組み合わせたDNA-RNA蛍光

Biology

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Summary

in situハイブリダイゼーション (FISH)、 蛍光は、細胞内でのそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にする。ここでは、マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活性化を研究するために使用することができるFISHによるRNAおよびDNAの合成、同時検出のためのプロトコルを記載している。

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Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

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Abstract

in situハイブリダイゼーション (FISH)、 蛍光は、細胞中の核酸の検出を可能にする分子技術である。 DNAのFISHは、多くの場合、細胞遺伝学および癌の診断に使用され、多くの場合、重要な臨床的意義を有するゲノムの異常を検出することができる。 RNA FISHは、細胞内でRNA分子を検出するために使用することができ、遺伝子発現の調節において重要な洞察を提供した。同じセル内でDNAとRNA FISHを組み合わせることにより、DNAのFISHに適した条件が壊れ、一本鎖RNA分子に対する厳しすぎるかもしれないような、技術的に困難である。ここでは、X染色体にコードされるのXist RNAとDNAの複合、同時検出を可能にし、容易に適用可能なプロトコルを提示する。この結合されたDNA-RNA FISHプロトコルは、おそらくRNAとDNAの両方を検出する必要がある他のシステムに適用することができる。

Introduction

蛍光in situハイブリダイゼーション (FISH)を用いて細胞や組織を研究することは、1、1970年代後半に導入されて以来、細胞内レベルでのクロマチン組織と遺伝子発現、研究者は遺伝子を研究することができました。 DNAのFISHは、しばしば細胞遺伝学、核型2、癌診断3と着床前遺伝子検査4で使用され、それはそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にするので、分子の研究5-6において重要な役割を有している。 RNA FISHによる単一細胞発現解析は、天然の一次転写産物を検出することができるし、非コードRNAは、染色体から転写され、例えばを含む集団レベルでの遺伝子発現を評価する他の技術に利点を提供する定量的RT-PCR、ゲノムワイド発現分析またはノーザンブロッティング。それらの起源部位から直接由来するRNA転写産物を可視化することにより、例えばあった遺伝子発現は7確率的であり、時には8対立遺伝子特異的であることができることに気づいた。技術の改善はあっても、細胞9月11日内の単一mRNA分子の検出および定量を可能にした。

FISHの基本原理は非常に特異的ワトソンとクリックの塩基対形成によって、核酸プローブに細胞内の核酸のハイブリダイゼーションで構成されています。プローブは、顕微鏡的に可視化することができるシグナルを生じる、直接的または間接的に検出することができる。最初の試みは、安全性の問題、制限された空間分解能と時間12月14日に1つだけの標的を検出する能力に基づいて欠点を持っていた放射性標識プローブ、から構成されていた。蛍光色素、ハプテン、および酵素などの非放射性標識のその後の開発は、ルーチン的な分子生物学技術としてFISHの普及使用を可能にした。 FISHプローブは、直接的fluorochで標識することができる核酸の蛍光分子の化学結合によるromes 15及び蛍光標識ヌクレオチドの組込み16-19配列、またはプローブを間接的にコンジュゲートしたハプテン特異的抗体によって(ビオチンおよびジゴキシゲニンを含む)ハプテンの統合およびハプテンの免疫学的検出の後に可視化することができる蛍光レポーターは、20〜21の分子が含まれる。後者のアプローチは、元の信号を増強するために使用される蛍光標識された抗体のいくつかの層を用いてシグナル増幅を可能にし、低レベルで発現されるRNA種の検出を可能にする。直接的および間接的な標識技術および種々のハプテンを組み合わせることによって、いくつかのターゲットが同時に同じ細胞内で可視化することができる。

FISHプロトコルにおける最も重要な工程の一つは、その標的へのプローブのハイブリダイゼーションである。理論的には、プローブは、具体的には、実際には、唯一のその標的へのこの特異的に結合するであろうがプローブは相同領域に結合すること、およびハイブリダイゼーション条件は、常に特定のDNA領域またはRNA種のための理想的ではないでしょう、いつものように、達成されない。それらはFISH手順のストリンジェンシーを増加させることができ、背景雑音の高レベルをもたらすFISHプローブの非特異的結合を防止することができるように、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、したがって、特に重要である。 RNA分子は、一本鎖されると、それらは容易にFISHプローブにハイブリダイズすることができる。対照的に、二本鎖DNA分子は、第一プローブがハイブリダイズすることができ、その後の変性工程を必要とする。これは、通常、DNAの変性をもたらす試料の加熱によって達成される。しかし、これらの過酷な条件下では、壊れやすい、一本鎖RNA分子が失われる可能性があります。したがって、合わせたDNA-RNA FISH条件の有意な最適化を必要とし、唯一のRNAまたはDNAの分離検出と比較して、より技術的に困難である。

ここでは、プレゼン私たちは、雌マウスの胚性幹細胞の22〜24の差別化X染色体の不活性化(XCI)を研究することができました組み合わせて、同時DNA-RNA魚TA詳細なプロトコル。 XCIは、女性の胚発生25のために重要なエピジェネティック機構であり、ヘテロクロマチンをもたらし、ひいては女性の個体では2本のX染色体の1 26〜27のサイレン。このプロセスに不可欠RNF12 22〜23とREX1 24タンパク質によって制御されている非コードRNAはXistの 28〜30は 、ある。Xistの発現は、胚発生中またはin vitroでのES細胞の分化の際に、将来の不活性X染色体(XI)にアップレギュレートになる、およびX染色体に沿って広がり、それによってX染色体31の転写シャットダウンするクロマチンリモデリング酵素を引き付けることができる。このXistの RNAの広がりは、X染色体のコーティングとしてRNA FISHによって可視化することができるいくつものXist雲とも呼ばれる。女性のES細胞は、ゲノム不安定性に起因し、そのX染色体の1を失う可能性がありますので、他は唯一の核型、安定した細胞は、この重要なプロセス22,32の分析で評価していることを確認するために、XCIを研究するために結合するDNA-RNA魚を採用している-34。すべての分子生物学技術と同様に、いくつかの異なるプロトコルが優れた35-38を公開されている。ここでは、プローブのハイブリダイゼーション、透過処理およびその後のプローブの取り込みを可能にするために、マウスES細胞、細胞の固定、ニックトランスレーションによるFISHプローブを標識する、固定された細胞の前処理における分化誘導から始めて、我々の方法を提示ターゲット、そして最終的に蛍光標識した抗体によるプローブの検出。プロトコルは提示され、ここには2日間の期間内のXist RNA及びX染色体の忠実な検出を可能にし、この技術の基本はそうOTに適合させることができる彼女のシステムや研究の分野。

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Protocol

1。女性の胚性幹細胞における分化の誘導X染色体の不活性化を誘導するために

注:(ご要望に応じて入手可能)雌マウスの胚性幹細胞は、マウス胚線維芽細胞(MEFに)でコーティングされたゼラチン化培養皿上で、標準的なES細胞条件下で増殖されています。ここでは、読者は、標準的な細胞培養技術39〜41に精通していることを前提としています。分化を誘導するために、T25皿中で増殖させたES細胞は、MEFのから分離され、分化培地にプレーティングする。

  1. ES細胞培養からES培地を外し、細胞培養、PBSで2回洗浄します。
  2. 1.5ミリリットルのトリプシン-EDTAを(37℃に予め温めておいた)を追加し、7分間37℃で細胞をインキュベートする。 3.5分後、コロニーを分割する優しく料理を振る。
  3. 細胞への分化培地の3.5ミリリットルを追加することにより、トリプシン-EDTAを不活性化する。上下にピペット細胞は、単一細胞溶液を取得し、収集する15mlチューブ中。 200×gで5分間スピンし、分化培地10ml中で細胞を集める。
  4. 非ゼラチン化培養皿に細胞懸濁液を追加し、細胞培養インキュベーター中で1時間インキュベートする。注:ES細胞懸濁液中に残るのに対し、MEFのは、非ゼラチン化培養皿に接着することができるようになります。
  5. 一方で、6ウェルプレートに滅菌したガラスカバースリップ(24×24 mm)を追加し、0.2%ゼラチンを追加し、室温で最小5分間インキュベートする。
  6. 1時間後、主に非接着ES細胞からなるであろうプレめっきES細胞培養物の上清を回収。カバーグラスを含有する6ウェルプレートにプレートES細胞。注:使用⅙6ウェルプレートの6ウェルについてコンフルエントT25皿の 。これはよく分化の3日後にコンフルエントの差別化を可能にする。日常的にメディアを変更します。長い分化タイムコース、細菌皿で分化培地中でプレート事前メッキES細胞、およびincub用細胞培養インキュベーター中に組み込ま細胞シェーカー上で食べた。これは、細胞が1〜2日前固定をカバーグラスにメッキすることができる胚様体を形成することができます。

その後、DNA-RNA FISH分析のための分化したES細胞の2。固定

  1. 分化培養物から分化培地を外し、細胞培養、PBSで2回洗浄します。注:細胞は洗い流されるのを防ぐために慎重にPBSを追加します。
  2. 細胞培養PBSを除去し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/ PBSを加えることによって細胞を固定し、室温で10分間インキュベートする。注意:PFAは毒性があり、吸入する場合や、皮膚や目に接触した時に重大な健康リスクを引き起こす可能性があります。さらに、PFAは発がん性がある。
  3. 4%PFA / PBSを削除し、70%エタノールでカバースリップ3回洗う。注:PFAの痕跡は、後続のFISH手順を妨害するように正しい洗浄が重要です。カバースリップの前にF数カ月間-20℃で70%エタノール中で保存することができるISH解析。

FISH実験のためのDNAプローブの3。の標識

注:目的の遺伝子のDNA断片を得る(RNA FISHのための最小限の長さ> 2キロバイト、またはDNA魚> 20キロバイト)、あるいは目的の遺伝子をカバーするBAC。 RNA検出のために、小さなプローブが最も可能性の高い転写を同時に検出することができる、複数の転写をもたらすので、DNAの検出と比較して十分であることができる。単一コピーDNA鎖上の強い信号は、より長いプローブは、組み込まれたハプテンの十分な数を検出することができるように、必要とされる。好ましくは、非転写ゲノム領域を、DNAプローブを設計するために選択される。 RNAを検出するための小さなプローブを使用する場合に加えて、これは完全に排除できないが、RNAが転写されたゲノム遺伝子座を合わせ、DNA-RNA FISH法で検出されることが防止される。マウスXistのを検出するために、5.5キロバイトのcDNAプローブを用いた。 DET用X染色体のECTION、いくつかのBACプローブを使用することができる。良好な結果がのXist遺伝子のすぐ近くに位置していたBAC RP23-100E1およびBAC CT7-474E4、の混合物で得られている。目的の遺伝子や染色体に応じて、いくつかの異なるプローブが最適な結果を得るために必要とされる場合があります。たびに、滅菌フィルターチップを使用し、RNA-FISHのために使用される材料を扱う、RNA分解酵素フリーのH 2 O、およびクリーンな環境で動作します。

  1. 1μgのDNAを取り、16μlの全容量 H 2 Oに希釈する。ジゴキシゲニンまたはビオチン標識液4μl加え(試薬を参照)、ボルテックスで混和し、90分間16℃でインキュベートする。注:ビオチンまたはジゴキシゲニン標識ヌクレオチドは現在、ニックトランスレーションによって組み込まれます。
  2. 一方、非統合型ヌクレオチドを​​除去するためにG50の列を用意しております。 、2ミリリットルの注射器を取るスタンパーを削除し、シリンジに滅菌綿を追加します。解TにG50ボールを追加O 1分間642×gで15ミリリットルチューブおよび遠心分離器で注射器を配置し、注射器を埋める。注:注射器の約80%が現在、G50で埋めなくてはなりません。少ないG50が存在するときに繰り返します。
  3. 90分後、ニックトランスレーション反応混合物に、H 2 Oを40μLを追加し、G50カラムへの反応を追加します。列の下にある空のチューブを追加し、2分間642×gで遠心する。反応チューブ内を通る流れを集める。
  4. ピペットで通る流れの体積を測定し、総容量200μlに到達するために、H 2 Oを加える。 13.3μlのサケ精子DNA(10 mg / ml)を、13.3μlの酵母tRNA(10 mg / ml)を、26.7μlのマウス用ベッド-1 DNA(1 mg / ml)を28μlの2 MのNaAc、pHを添加することによって通る流れを沈殿させる5.6。ボルテックスで混和し、533μLの氷冷100%エタノールを加える。 4℃で30分間16200×gでチューブ、遠心分離を振る
  5. 上清を除去し、70%エタノールで2回ペレットを洗浄。で5分間16200×gで遠心分離4℃、空気ペレットを乾燥する。 50 +ハイブリダイゼーション溶液の50μlを加えて、溶解を容易にするために30分間37℃でインキュベートする。 NOTE:標識プローブは、-20℃で数年間保存することができる注意:50 +ハイブリダイゼーション溶液は、毒性があり、皮膚、目や呼吸器系を刺激することができ、また、催奇形物質であるホルムアルデヒドが含まれています。

4。透過処理、複合DNA-RNA魚固定した細胞の前処理及びハイブリダイゼーション

  1. 70%エタノールおよび6ウェルプレートに細胞培養PBSの添加を除去することにより、カバースリップ上に固定した細胞を再水和する。 5分間インキュベートします。合計3回繰り返します。
  2. 細胞培養、PBSを外し、6穴プレートに0.2%のペプシンを加え、細胞を透過する。 4分間37℃の水浴中で6ウェルプレートをインキュベートする。ペプシンを削除し、RNA分解酵素フリーのH 2 Oで不活性化する
  3. 室温で5分間、4%PFA / PBSでインキュベートすることにより接尾細胞。 fixati後に上で5分間、細胞培養をPBSで2回洗浄する。
  4. 3分間、3分間、3分間、100%エタノール、90%エタノール、70%エタノールでインキュベートすることによって細胞を脱水する。転送は、6ウェルプレートのうちカバースリップ、数分間空気乾燥したカバースリップ。
  5. 熱板上で1時間65℃でカバースリップをインキュベートすることによって、年齢細胞。
  6. 、分析しようとするすべてのカバースリップのために一緒に追加することにより、マウスCOT-1 DNAとFISHプローブをプレハイブリダイズ50 +ハイブリダイゼーション溶液25μL、0.5μLマウスCOT-1 DNA、ビオチン標識のXistプローブの1μLおよびジゴキシゲニンの1μL X染色体を検出するラベルされたBACプローブ。ボルテックスで混和し、5分間99℃で変性する。プローブ中に存在する配列を繰り返すようにハイブリダイズする簡易ベッド-1 DNAを可能にするために、45分間37℃で直ちにインキュベートする。
  7. 熟成後、スライドガラス上に(SSC/10 10mMのリン酸緩衝液formamide/2x 70%からなる)変性緩衝液50μlをスポットし、細胞がtowarに対向して上にカバースリップを置く変性緩衝DS。 2分間65℃でインキュベートする。
  8. 5分間氷冷70%エタノール中でインキュベートすることによってバック6ウェルプレートにカバースリップ、およびポストフィックスセルを追加する。
  9. 3分間、3分間、3分間、100%エタノール、90%エタノール、70%エタノール中に後続のインキュベーションによって細胞を脱水する。 6ウェルプレートからカバースリップを外し、数分間空気乾燥してみましょう。
  10. スライドガラス上に事前にハイブリダイズしたプローブを見つけ、その上にカバースリップをインキュベートする。場所のSSC formamide/2x 50ミリリットル50パーセントで満たされた加湿チャンバー内にスライドし、37℃で一晩インキュベート

5。ハイブリダイゼーション後の洗浄およびプローブの抗体仲介検出

  1. 2×SSCで6ウェルプレートに充填し、前加温42℃まで一晩のインキュベーションの後にカバースリップを追加し、5分間42℃でインキュベートする。
  2. 2×SSCを取り外し、42℃で10分間50%formamide/2x SSCでカバースリップをインキュベート合計3回(全部で洗浄30分)に繰り返します。 SSC formamide/2x 50%を削除して、室温で2×5分間トリス生理食塩水 - ツイーン(TST)でスライドを洗浄します。
  3. スポット50μlの新しいスライドガラス上カバースリップあたりのトリス - 生理食塩水-BSA(TSBSA)し、TST加湿暗室において室温で30分の間に遮断するための上下を逆にカバースリップをインキュベートする。
  4. 転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。
  5. 新しいガラススライド上にスポットカバースリップあたりのヒツジ抗DIG抗体(TSBSA中1:500)を50μl、およびTST加湿暗室において室温で30分間の最初のインキュベーション工程のためのカバースリップの逆さまをインキュベートする。
  6. 転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。
  7. スポット50ウサギ抗ヒツジ新しいガラススライド上にカバースリップあたりFITC(TSBSA中1:250)と結合した抗体液、およびTST加湿暗室中、室​​温で30分間の第2のインキュベーション工程のために逆さまカバースリップを下にインキュベート。
  8. トランスFERはバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。
  9. スポット50新しいガラススライド上にカバースリップあたりFITC(TSBSA中1:250)と結合したヤギ抗ウサギ抗体液、およびTST加湿暗室中、室​​温で30分間の第三のインキュベーション工程のために逆さまにカバースリップをインキュベートする。 。
  10. 転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。
  11. スポット50の新しいスライドガラス上カバースリップあたりのマウス抗ビオチン抗体の液(TSBSA中1:200)とTST加湿暗室において室温で30分間の第四インキュベーション工程のために逆さまにカバースリップをインキュベートする。
  12. 転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。
  13. スポット50新しいガラススライド上にカバースリップあたりローダミン(TSBSA中1:250)と共役ロバ抗マウス抗体μlの、および逆さまTST加湿暗CHAMB中、室温で30分間の第五のインキュベーション工程のためにカバースリップをインキュベートするER。
  14. 転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。
  15. スポット50の新しいスライドガラス上カバースリップあたりローダミン(TSBSA中1:250)と結合したヤギ抗馬の抗体のμL、およびTST加湿暗室において室温で30分間の第六のインキュベーションステップのために逆さまにカバースリップをインキュベート。 NOTE:ヤギ抗ウマ抗体は、ロバ抗マウス抗体を認識するであろう。とき研究者が利用できる、ヤギ抗ロバ抗体も同様に動作します。
  16. 転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。トリス生理食塩水(TS)でさらに5分間洗浄します。
  17. 3分間、3分間、3分間、100%エタノール、90%エタノール、70%エタノール中に後続のインキュベーションによって細胞を脱水する。 6ウェルプレートからカバースリップを外し、数分間空気乾燥してみましょう。
  18. スライドガラス上に(試薬を参照)DAPIで封入剤のドロップを見つけ、その上に逆さまにカバースリップを追加します。マニキュアでスライドをシールし、蛍光顕微鏡によってFISH結果を評価( 図1)。

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Representative Results

合わせたDNA-RNA FISHのための上述したプロトコルを用いて、我々は、女性の胚性幹細胞を分化におけるX染色体不活性化を可視化することができた。1は、我々 Xistの (あるの両方を検出したDNA-RNA FISH実験の代表例を示す不活性X染色体上のいわゆるのXist RNAの雲とアクティブX染色体上の基礎転写ピンポイント)と、ピンポイント信号として表示されているX染色体の領域として見える。それによってXistの雲が実際に沿って局在化、およびX染色体を被覆していることを示す、ピンポイント信号のいずれかがXistのクラウド内に配置されている。細胞の99%以上では(データは示していない)正しいDNAシグナルを我々のプロトコルを使用して検出する。 RNA-FISHと比較して、Xistの雲が組み合わされ、DNA-RNA FISH法を用いて可視化変性したDNAが大きな面積を占めるように見えるように、時には大きく見える。私たちは、OBを持っているヒトES細胞は、ヒトのリンパ球および様々な種の様々な線維芽細胞株を用いて同様の結果をtained、同様のプロトコルがRnf12を含む様々なX連鎖遺伝子座の遺伝子発現を研究するために適用されている。このプロトコルは、未分化雌ES細胞に適用した場合に加えて、両方のX染色体から基底Xistの発現は低レベルで発現され、また、このプロトコルを使用して遺伝子が(データは示さない)可視化できることを示している、検出することができた。

図1
図1複合DNA-RNA FISH分化雌ES細胞における合わせ DNA-RNA FISHためのプロトコルを、本明細書に記載した後に得られた代表的な結果。 X染色体(XがCHR量)を、FITCにコンジュゲートした抗体を用いて可視化されたジゴキシゲニン標識BACプローブ(緑色の記号を用いて検出されるら)。ほとんどすべての細胞において、2つのX染色体が検出される。 のXist RNAは、ローダミン(赤色信号)に結合する抗体を用いて可視化されたビオチン標識cDNAプローブを用いて検出される。不活性X染色体(Xistの雲 )とアクティブX染色体(Xistのをピンポイント)から基底のXist発現への両方に大きなのXistの蓄積が検出された(注:差別化の際に、この基礎のXistの発現は、今後の積極的なX染色体上に停止したため、検出されないすべての核内で)。核をDAPI(青)で対比されています。スケールバーは10μmで表しています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

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Discussion

DNAの魚に適した条件が少なく、安定したRNA分子のためにあまりにも過酷なように組み合わせたDNA-RNA FISHは、技術的に挑戦することができます。いくつかのアプローチは、DNAおよびRNAの両方を検出するプローブとの同時インキュベーションの必要性を回避し、同じ細胞においてDNA及びRNAの両方を研究するために適用されている。例えば、重畳アプローチにおいて、最初のRNA FISHが行われ、細胞が撮像され、その座標が取られる。その後、同じスライドをRNA FISHの信号が失われている間、DNA FISHのために使用される。 DNA FISH後、細胞を再び撮像して、RNAおよびDNA FISHの両方から得られた画像が重畳される。固定した細胞のDNAは安定しており、初期のRNA FISHのために必要な処置によって影響を受けないように、このアプローチは、ほとんどの場合では使えますが、これは、少なくとも4日間の費用がかかりますが非常に手間のかかるアプローチです。別のアプローチでは、第一のRNA FISHが行われ、RNAのFISH信号はoを添加することによって固定されているDNAのFISHを適用した後のfの固定剤、。また、このアプローチは動作することができますが、RNAの魚から由来の蛍光シグナルの一部が定着時失われる可能性があります。これは、特に低レベルでしか発現している転写物の検出を妨げる可能性があります。本明細書に提示されるアプローチは、単一のFISH実験における1つのRNA標的つDNA標的の両方の同時検出のために最適化し、両方の結果が信頼できる結果を、2日以内に、単一の実験で得ることができるという利点を有している。

FISHプロトコルにおけるいくつかのステップは、最適な結果を得ることが重要である。 RNA分子を扱うときはいつでも、最初に、1が使用され、任意のバッファーまたは溶液中でRNA分解酵素を導入しないように注意する必要があります。このため、クリーンな作業環境を確立すべきである、とペッティング試薬は魚のために使用される際フィルターチップを使用する必要があります。ケアRNAseフリー化合物(例えばRNAseフリー水、細胞培養グレードのPBS、絶対的なを使用するように注意してくださいLY純エタノール )。これらの単純なルールに従っている場合には、使用する試薬に補充された追加のRNアーゼ阻害剤を使用する必要はない。第二に、ペプシンを使用した透過処理手順が少なすぎる、またはあまりにも多くの透過性との間に緩やかな均衡である。使用される特定の細胞型に依存して、透過処理に許される時間、またはペプシン濃度を最適化するために必要とされる場合があります。アクティビティは異なる場合があり、後者はまた、ペプシンのあなたの特定のバッチに依存します。代替として、透過化、特定の条件下で良好な結果で5分間結果の0.1%Triton-X100/PBSを用いて、FISHは、透過化のこの方法を用いる利点は、核または細胞質タンパク質を検出するために免疫染色と組み合わせることができました。 FISHの第三の重要な側面として、老化、変性、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度は一定に保たれるべきである。目標温度から少しでもずれが少なくeffをもたらすことができるicient変性、ハイブリダイゼーション、またはそれ以上のバックグラウンド染色になりますそれほど厳格回の洗浄、。また、2分、5分、80℃での初期変性、65℃での変性、続いて65℃で1時間熟成工程の代替として、老化せずに、良好な結果を与えることができる。一般的にはこの手順は、より信頼性の高いDNAのFISHシグナルを与えるとして、我々は、高齢化の手順を好む。最後に、特定のDNAプローブは、それらが十分な検出のための抗体の三層を必要としないこと、そのように特異的である。これは経験的に、すべての新しく生成されたプローブのためにテストする必要があります。

現在のプロトコルは、X染色体の不活性化およびXistのを検出し、RNAとDNAの複合検出の研究でロバストに動作しますが、他の設定ではより複雑かもしれません。これは、特に、検出されることを目的とするRNA種が非常に低いレベルで発現される場合に可能性があり、反復配列の完全であるか、または比較的短いトランスクリプト。このような状況では、対象の限定された、最適ではない可能額への効率的なハイブリダイゼーションを可能にします最適なプローブを設計することはかなり難しいかもしれません。このような状況では、RNAの魚のための最初の条件を最適化する価値があるかもしれません。いくつかの代替プローブが試すことができ、ニック翻訳によるプローブ標識の持続時間は、組み込まれたハプテンの量を最適化するために、滴定することができる。重要なのは、目的とするRNAは、例えばRT-PCRによる発現を検証することによって、調査される細胞において発現していることを確認すべきである。細胞の異なるタイプを分析する場合にも、これは技術的、FISH関連する問題、または新しいタイプにおける発現の単純な非存在との間の区別を可能にする可能性があるため、以前は、陽性対照として検出された発現が細胞を含むことが必須である細胞を分析した。検証式にもかかわらず、さまざまなプローブおよび標識化条件の最適化の使用は、RNA FISHは、nを行う際に、クリア信号でotの結果は、それが使用されるホルムアミドの量、またはプローブハイブリダイゼーションの持続時間および温度を変えることによって、ハイブリダイゼーション条件を変化させる価値があるかもしれない。代わりに、直接標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、9月10日に使用されるかもしれません。同様の最適化ステップは、その後のDNA FISH、およびDNAおよびRNAの同時検出を改善するために適用することができる。

合わせたDNA-RNA FISHプロトコールを使用して、我々は雌ES細胞を分化におけるX染色体不活性化を研究することができた。同様の結果は、異なる細胞型および胚を用いた我々の研究において得られた、我々は現在、組織切片上で組み合わされたDNA-RNA FISHを適用するための条件を最適化している。多くの生物学的プロセスにおける非コードRNAの重要な役割はますます高く評価となるように、我々は同じプロトコルは、おそらくそれらの特異的クロマチンとの関連で、他の非コーディングRNAを研究するために使用することができることを予見する。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

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References

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