과 유전자) 최고의 digoxygenin 표지 프로브 및이 얼룩 감지탐지 및 레드 기판을 사용하여 강한 신호 (더 풍부하게 표현 된 유전자)의 염색 뒤에 보라색 기판으로 처음 개발. 두 색 반응이 수행하려는 경우, 그것은 라벨 및 기판의 다양한 조합이 데이터 수집 및 분석을위한 가장 적합한 절차를 찾기 위해 검사되는 것이 추천된다. 또한, 시간은 4 ~ 5가 24 시간 게시물 수정 미만의 태아에게 맞는 절에서 제공하는 항체 배양 및 세척을 차단 제공; 이전의 배아와이 동일한 단계의 긴 간격으로 샘플에 소금 축적으로 이어질 수 있습니다. 표준 제브라 피쉬 배아 WISH 문제 해결을위한 광범위한 팁은 이미 문학 12 ~ 16에 기록되어있다. 틀림없이 가장 일반적인 딜레마는 높은 배경이다. 우리는 필요한 경우 하룻밤 MABT '슈퍼 워시'의 추가는 우리의 경험, 생각, 단계 4.7 15-20 세척에 MABT 세척의 수를 증가 추천4.8 단계로 진행하기 전에 10 개 이상의 짧은 MABT 세척과 함께 사용하면 뛰어난 결과를 제공합니다. 또 다른 예를 들어 딜레마 긴 리보 프로브에서 발생할 수있는 불량 프로브 침투입니다. 알칼리 가수 분해를 통해 단계 3.6 다음 riboprobe 전단은 이에 대응 할 수 있습니다. 젊은 샘플 우리의 경험에서, 프로브 전단은 일반적으로 필요하지 않습니다. 그러나, 하나는이 소원 실험의 결과에 영향을주는 요소 수와 같은 매개 변수에 유의해야하고, 우리는 필요에 따라 자신의 소원 실험 매개 변수를 세분화하는 사회에서 이미 공개적으로 사용할 수있는 유용한 문제 해결 지침의 검토를 제안 연구 12.

기존의 WISH 기술 12-16 외에도 WISH 방법론과 공식화 된 다른 프로토콜의 발전의 지속적인 출현이 있었다. 여기에는 fluores의 사용을 통해 같은 신호 검출하는 새로운 방식을 포함cence 17-19, 마이크로 RNA (20)의 국산화를 가능하게 방법에 관한 것이다. 얼룩 (들)이 쉽게 원하는 시점에서 관심의 샘플 내에서 시각화 할 수없는 경우도 있으므로, 현재 셀의 표시 방법에 적용된 많은 개선에도 불구하고, 이러한 절차의 효과는 무효가됩니다. 이 제한은 잠재적으로이 시간에 발생하는 다양한 발달 과정에 대한 우리의 이해의 격차로 이어질 수있는, 그것은 제브라 피쉬의 개체 발생의 초기 배아 단계에 관한 특히 연구자에 대한 문제가있다. 정상적인 제브라 피쉬를 개발하는 동안, 난황은 점진적으로 배아 나이 11로 크기가 감소합니다. 배아가 인접 난황에 비해 크기 때문에 따라서이 나중에 발달 단계 (> 24 시간 게시물 수정)에서, WISH 염색을 분석하는 매우 간단합니다. 그러나,이 (초기 somitogenesis에 꼬리 봉오리 단계로부터 그렇지 않은 경우 배아불투명 난황 가끔 얼룩의 시각화를 모호하게 할 수있는 질량은) 노른자 주위에 위치한다. 결과적으로, 평면 실장의 방법은 (도 1 및도 2에 도식화) 초기 지브라 피쉬 배아 샘플의 특성화와 관련된 영상 및 데이터 분석 문제를 완화하기 위해 고안되었고, 광범위 절연 유전자 변이의 체계적인 표현형 이후 사용되어왔다 첫 번째 큰 규모의 유전 화면 21.

평면 실장 기술의 출현 이후, 초기 발달 단계의 분석은 크게 향상되었다. 노른자는 배아에서 제거되면, 이미지의 원하는 방향으로 유리 슬라이드에 배아 평면을 배치 할 수있다. 이 2 차원 위치는 시료를 회전시킬 필요성을 제거하는, 한번에 전체 배아의 시청을 가능하게한다. 많은 조직은 같은 배아의 광범위한 영역에있는혈액 및 신장을 형성 전구체. 또한, 하나는 한 번에 여러 가지 개발 조직을 비교할 필요가있다. 평면 설치 동시에 휴대 그룹의 전체 도메인을 볼 수, 따라서 크게 같은 조직 또는 세포 카운트에 대한 면적 측정 등 quantifications 도움이 될 수 있습니다 연구원 수 있습니다. 이 기술은 궁극적으로 조혈, 신경 및 기관 형성의 기초가 중요한 발달 다양한 메커니즘에 관한 많은 발견으로 이어질 도움이되었습니다. 따라서, 한 번 마스터, 연구원이 간단한 기술에 대한 응용 프로그램은 매우 충실합니다.

예를 들어, 조혈 동안 계보 선택을 검토 한 연구에서, 평면 14, 18 체절 단계 (SS)에 제브라 피쉬 배아의 준비를 마운트는 사이 PU.1 아연 손가락 전사 인자의 발현 패턴에 발생한 변경 사항을 설명하기 위해 사용 된 야생형과 gata1 모르 폴리 노 배아 (22)를 주입했다.이 방법은 gata1 가장 가능성이 시점 주위 중간 세포괴 (ICM)에 PU.1의 발현을 조절하는 것을 나타내는, 18 SS에서 확장 PU.1 도메인의 검출을 가능하게했다. / - - gtpbp1epsin 등 다양한 적혈구 유전자 스테인드 추가 평면 장착 배아는 gata1했다 VLT 돌연변이 체에서 이러한 유전자의 표현의 손실을 보여 주었다. 또한 분석 biklfGATA 활동에 독립적으로 알려졌다 testhymin 같은 erythoid 유전자의 발현에 변화가 없었다. 따라서, 자신의 다른 실험 결과와 함께, 그것 gata1가 myelo-적혈구 계통 내의 세포의 분화 조절에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 신경 능선 개발의 연구에서, 평면 마운트는 연구 (마피아 M610) 돌연변이 몽 블랑에 crestin 식을 검사하는 데 사용되었다몽블랑과 tfap2a 유전자의 기능 (23)의 역할을 조사. 10, 20 SS에서 crestin 표현은 완전히 머리를 폐지하고, 궁극적으로 몽블랑의 중요성과 tfap2a 규제에 결론이 그룹을 보조, 일반 야생 형 식에 비해 폭도 M610 돌연변이의 트렁크 지역에서 감소 하였다 신경 능선을 형성하는 동안. 또한, 기관 형성의 측면에서, 평면 마운트 pronephros로 알려진 제브라 피쉬 배아 신장의 개발 과정에서 초기 신장 전구 필드에 고유 한 도메인의 존재의 발견을 사용할 수있다. 제브라 피쉬 배아 신장 전구 세포가 pronephros을 구성하는 네프론 기능 단위로 상승을 제공하는 방법을 연구하는 보존 아직 해부학 간단 시스템, nephrogenesis 6,7로 알려진 프로세스 (그림 4)를 제공합니다. 플랫 마운트 분석은 다시의 문서 도메인에 유용했다NAL 조상 이전에 알려지지 않았다 (그림 5), 6,7 패터닝 pronephros 동안 RA 신호의 변화의 결과를 해부하다. 이와 함께, 이러한 예는이 평면 정상적인 발달 및 질병 상태 중에 발생하는 다양한 과정의 연구에 마운트 프로토콜에 대한 많은 다양한 응용 프로그램이 실제로 있다는 것을 시사한다.

개념적으로,이 평면 마운트 절차는 전반적으로 매우 간단하다. 그러나,이 방법을 마스터하는 데 필요한 기교의 조작과 정도는 시각적 데모의 부재에서 마스터에 매우 도전이 될 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 연구자, 더이 기술을 수행하고 조직의 처리를 최적화 할 수있는 시약에 대한 우리의 조언을 공유하는 방법을 이해하는 기회를 제브라 피쉬 모델에 새로운 특히를 사용하도록 컴파일 된. 우리는이 프로토콜은 궁극적으로 지역 사회에서 다른 사람들이 U로 가장 이상적인 샘플 조건을 세분화 할 수 있기를 바랍니다SED 프리미엄 이미징, 데이터 분석 및 출판물에 그 결과를 통신. 궁극적으로,이 실험 결과의 프레 젠 테이션을 모호하게 할 수있는, 초기 배 발생 중에 제브라 피쉬의 해부학 적 방해물을 극복하기 위해 연구를 활성화하고이 간단하지만 중요한 기술의 사용을 통해 이러한를 해결해야합니다.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

이 작품은 부분적으로 다음의 각에서 RAW로 자금에 의해 지원되었다 : NIH 보조금 K01 DK083512, DP2 OD008470 및 R01 DK100237; 5-FY12-75 천 바질 오코너 초보 학술 보조금 수상 # 3 월; 과학 및 생물 과학학과의 노트르담 대학의 대학에서 기금을 시작합니다. 우리는 특히 줄기 세포 연구 육성 노트르담 대학에 관대 한 선물을 부여 전체 갤러거 가족과 함께, 엘리자베스와 마이클 갤러거에게 감사의 말씀을 전합니다. 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 의사 결정, 또는 원고의 준비에 역할을했다. 우리는 그들의 지원을 위해 생명 과학학과의 직원을 감사하고, 우리의 제브라 피쉬 식민지의 보호와 복지에 탁월한 헌신 노트르담 Zebrafish의 연구 센터. 마지막으로, 우리는 것과 같이, 자신의 의견, 토론과이 작품에 대한 통찰력에 대한 우리의 연구 실험실의 구성원을 감사물론 자연적으로 우리의 연구를위한 가장 우수한 채찍 도구를 만들기 위해 고양이 수염을 흘렸다 제공하는 메리 골드 (Maripooka)와 초속 Wingert 등.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 X E3 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.
1 X E3 Dilute 50 X E3 in distilled water.
Mesh tea strainer English Tea Store SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
Embryo incubation dish Falcon 35-1005
Transfer pipette Samco 202, 204
Flat bottom microcentrifuge tube VWR 87003-300; 87003-298
Glass vial Wheaton 225012
1x PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water.
Tween-20 stock American Bioanalytical AB02038
10x PBS American Bioanalytical AB11072
Paraformaldehyde Electron Microscopy Services 19210
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Filter sterilization unit Corning 430516 1 L filter system, 0.45 μm CA
MeOH Sigma 34860-4L
Proteinase K Roche 03-115-879-001 Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C.
HYB+ 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents Roche 11175025910; 11685619910 Refer to manufacturer instructions.
SP6 RNA polymerase Roche 11487671001
T7 RNA polymerase Roche 10881775001
T3 RNA polymerase Roche 11031171001
RNase 1 inhibitor Roche 3335399001
DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer Roche 4716728001
Glycogen Roche 10901393001
Ethanol (EtOH) Sigma E7023 Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C.
Molecular grade distilled water Mediatech 25-055-CM
Waterbath Thermo 51221073 Model 2831
Nanodrop Thermo ND-2000c
Formamide American Bioanalytical AB00600 Store at -20 °C.
20x SSC American Bioanalytical AB13156
MAB 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.
MABT MAB + 0.1% (v/v) Tween-20
Block solution We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).
FCS (fetal calf serum) stock Invitrogen 16140089 Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C.
BSA (bovine serum albumin) stock American Bioanalytical AB00448 Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C.
Anti-digoxigenin antibody Roche 11-093-274-910 Store at 4 °C.
Anti-fluorescein antibody Roche 11-426-338-910 Store at 4 °C.
12-well staining dish BD-Falcon 35-3225
Pre-staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.
Staining solution-purple For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
Staining solution-red For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
NBT stock Sigma N6876 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water.
INT stock Sigma I8377 Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water.
BCIP stock Sigma B8503 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF.
DMF (dimethylformaldehyde) American Bioanalytical AB00450
Glycine Sigma G8898 0.1 M glycine, pH 2.2
Small plastic Petri dish Corning 430589, 430588
Glycerol Sigma G7893
Fine forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55
Lash tool Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other craft modeling clay products can be substituted.
Slide holder Thermo-Fisher 12-587-10 Cardboard tray to store slides flat.
Stereomicroscope Nikon SMZ645, SMZ1000
Compound microscope Nikon 80i, 90i

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References

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